魏 濤，馮連杰，付小娜，趙世杰，劉偉鵬，梁 豪

(安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院放療三科，河南 安陽(yáng) 455000)

乳腺癌是全球女性發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一，隨著腫瘤手術(shù)、放化療、分子治療等進(jìn)展，乳腺癌總體預(yù)后仍不太理想[1]。目前乳腺癌的復(fù)雜分子機(jī)制尚未完全清楚，而癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移是影響其預(yù)后的重要因素[2-3]。因此，探索乳腺癌增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對(duì)乳腺癌治療十分重要。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)NEAT1是一種新型癌癥相關(guān)lncRNA，研究表明[4-6]，NEAT1在乳腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，參與腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡等進(jìn)展過(guò)程。miR-206是一種腫瘤抑制microRNA(miRNA)，研究表明[7-9]，miR-206具有抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。然而，目前NEAT1和miR-206在乳腺癌中的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。我們通過(guò)生物信息學(xué)軟件分析預(yù)測(cè)NEAT1可能靶向miR-206，推測(cè)NEAT1對(duì)乳腺癌細(xì)胞的調(diào)控作用可能與靶向調(diào)節(jié)miR-206表達(dá)有關(guān)。因此，本研究以乳腺癌MCF-7細(xì)胞為研究對(duì)象，探討NEAT1靶向miR-206影響乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和人乳腺上皮細(xì)胞系HBL-100由中科院上海細(xì)胞庫(kù)提供。

胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基和胰酶購(gòu)自Gibco公司；Trizol試劑和Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司；康寧Transwell小室購(gòu)自北京萌壯科技有限公司(濾膜直徑6.5mm，濾膜孔徑8.0μm)；Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自BD公司；MTT溶液、結(jié)晶紫溶液和RIPA裂解液購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；鼠抗人MMP-2抗體、鼠抗人MMP-9抗體、β-actin抗體、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗購(gòu)自上海艾博抗貿(mào)易有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用所有載體均在上?；鶢栴D生物科技有限公司構(gòu)建。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將MCF-7細(xì)胞和HBL-100細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至90%左右，用0.25%胰酶消化，進(jìn)行傳代。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，接種于96孔板，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至40%～50%，隨機(jī)將細(xì)胞分組，使用Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染試劑將si-con、si-NEAT1、pcDNA、pcDNA-NEAT1、miR-con、miR-206-inhibit轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，并分別記為si-con組、si-NEAT1組、pcDNA組、pcDNA-NEAT1組、si-NEAT1+miR-con(共轉(zhuǎn)染si-NEAT1和miR-con)、si-NEAT1+miR-206(共轉(zhuǎn)染si-NEAT1和miR-206-inhibit)，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，轉(zhuǎn)染24h后觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中NEAT1和miR-206表達(dá)

收集細(xì)胞，按照Trizol試劑說(shuō)明書提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的A260/A280值并進(jìn)行定量，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行qPCR檢測(cè)NEAT1和miR-206表達(dá)水平。NEAT1上游引物序列：5’-TGGCTAGCTCAGGGCTTCAG-3’，下游引物序列：5’-TCTCCTTGCCAAGCTTCCTTC-3’。miR-206上游引物序列：5’-CAGATCCGATTGGAATGTAAGG-3’，下游引物序列：5’-TATGCTTGTTCTCGTCTC TGTGTC-3’。GAPDH和U6為內(nèi)參基因，GAPDH上游引物序列：5’-AAGGCTGTGGG CAAGGTCATC-3’，下游引物序列：5’-GCGTCAAAGGTGGAGGAGTGG-3’。U6上游引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列：5’-AACGCTTCACGAAT TTGCGT-3’。qPCR程序：95℃，30s；94℃，5s，60℃/58℃，20s，72℃，20s，共40個(gè)循環(huán)。

根據(jù)2017年1~6月的問(wèn)卷調(diào)查結(jié)果顯示,獻(xiàn)血者在獻(xiàn)血前、獻(xiàn)血中、獻(xiàn)血后對(duì)于采血護(hù)理的滿意程度分別為99.00%、99.28%以及97.84%。而根據(jù)2016年7~12月的問(wèn)卷調(diào)查結(jié)果,獻(xiàn)血者在獻(xiàn)血前、獻(xiàn)血中、獻(xiàn)血后對(duì)于采血護(hù)理的滿意程度分別為98.79%、99.24%以及98.46%。我站在實(shí)施采血護(hù)理風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和控制后,獻(xiàn)血者對(duì)于采血護(hù)理的整體滿意有了顯著的提升,見(jiàn)于表1

