王健鍵，康 凱，易勝中

(湖北省腫瘤醫(yī)院胸外科，湖北 武漢 430071)

CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β(CCAAT/enhancer binding protein β，C/EBP β)是CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白家族中非常重要轉(zhuǎn)錄因子，具有普遍生物學(xué)功能，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化，并參與侵襲、增殖和凋亡等細(xì)胞分子生命活動(dòng)，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程[1]。

肺癌已成為發(fā)病率和死亡率居首位的癌癥，而肺腺癌(lung adenocarcinoma cancer，LAC)是非小細(xì)胞肺癌中最常見(jiàn)的病理類型[2]，具有早期癥狀不典型、發(fā)病隱匿、進(jìn)展迅速的特點(diǎn)，大多數(shù)確診時(shí)都為晚期，導(dǎo)致此病的預(yù)后、生存率偏低。從分子水平研究肺腺癌的發(fā)病機(jī)制具有重要意義，隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，從分子水平介入，又能為提高肺腺癌診療提供很好的思路[3]。

1 材料與方法

1.1 材料

肺腺癌A549細(xì)胞株自購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院(上海)細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清(FBS)、DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司。轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000購(gòu)自Invitrogen公司。Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Corning公司。Matrigel基質(zhì)膠為BD公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將肺腺癌A549細(xì)胞株放置在37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)液選用含10%FBS和100×雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組

當(dāng)肺腺癌A549細(xì)胞匯合度達(dá)到50%左右時(shí)，開(kāi)始進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染。將C/EBP β siRNA、siRNA control按lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書操作。轉(zhuǎn)染后收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Western blot檢測(cè)C/EBP β的沉默效率。轉(zhuǎn)染C/EBP β siRNA的肺腺癌A549細(xì)胞記為C/EBP β-siRNA組，轉(zhuǎn)染siRNA control后的肺腺癌A549細(xì)胞記control-siRNA組[4-5]。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C/EBP β siRNA干擾細(xì)胞、siRNA control細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL后，接種在96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)后分別于24h、48h、72h后取樣。每孔加入20μL濃度為5mg/mL的MTT，37℃培養(yǎng)4h后，再加入150μL的二甲基亞砜。低速震蕩至溶解，在波長(zhǎng)570nm下用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(OD值)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)6次，計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率，結(jié)果以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示[6-7]。

1.2.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C/EBP β siRNA細(xì)胞和control siRNA細(xì)胞，消化離心，除去上清液，再用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次。取1000個(gè)細(xì)胞接種在6孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)7d后終止培養(yǎng)。收板，用95%的乙醇固定后，再用0.1%的結(jié)晶紫染色，然后在顯微鏡下計(jì)算陽(yáng)性克隆數(shù)(大于50個(gè)細(xì)胞的克隆被認(rèn)定為陽(yáng)性克隆)。計(jì)算克隆形成率(%)=陽(yáng)性克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞總數(shù)×100%[8-9]。

1.2.5 Transwell檢測(cè)遷移能力

在Transwell下室加入含 20% FBS的培養(yǎng)基650μL，Transwell上室加入細(xì)胞懸液100μL，細(xì)胞含量約為2×105個(gè)，放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。將Transwell小室放置在4%多聚甲醛溶液中，室溫下固定20min后，用0.1%的結(jié)晶紫染色10min，再用棉簽輕擦去小室內(nèi)的細(xì)胞，PBS液清洗3次，每次洗5min左右。然后將小室風(fēng)干，在顯微鏡下取6個(gè)視野并記錄每個(gè)視野下的細(xì)胞數(shù)量，取平均值，結(jié)果用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。

1.2.6 Transwell檢測(cè)侵襲能力

先將matrigel基質(zhì)膠從-20℃冰箱中取出，放在4℃冰箱中冷藏解凍，按照1∶8的比例用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋matrigel基質(zhì)膠。在每個(gè)小室加入稀釋后基質(zhì)膠45μL，在37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中放置30min，待基質(zhì)膠凝固后，再按照遷移能力的步驟開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)，記錄并計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，所得數(shù)據(jù)即為細(xì)胞侵襲數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

