李云成，饒佳薇，孟凡冰*，劉達(dá)玉，陳衛(wèi)軍，肖曉

(1.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，成都 610106；2.肉類加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610106)

兔肉富含多種不飽和脂肪酸、維生素、礦物質(zhì)，具有高蛋白、低脂肪、低膽固醇的特點(diǎn)[1-2]。自古以來(lái)兔肉就受到人們的喜愛(ài)，早在北宋年間，詩(shī)人蘇東坡便賦詩(shī)“兔肉處處有之，為食品之上味”，以表達(dá)他對(duì)兔肉的贊美和追捧[3]。我國(guó)對(duì)兔肉的消費(fèi)具有區(qū)域性，主要集中在四川、重慶、廣東和福建等地，尤其是四川地區(qū)，其兔肉消費(fèi)量約占全國(guó)的50%[4]。我國(guó)兔肉市場(chǎng)有極大的開發(fā)前景[5]。目前，兔肉的相關(guān)研究主要集中在營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、風(fēng)味分析等方面，不同的加工處理對(duì)兔肉品質(zhì)及風(fēng)味的影響差異尚缺乏系統(tǒng)的分析。

鑒于此，本研究以煮制、酶解后煮制、高壓煮制和烤制4種加工方式對(duì)兔肉進(jìn)行加工，探討不同加工方式對(duì)兔肉質(zhì)構(gòu)特性、游離氨基酸、風(fēng)味物質(zhì)種類及含量的影響差異，相關(guān)研究為兔肉加工方式的選擇提供了一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮兔肉胴體(伊拉兔)：購(gòu)于成都市沙西農(nóng)副產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)；2,4,6-三甲基吡啶(TMP)標(biāo)準(zhǔn)品：上海麥克林生化科技有限公司；木瓜蛋白酶、水合茚三酮、氯化亞錫、亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司；磷酸緩沖液：生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

TA-XT-PlusC質(zhì)構(gòu)儀 廈門超技儀器設(shè)備有限公司；7890B-5977A型氣質(zhì)聯(lián)用儀、PAL RSI 85 CTC多功能自動(dòng)進(jìn)樣器(含SPME進(jìn)樣器)、HP-5MS UI 色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm) 美國(guó)Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭 美國(guó)Suplelco公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

取兔肉大腿肌肉均分成4份，每份100 g，分別用4種不同的加工方法進(jìn)行處理，即煮制、酶解后煮制、高壓煮制、烤制，具體加工方式和條件如下[6]：

煮制：稱取70 g兔肉加入超純水1000 mL，煮制30 min，煮制后將兔肉分為兩份：一份做絞碎處理，一份切成2 cm×2 cm×1 cm的方塊。稱取30 g兔肉加入超純水300 mL，煮制30 min，煮制后加入超純水定容至300 mL，收集試液。

酶解后煮制：稱取70 g兔肉，加入300 U/g木瓜蛋白酶，酶解溫度45 ℃，酶解時(shí)間60 min，酶解后加入超純水1000 mL，煮制30 min，將兔肉分為兩份：一份做絞碎處理，一份切成2 cm×2 cm×1 cm的方塊。稱取30 g兔肉加入超純水300 mL，煮制30 min，煮制后加入超純水定容至300 mL，收集試液。

高壓煮制：稱取70 g兔肉，加入超純水1000 mL，用高壓鍋壓制15 min，將兔肉分為兩份：一份做絞碎處理，一份切成2 cm×2 cm×1 cm的方塊。稱取30 g兔肉，加入超純水300 mL，用高壓鍋壓制15 min，高壓煮制后加入超純水定容至300 mL，收集試液。

烤制：稱取70 g兔肉，烤箱預(yù)熱200 ℃，180 ℃烤制50 min，將兔肉分為兩份：一份做絞碎處理，一份切成2 cm×2 cm×1 cm的方塊。稱取30 g兔肉，烤箱預(yù)熱200 ℃，180 ℃烤制50 min，烤制后將肉塊置于沸水浴中30 min，水浴后加入超純水定容至300 mL，收集試液。

1.3.2 游離氨基酸檢測(cè)

