邱皓璞，李卓航，潘潔塵，馬世宏，張鋒倫，傅 雷，束成杰*

（1.南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇南京210019；2.南京野生植物綜合利用研究所，江蘇南京211111）

白及［Bletilla striata（Thunb. ex Murray）Rchb.F.，B. striata］為蘭科植物白及的干燥塊莖，其性微寒，味苦、干澀［1］，藥用歷史悠久，具有收斂止血、清熱利濕、消腫生肌的功效［2］，主要用于治療咯血、外傷出血、燒燙傷、口腔潰瘍、皮膚皴裂等疾病［3］。白及主要含有聯(lián)芐類、聯(lián)菲類及其衍生物、糖苷類、萜類、多糖等化學(xué)成分［4-5］。現(xiàn)代藥理研究表明，白及多糖可以調(diào)節(jié)小鼠的免疫功能［6］，對于糖尿病潰瘍創(chuàng)面能促進(jìn)愈合［7］。在生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，白及多糖也具有非常大的應(yīng)用前景。作為一種天然的增稠劑，白及多糖成膜性能較好、易和機(jī)體組織混融，機(jī)體可緩慢地降解吸收白及多糖，且不具有致熱原形和抗原性［8］。白及多糖對皮膚刺激性較小且可以延緩皮膚衰老，因此在日化產(chǎn)品中，白及多糖被廣泛使用。如何提高白及多糖的釋放一直以來都是研究白及資源的一大重要研究方向。

雙向發(fā)酵技術(shù)指采用具有一定活性成分的植物作為養(yǎng)分機(jī)制來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的培養(yǎng)基，并把經(jīng)過優(yōu)選的菌種加入其中進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，最早出現(xiàn)于在上世紀(jì)80 年代，目前已逐步由食品、醫(yī)藥領(lǐng)域延伸到了化妝品領(lǐng)域［9］。研究表明，在發(fā)酵過程中，微生物代謝時(shí)產(chǎn)生的酶可以改變植物中的組織、成分，也可以富集植物中的一類或幾類活性成分［10］。本試驗(yàn)通過雙向發(fā)酵技術(shù)對白及塊莖進(jìn)行發(fā)酵，篩選出富集白及多糖效果更佳的工藝，并通過模式動(dòng)物斑馬魚對白及發(fā)酵液在體內(nèi)的安全性進(jìn)行探究，為白及發(fā)酵產(chǎn)物在未來的原料開發(fā)與應(yīng)用中提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 材料

白及由南京野生植物綜合利用研究所提供；釀酒酵母菌、植物乳桿菌由揚(yáng)州羅素生物技術(shù)有限公司饋贈；野生型AB系斑馬魚由廣東藥科大學(xué)引入。

1.1.2 試驗(yàn)儀器

KF-1209 電子天平（中國凱豐集團(tuán)有限公司）；FA2004HM 分析天平（萬泰儀器有限公司）；ControlD-183A 冰箱（榮事達(dá)有限公司）；DS-1 組織粉碎機(jī)（北京華欣科創(chuàng)科技有限公司）；T6 紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；渦旋震蕩器（上海珂淮儀器有限公司）；MQT-60R 搖床（上海旻泉有限公司）；LDZX-50K 白及高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；SPX-150B-Z 生化培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；JW-25017HR 高速冷凍離心機(jī)（安徽嘉文儀器裝備有限公司）；GJB2000L/h-120Mpa 高壓均質(zhì)機(jī)（常州市超力均質(zhì)泵廠）；OlympusBX41 奧林巴斯顯微鏡（南京艾朗儀器有限公司）；PHSJ-4F型PH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；wya-2w 阿貝折光儀（上海市光學(xué)儀器廠）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；NDJ 旋轉(zhuǎn)式粘度計(jì)（上海精暉儀器設(shè)備有限公司）；Z-A-D5 五層單排獨(dú)立養(yǎng)殖單元（上海海圣生物試驗(yàn)設(shè)備有限公司）；SZ680 連續(xù)變倍體式顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限公司）；ZXSD-A1090生化培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；SQP 萬分之一天平賽多利斯科學(xué)儀器（北京有限公司）；FA2004HM 電子天平（常州萬泰儀器有限公司）。

1.1.3 試驗(yàn)試劑

硫酸、無水乙醇，南京化學(xué)試劑有限公司；氯化鎂、鹽酸、氯仿、乙醚、苯酚、氯化鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂、蛋白胨、牛肉膏、乳糖、豬膽鹽、麥芽汁培養(yǎng)基，日本制藥株式會社；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司；乙醚、丙酮，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酵母菌發(fā)酵方法

白及塊莖準(zhǔn)確稱量后粉碎，過100 目篩，按1：100 的料液比加入去離子水，在121℃，0.1 Mpa 條件下滅菌20 min后，調(diào)pH為6.0～6.5。按照1‰投料比例接種菌體濃度達(dá)到108CFU/mL 的釀酒酵母菌，攪拌均勻。發(fā)酵罐設(shè)定溫度37℃，發(fā)酵時(shí)間48 h，發(fā)酵完成后在8 000 r/min 條件下離心，取上清液在1 150～1 200 Bar 條件下完成破壁，冷卻后通過0.45μm微孔濾膜過濾除渣，得發(fā)酵產(chǎn)物。