用MTT法檢測(cè)肺腺癌A549細(xì)胞增殖能力，作用72h后，C/EBP β-siRNA組抑制肺腺癌A549細(xì)胞增殖能力較control-siRNA組有顯著性差異(P<0.01)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 C/EBP β-siRNA抑制A549的增殖能力(n=3)

2.2 沉默C/EBP β抑制A549細(xì)胞平板克隆形成能力

在平板克隆形成實(shí)驗(yàn)中，與control-siRNA組相比，C/EBP β-siRNA組細(xì)胞克隆形成率顯著降低(P<0.01)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 沉默C/EBP β抑制A549平板克隆形成能力(n=3)

2.3 沉默C/EBP β對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞遷移能力的影響

Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3(封三)，兩組數(shù)據(jù)差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。由此可見(jiàn)，沉默C/EBP β-siRNA組細(xì)胞遷移能力明顯弱于control-siRNA組。

2.4 沉默C/EBP β對(duì)肺腺癌 A549 細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4(封三)，兩組數(shù)據(jù)差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。由此可見(jiàn)，沉默C/EBP β-siRNA組細(xì)胞侵襲能力明顯弱于control-siRNA組(P<0.01)。

3 討 論

肺腺癌是非小細(xì)胞肺癌中占比較多的病理類型，患病率較高，且容易發(fā)生轉(zhuǎn)移、局部浸潤(rùn)，臨床以手術(shù)、放療、化療為主要治療方法。目前對(duì)肺腺癌的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，在早期存在一定的隱匿性，缺少具有特異性、敏感性的診斷指標(biāo)，同時(shí)早期肺腺癌無(wú)特異性癥狀，患者很容易錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)，在確診時(shí)往往已到晚期[10]，5年總生存率僅有不到20%[11]。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的不斷發(fā)展，選擇可靠的分子靶點(diǎn)，從分子層面研究肺腺癌進(jìn)展機(jī)制，盡可能在早期抑制肺腺癌的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，對(duì)臨床早期診斷、治療肺腺癌提供有效的方法有著重要的臨床意義。

腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，且增殖速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)正常細(xì)胞。MTT法通過(guò)活細(xì)胞染色及個(gè)性化篩選可以檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)和存活，有效檢測(cè)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的敏感性，且檢測(cè)結(jié)果與臨床療效相吻合。利用MTT檢測(cè)肺腺癌A549細(xì)胞增殖能力可以為臨床判斷肺腺癌預(yù)后及藥物反應(yīng)提供一定的數(shù)據(jù)支撐[12]。單個(gè)細(xì)胞通過(guò)有絲分裂形成的細(xì)胞群體即為細(xì)胞克隆，克隆形成的大小和多少在一定程度上反映了腫瘤細(xì)胞的增殖能力[6]。腫瘤死亡率高的主要原因包括腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，而腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲又是發(fā)生轉(zhuǎn)移的前提，同時(shí)也受多種調(diào)控機(jī)制影響[3]。

C/EBP β是堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，具有普遍生物學(xué)功能，參與細(xì)胞侵襲、增殖、凋亡等細(xì)胞分子事件，可影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程[1]。越來(lái)越多的研究證實(shí)C/EBP β在惡性腫瘤生物學(xué)行為中起致瘤性作用，但是在肺癌，尤其是肺腺癌中的作用還未完全闡明。

C/EBP β的表達(dá)失調(diào)與腫瘤惡化程度密切相關(guān)[1]。本研究通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析C/EBP β對(duì)肺腺癌 A549細(xì)胞增殖、平板克隆形成、遷移、侵襲的影響，不難發(fā)現(xiàn)，沉默C/EBP β對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞有明顯的抑制作用，我們的研究結(jié)果提示C/EBP β可輔助診斷早期肺腺癌，并可作為肺腺癌患者的預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)，為臨床肺腺癌診治、預(yù)后提供參考，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步探索。