測(cè)定：準(zhǔn)確吸取試液1 mL，注入25 mL比色管中，加0.5 mL pH 8.0磷酸鹽緩沖液和0.5 mL 2%茚三酮溶液，在沸水浴中加熱15 min。待冷卻后加水定容至25 mL。放置10 min后，用5 mm比色杯在570 nm處以試劑空白溶液作參比測(cè)定吸光度(A)。

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別吸取1 mL亮氨酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作液于一組25 mL比色管中，各加pH 8.0磷酸鹽緩沖液0.5 mL和2%茚三酮溶液0.5 mL，在沸水浴中加熱15 min，冷卻后加水定容至25 mL，按上述操作測(cè)定吸光度(A)。將測(cè)得的吸光度與對(duì)應(yīng)的亮氨酸濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。游離氨基酸的計(jì)算公式[7]如下：

式中：C為根據(jù)測(cè)定的吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的亮氨酸的毫克數(shù)，mg；V1為試液總量，mL；V2為測(cè)定用試液量，mL；m為試樣用量，g；w為試樣干物質(zhì)含量，%。

1.3.3 質(zhì)構(gòu)特性分析

參考文獻(xiàn)[8]的方法，應(yīng)用TA-XT-PlusC質(zhì)構(gòu)分析儀，通過(guò)Exponent軟件控制。測(cè)定方法：應(yīng)用TPA模式；測(cè)定參數(shù)：目標(biāo)形變50%；觸發(fā)點(diǎn)負(fù)載5 g；測(cè)試速率1 mm/s； 返回速率1 mm/s；循環(huán)次數(shù)2次；探頭：P36R。

1.3.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定

取3 g粉碎后的樣品于15 mL頂空瓶中密封，加入內(nèi)標(biāo)2 μg/mL 2,4,6-三甲基吡啶1 μL，設(shè)置CTC自動(dòng)進(jìn)樣器對(duì)樣品的前處理?xiàng)l件：加熱箱溫度75 ℃，加熱時(shí)間45 min，樣品抽取時(shí)間20 min，解吸時(shí)間5 min。

色譜條件：HP-5MS UI 色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；壓力32.0 kPa；流速 1.0 mL/min；載氣為He，不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度 250 ℃；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持1 min，以3 ℃/min升至 85 ℃，保持3 min，再以3 ℃/min升至105 ℃，保持2 min，再以12 ℃/min升至165 ℃，再以10 ℃/min 升至230 ℃。

質(zhì)譜條件：電子電離源(EI)；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃；檢測(cè)器電壓350 V；質(zhì)量掃描范圍(m/z)：40～500。

定性：對(duì)化合物進(jìn)行分析時(shí)，將得到的數(shù)據(jù)在儀器的NIST 14.L譜庫(kù)中進(jìn)行檢索和匹配，選擇匹配度大于80%的物質(zhì)。

定量：各揮發(fā)性風(fēng)味成分的絕對(duì)含量根據(jù)其在總離子圖的峰面積與內(nèi)標(biāo)的峰面積進(jìn)行比較，結(jié)果以“μg/kg”的形式表示絕對(duì)含量；各揮發(fā)性風(fēng)味成分的相對(duì)含量以其絕對(duì)含量占揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的總量百分?jǐn)?shù)計(jì)算。

1.3.5 關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)評(píng)價(jià)

采用OAV法[9](氣味活度值)對(duì)檢測(cè)出的風(fēng)味成分進(jìn)行評(píng)價(jià)，確定關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，OAV 值的計(jì)算方法如下：

式中：OAVi為待測(cè)物的氣味活度值；ρi為待測(cè)物的質(zhì)量濃度，μg/kg；ρT為待測(cè)物的感覺(jué)閾值質(zhì)量濃度，μg/kg；當(dāng)OAVi≥1時(shí)，認(rèn)為該物質(zhì)對(duì)總體風(fēng)味有顯著貢獻(xiàn)。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

采用 Microsoft Excel 2019 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同加工方式下兔肉的質(zhì)構(gòu)特性

對(duì)不同加工方式下處理的兔肉進(jìn)行質(zhì)構(gòu)檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同加工方式下兔肉的質(zhì)構(gòu)特性Table 1 The texture characteristics of rabbit meat by different processing methods