1.2.4 MTT法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞增殖

轉(zhuǎn)染24h后，更換細(xì)胞培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，接種于96孔板，分別于培養(yǎng)24、48、72h時(shí)，加入MTT溶液(5mg/mL)20μL/孔，37℃下孵育4h后，棄培養(yǎng)液，加入二甲亞砜150μL/孔，低速震蕩反應(yīng)10min。酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔490nm波長(zhǎng)處吸光度(A)值，觀察細(xì)胞增殖情況。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞遷移

細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，更換細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h，胰酶消化收集細(xì)胞，重懸并調(diào)整細(xì)胞密度為2×108個(gè)/mL。取100μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，另在Transwell小室的下室加入600μL含10%血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24h。吸除上室上層液體，加入適量甲醇室溫固定30min，吸除甲醇，加入0.1%結(jié)晶紫染色液染色20min，PBS溶液沖洗3次，用無(wú)菌棉棒輕輕擦除上室表面細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察并隨機(jī)選取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞遷移數(shù)目。

1.2.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞侵襲

將60μL Matrigel基質(zhì)膠加入300μL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中混勻，取100μL混合液平鋪于Transwell小室的下室，另取100μL Matrigel基質(zhì)膠平鋪于上室。取50μL細(xì)胞懸液接種于Transwell小室的上室，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24h。倒掉上室培養(yǎng)液，加入適量5%戊二醛，4℃下固定15min，PBS溶液沖洗3次。用無(wú)菌棉簽輕輕擦除上室表面細(xì)胞，然后加入0.1%結(jié)晶紫溶液室溫染色10min，PBS溶液沖洗3次，顯微鏡下觀察并隨機(jī)選擇5個(gè)視野拍照，計(jì)算侵襲細(xì)胞數(shù)目。

1.2.7 Western blot檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞中MMP-2和MMP-9表達(dá)

1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

生物信息學(xué)軟件TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/.)預(yù)測(cè)NEAT1靶向miR-206。本實(shí)驗(yàn)為驗(yàn)證NEAT1是否靶向miR-206，將NEAT1的3’ΜTR區(qū)和突變的3’ΜTR區(qū)構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告載體，與miR-206共轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24h后，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌細(xì)胞中NEAT1和miR-206的表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果顯示，與人乳腺上皮細(xì)胞HBL-100比較，乳腺癌細(xì)胞MCF-7中NEAT1表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，miR-206表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2 NEAT1靶向miR-206

雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-206的乳腺癌細(xì)胞中NEAT1的活性明顯受到抑制，而將NEAT1的3’ΜTR突變后，miR-206的抑制作用消失，證實(shí)NEAT1靶向miR-206(見(jiàn)圖2A、B)；RT-qPCR結(jié)果表明，與si-con組比較，si-NEAT1組細(xì)胞中miR-206表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；與pcDNA組比較，pcDNA-NEAT1組細(xì)胞中miR-206表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。說(shuō)明敲減NEAT1可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞中miR-206表達(dá)，而過(guò)表達(dá)NEAT1則抑制乳腺癌細(xì)胞中miR-206表達(dá)(見(jiàn)圖2C)。

2.3 敲減NEAT1和抑制miR-206表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞培養(yǎng)72h時(shí)，與si-con組比較，si-NEAT1組乳腺癌細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制(P<0.05)；與si-NEAT1+miR-con組比較，si-NEAT1+miR-206組乳腺癌細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)(P<0.05)。說(shuō)明敲減NEAT1可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，而敲減NEAT1的同時(shí)抑制miR-206表達(dá)，則可逆轉(zhuǎn)敲減NEAT1對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。見(jiàn)圖3。

(*P<0.05；#P<0.05)