由表1可知，4種加工方式的兔肉中，烤箱烤制的兔肉硬度最高，為(16879.62±794.14) g，高壓煮制的兔肉硬度最低，為(6280.46±281.31) g。煮制的兔肉彈性最高，為(0.64±0.02) mm，高壓煮制的兔肉彈性最低，為(0.54±0.06) mm。

4種加工方式的內(nèi)聚性差別不大，酶解后煮制的兔肉黏性最高，為(8645.85±528.89) g，高壓煮制的兔肉黏性最低，為(3166.64±455.25) g。酶解后煮制的兔肉咀嚼度最高，為(5133.43±72) g，高壓煮制的兔肉咀嚼度最低，為(1701.12±336.76) g。烤箱烤制的兔肉回復(fù)性最大，為(0.2±0.03) mJ，高壓煮制的兔肉回復(fù)性最小，為(0.14±0.02) mJ。綜上，高壓煮制的兔肉硬度低，彈性低，咀嚼度低，口感較軟糯；煮制的兔肉和酶解后煮制的兔肉硬度適中，彈性較高，咀嚼度偏高，口感較有彈性，耐嚼；烤箱烤制的兔肉硬度較高，彈性適中，咀嚼度適中，有較好的口感。

2.2 不同加工方式下兔肉的游離氨基酸檢測(cè)

由圖1可知，酶解后煮制的兔肉檢測(cè)出的游離氨基酸含量最高，其余3種加工方式差距不明顯。經(jīng)過(guò)加熱的兔肉，蛋白質(zhì)受熱發(fā)生降解，產(chǎn)生大量的氨基酸，氨基酸溶于水中作為調(diào)味物質(zhì)，使其變得鮮美[10]。本實(shí)驗(yàn)表明，采用酶解技術(shù)對(duì)兔肉進(jìn)行加工，可以更好地釋放游離氨基酸等風(fēng)味前體物質(zhì)。

圖1 不同加工方式下不同兔肉游離氨基酸含量

2.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定分析

用SPME-GC-MS測(cè)定4種不同加工方法的兔肉的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其色譜圖結(jié)果見(jiàn)圖2，各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類及含量見(jiàn)表2，樣品共鑒定出58種揮發(fā)性風(fēng)味成分，其中煮制為30種，酶解后煮制為35種，高壓煮制為28種，烤制為21種，檢測(cè)出的成分主要為烴類、醛類、醇類、酮類及酯類化合物。

圖2 不同加工方式下兔肉揮發(fā)性成分GC-MS總離子色譜圖Fig.2 GC-MS total ion chromatograms of volatile components in rabbit meat by different processing methods

表2 不同加工方式下兔肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類分析

兔肉加熱過(guò)程中，脂肪的熱氧化降解生成的羰基化合物與氨基酸或者美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物進(jìn)行一系列后續(xù)反應(yīng)，生成的風(fēng)味化合物對(duì)肉的整體芳香氣味產(chǎn)生影響。由表2可知，從揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類數(shù)量上看，酶解后煮制>煮制>高壓煮制>烤制；從揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的絕對(duì)含量上看，烤制>酶解后煮制>煮制>高壓煮制，醛類、烴類和醇類化合物的變化決定了它們所含的揮發(fā)性化合物種類和數(shù)量的差異。酶解后煮制檢測(cè)出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類數(shù)量最多，其中烴類物質(zhì)種類數(shù)量最多，有14種，相對(duì)含量則是醇類最高,達(dá)到35.983%，烤制檢測(cè)出的揮發(fā)性風(fēng)味成分種類為21種，是最少的，但絕對(duì)含量17.862 μg/kg是最高的，其中醛類化合物占比最高，為11.356%，形成的原因考慮為烤制導(dǎo)致烴類小分子風(fēng)味物質(zhì)揮發(fā)，兔肉中內(nèi)源酶在發(fā)酵成熟過(guò)程中不斷作用，導(dǎo)致兔肉中脂肪、蛋白質(zhì)氧化水解生成大量游離脂肪酸及游離氨基酸，作為重要的風(fēng)味前體物質(zhì)，其中醛類物質(zhì)所占比重最大[11]。

續(xù) 表

續(xù) 表

2.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的 OAV 分析

感覺(jué)閾值和含量共同決定了揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對(duì)不同加工方式兔肉的總體風(fēng)味貢獻(xiàn)程度，通過(guò)結(jié)合各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的絕對(duì)含量和感覺(jué)閾值，采用OAV法對(duì)產(chǎn)品產(chǎn)生的特征揮發(fā)性風(fēng)味化合物進(jìn)行分析，確定其關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)[12]。不同加工方式的兔肉樣品風(fēng)味組分貢獻(xiàn)結(jié)果見(jiàn)表3，共確定17種關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)(OAV≥1)，煮制的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)11種，酶解后煮制的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)9種，高壓煮制的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)8種，烤制的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)9種。17 種關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)中主要為醛類(己醛、庚醛、2-庚烯醛、反,反-2,4-壬二烯醛、正辛醛、壬醛)、醇類(異戊醇、正己醇、1-辛基-3-醇、2,6,6-三甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚烷-3-醇、1-壬醇)、烴類(月桂烯、4-異丙基甲苯、D-檸檬烯)、酯類(正己酸乙酯)和其他類(2-正戊基呋喃、茴香腦)。

表3 不同加工方式下兔肉風(fēng)味物質(zhì)氣味活度值

醛類物質(zhì)在4種不同加工方式兔肉的關(guān)鍵風(fēng)味成分中占比最高，尤其是烤制兔肉有5種關(guān)鍵風(fēng)味成分，分別是己醛、庚醛、2-庚烯醛、正辛醛和壬醛。李興艷[13]和朱成林等[14]研究表明熟制后兔肉中醛類占總體風(fēng)味物質(zhì)超過(guò)40%，該研究與其結(jié)果基本一致。醛類是脂質(zhì)衍生的特征風(fēng)味產(chǎn)物之一[15]，其特點(diǎn)為閾值低、呈味廣，對(duì)兔肉整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)更為突出，尤其是低碳醛類對(duì)兔肉風(fēng)味的影響更加顯著[16]。在檢測(cè)出的醛類中以飽和直鏈醛為主，飽和直鏈醛一般具有辛辣味，令人不悅[17]，在4種加工方式中均檢測(cè)出己醛，在含量較低時(shí)，一般被描述為青草味或蘋果味，含量較高時(shí)則具有強(qiáng)烈的生油脂味[18]，己醛是兔肉中亞油酸氧化的產(chǎn)物，因此它是評(píng)價(jià)肉類和肉類產(chǎn)品氧化狀態(tài)和風(fēng)味質(zhì)量的可靠指標(biāo)[19]。同樣，庚醛與壬醛也作為4種不同加工方式兔肉的關(guān)鍵風(fēng)味成分，OAV值均大于1，其中以烤箱烤制的OAV值最大，分別為89.225 和251.551。庚醛具有不愉快的油脂味道，壬醛具有玫瑰柑橘清香及烤焦香、油炸香。正辛醛和2-庚烯醛僅在烤兔中作為關(guān)鍵風(fēng)味成分，OAV值分別為358.028 和2.060，正辛醛具有果香和生嫩的新香，2-庚烯醛具有脂肪香和青香、焦香[20-21]。反,反-2,4-壬二烯醛則是高壓煮制兔肉獨(dú)有的關(guān)鍵風(fēng)味成分，由于其閾值極低，OAV值為7129.960，所以它是高壓煮制兔肉的關(guān)鍵風(fēng)味成分之一，呈甜香味或米飯香[22]。