2.4 敲減NEAT1和抑制miR-206表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

與si-con組比較，si-NEAT1組乳腺癌細(xì)胞遷移數(shù)目和侵襲數(shù)目明顯減少(P<0.05)；與si-NEAT1+miR-con組比較，si-NEAT1+miR-206組乳腺癌細(xì)胞遷移數(shù)目和侵襲數(shù)目明顯增多(P<0.05)。說(shuō)明敲減NEAT1可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲，而敲減NEAT1的同時(shí)抑制miR-206表達(dá)，則可逆轉(zhuǎn)敲減NEAT1對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用。見(jiàn)圖4(封三)。

2.5 敲減NEAT1和抑制miR-206表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移蛋白的影響

與si-con組比較，si-NEAT1組乳腺癌細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05)；與si-NEAT1+miR-con組比較，si-NEAT1+miR-206組乳腺癌細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)明顯增多(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

A.Western blot檢測(cè)細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)；B.各組細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平比較(與si-con組比較，*P<0.05；與si-NEAT1+miR-con組比較，#P<0.05)

3 討 論

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是人類轉(zhuǎn)錄組的重要組成部分，其自身并不編碼蛋白的RNA，而是以RNA的形式在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等層面上調(diào)控基因表達(dá)[10]。近年來(lái)，lncRNAs被報(bào)道在多種癌癥中異常表達(dá)，涉及癌癥發(fā)生發(fā)展中的多種生物學(xué)過(guò)程，已成為腫瘤潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[11]。如Lu等[12]報(bào)道，lncRNA CAMTA1通過(guò)靶向miR-20b促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖和遷移。Sun等[13]報(bào)道，lncRNA MEG3在乳腺癌中下調(diào)，并通過(guò)P53蛋白活性調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，提示lncRNA在乳腺癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

NEAT1由多發(fā)性內(nèi)分泌瘤Ⅰ型位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄而來(lái)，位于人類第11號(hào)染色體上，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)的一種lncRNA[14-15]。MMP家族是一類依賴于Ca2+、Zn2+等金屬離子的蛋白水解酶，主要作用是降解各種細(xì)胞外基質(zhì)成分，其成員MMP-2和MMP-9被認(rèn)為與乳腺癌遷移和侵襲密切相關(guān)[16]。本研究結(jié)果，NEAT1在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，敲減NEAT1可抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，并抑制細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)，說(shuō)明NEAT1高表達(dá)與乳腺癌進(jìn)展密切相關(guān)。Zhang等[17]報(bào)道，NEAT1通過(guò)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化參與乳腺癌進(jìn)展過(guò)程；Li等[18]報(bào)道，NEAT1通過(guò)調(diào)控miR-211和HMGA2表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲。提示NEAT1在調(diào)控乳腺癌進(jìn)展中的具有多種潛在作用途徑。

miR-206是最早發(fā)現(xiàn)的在乳腺癌中發(fā)揮抗癌作用的miRNA[19-20]。Lehmann等[21]報(bào)道，miR-206與乳腺癌組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、腫瘤大小密切相關(guān)，是乳腺癌診斷和預(yù)后評(píng)估的潛在分子標(biāo)志物。Liang等[22]報(bào)道，miR-206在三陰性乳腺癌組織中表達(dá)下調(diào)，與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，提示miR-206表達(dá)水平與三陰性乳腺癌侵襲和血管生成有關(guān)。研究報(bào)道[23-25]，過(guò)表達(dá)miR-206可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果，與人乳腺上皮細(xì)胞相比，乳腺癌細(xì)胞中miR-206表達(dá)明顯下調(diào)。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，證實(shí)在乳腺癌細(xì)胞中NEAT1靶向負(fù)調(diào)控miR-206的表達(dá)。為進(jìn)一步驗(yàn)證敲減NEAT1對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用與調(diào)控miR-206表達(dá)有關(guān)，本研究在乳腺癌細(xì)胞中同時(shí)敲減NEAT1和抑制miR-206，結(jié)果與單獨(dú)敲減NEAT1相比，乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用消失，說(shuō)明敲減NEAT1可能通過(guò)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞中miR-206表達(dá)發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用。

綜上所述，NEAT1在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，敲減NEAT1可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，其作用機(jī)制可能與上調(diào)miR-206表達(dá)有關(guān)。本研究為乳腺癌靶向治療提供了新思路和新靶點(diǎn)。