醇類一般是由脂肪酸衍生而來(lái)或由羰基化合物還原而來(lái)[23]，與醛類化合物相比，醇類化合物的感覺(jué)閾值更高，不飽和醇的閾值相對(duì)較低[24]。醇類物質(zhì)在酶解后煮制的加工方式中總絕對(duì)含量最高，達(dá)到4.623 μg/kg，其中關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)為正己醇、1-辛基-3-醇、2,6,6-三甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚烷-3-醇和1-壬醇，OAV值分別為10.036，943.882，1.404和18.567。1-辛烯-3-醇也是4種不同加工方式兔肉共有的關(guān)鍵風(fēng)味成分，其來(lái)源于不飽和脂肪酸的氧化，表現(xiàn)出蘑菇香、花香氣息[25]。2,6,6-三甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚烷-3-醇的香氣描述沒(méi)有相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道，1-壬醇具有玫瑰和橙子的宜人香氣。正己醇雖然在4種加工方式兔肉中均檢測(cè)出，但它不作為烤制兔肉的關(guān)鍵風(fēng)味成分，具有葉香、果香及青草香[26]。異戊醇在煮制、酶解后煮制與高壓煮制3種加工方式中均能檢測(cè)出，但僅作為煮制兔肉的關(guān)鍵風(fēng)味成分(OAV≥1)，具有蘋果白蘭地香氣和辛辣味[27]。

烴類物質(zhì)在煮制和酶解后煮制的兔肉中檢出的種類較多，絕對(duì)含量也較高。D-檸檬烯在煮制、高壓煮制、烤制3種加工方式中均有檢出，且閾值較低，所以計(jì)算出的OAV值相對(duì)較高，均大于1，是3種加工方式的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)，它具有檸檬香氣、樟腦和松脂類香氣，是潛在的風(fēng)味前體物質(zhì)[28-29]。月桂烯為煮制兔肉特有的關(guān)鍵風(fēng)味成分(OAV≥1)，具有令人愉快的、清淡的香脂氣味；4-異丙基甲苯則是高壓煮制兔肉獨(dú)有的關(guān)鍵風(fēng)味成分(OAV≥1)，具有溫和的、令人愉快的氣味，常用于食用香料和制藥工業(yè)[30]。

此外，本研究還在4種加工方式的兔肉中檢測(cè)到酮類、酯類與其他種類的化合物，其中正己酸乙酯在煮制兔肉與酶解后煮制的兔肉中檢出，作為關(guān)鍵風(fēng)味成分，其具有水果香氣[31]。2-正戊基呋喃在煮制、酶解后煮制和烤制的兔肉中均為關(guān)鍵性風(fēng)味成分，具有杏仁味、泥土芳香、豆香味及類似蔬菜的香韻，陳康等[32]的研究發(fā)現(xiàn)2-正戊基呋喃很可能是伊拉兔肉的特征性風(fēng)味化合物之一，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。茴香腦在4種加工方式中均有檢出，但含量較低，僅作為烤兔的特征風(fēng)味之一(OAV≥1)，其帶有甜味，具有茴香的特殊香氣。其余化合物成分雖然有檢出，但由于其含量較少、閾值較高，因此不是導(dǎo)致兔肉風(fēng)味差異的主要因素，但對(duì)賦予兔肉更好的風(fēng)味有一定的作用。

3 結(jié)論

從檢測(cè)出的游離氨基酸來(lái)看，酶解后煮制的兔肉游離氨基酸含量最高。不同加工方式的兔肉質(zhì)構(gòu)特性有明顯差異，高壓煮制的兔肉硬度低，彈性低，咀嚼度低，口感較為軟糯；煮制的兔肉和酶解后煮制的兔肉硬度適中，彈性較高，咀嚼度偏高，口感較有彈性，耐嚼；烤箱烤制的兔肉硬度較高，彈性適中，咀嚼度適中，有較好的口感。采用SPME-GC-MS對(duì)4種不同加工方式的兔肉的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，樣品共鑒定出58種揮發(fā)性風(fēng)味成分，其中煮制30種，酶解后煮制35種，高壓煮制為28種，烤制21種，檢測(cè)出的成分主要為烴類、醛類、醇類、酮類及酯類化合物。酶解后煮制檢測(cè)出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類數(shù)量最多，其中烴類物質(zhì)種類數(shù)量最多，有14種，烤制檢測(cè)出的揮發(fā)性風(fēng)味成分種類為21種，是最少的，但絕對(duì)含量是最高的，其中醛類化合物占比最高。不同加工方式共確定 17 種關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)(OAV≥1)，煮制的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)11種，酶解后煮制的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)9種，高壓煮制的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)8種，烤制的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)9種，17 種關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)中醛類最多，煮制兔肉和酶解后煮制兔肉的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)多數(shù)為醇類，高壓煮制兔肉和烤制兔肉的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)中醛類最多。