1.2.2 乳桿菌發(fā)酵方法

與1.2.1發(fā)酵方法相同，所使用菌種為濃度達(dá)到108CFU/mL的植物乳桿菌。

1.2.3 多糖含量測定方法

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精確稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，轉(zhuǎn)入100 mL 容量瓶中，用適量超蒸餾水溶解并稀釋至刻度，充分搖勻，得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。依次稀釋成濃度為0.01，0.02，0.03，0.04 和0.05 mg/mL 的溶液，分別精密吸取20 μL 標(biāo)準(zhǔn)液依照2.2.1.3 方法測定多糖提取率，得線性關(guān)系良好的回歸方程。

1.2.3.2 含量測定 本試驗(yàn)采用苯酚-硫酸法［11］測定多糖提取率，加足量純水充分溶解樣品后，取100μL 稀釋液加入試管中，再依次加入1 900μL 純水，1 mL 8%苯酚溶液，5 mL濃硫酸，沸水浴20 min后放入冰水中，在A490nm處測定最大吸光值。

（其中，Y 為多糖提取率，%；ρ 為多糖的濃度，mg/mL；V 為溶解多糖所消耗的純水的體積，mL；X為提取多糖所用的白及塊莖質(zhì)量，g）。

1.2.4 相關(guān)指標(biāo)測定方法

分別對兩種產(chǎn)物的pH 值、折光率、比重、固形物含量、粘度進(jìn)行測試，然后分別依照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范（2015 版）》［12］和《中國藥典（2020 版）》［13］的要求對兩種產(chǎn)物的微生物含量與重金屬含量進(jìn)行檢測。

1.2.5 發(fā)育毒性測定方法

1.2.5.1 試驗(yàn)用魚及其受精卵的采集 將性成熟斑馬魚雌雄分缸飼養(yǎng)于斑馬魚養(yǎng)殖單元中。水溫：26±2℃；pH 7.2；電導(dǎo)率：520 μs/cm；光照/黑暗周期：14 h：10 h。暴露試驗(yàn)開始前一天將雌雄以1：2 配對，自然交配產(chǎn)卵［14］。

1.2.5.2 暴露試驗(yàn) 挑選發(fā)育至0～3 hpf（hours postfertilization）的健康斑馬魚魚胚置于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，20 尾/孔，每孔加入5 mL 樣品溶液。以斑馬魚養(yǎng)殖水為空白對照組。分別于24 hpf、48 hpf 和72 hpf時(shí)在體視顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)魚胚或幼魚的孵化、畸形和死亡數(shù)量。其中畸形形態(tài)包括：頭部畸形、心包水腫、卵黃囊水腫、血液堵塞、脊柱彎曲、尾部彎曲、發(fā)育遲緩等；死亡狀態(tài)判斷為：卵黃囊凝結(jié)、心跳停止［15］。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均為平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)誤差（S.E.M）。數(shù)據(jù)分析使用SPSS 19.0軟件完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

計(jì)算得知，兩種白及發(fā)酵產(chǎn)物的峰面積與其質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系，并且經(jīng)過數(shù)據(jù)的歸納和分析，得到回歸方程為 y=14.179x-0.067 6，R2=0.996 9（y為吸光度，x 為質(zhì)量濃度，r 為相關(guān)因數(shù)）。通過該結(jié)果，我們可以分析出，當(dāng)吸光度實(shí)際測量值處在0.01～0.79的范圍時(shí)，其呈現(xiàn)的線性關(guān)系良好。

2.2 各項(xiàng)指標(biāo)檢測結(jié)果

通過《技術(shù)規(guī)范》第五章中微生物檢驗(yàn)方法對兩種樣品的菌落總數(shù)以及各類菌種進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：

在菌落總數(shù)的微生物含量檢驗(yàn)試驗(yàn)中，各個(gè)稀釋度均無菌生長，故按照規(guī)范記為＜10 CFU/mL；

在霉菌和酵母菌的微生物含量檢驗(yàn)試驗(yàn)中，各個(gè)稀釋度均無菌生長，故按照規(guī)范記為＜10 CFU/mL；

在金黃色葡萄球菌的微生物含量檢驗(yàn)試驗(yàn)中，平板上無可疑菌落生長，且未檢測出革蘭氏陽性菌，故按照規(guī)范未檢出金黃色葡萄球菌；

在銅綠假單胞菌的微生物含量檢驗(yàn)試驗(yàn)中，平板上無可疑菌落生長，且未檢測出革蘭氏陰性桿菌，故按照規(guī)范未檢出銅綠假單胞菌；

在耐熱大腸菌群的微生物含量檢驗(yàn)試驗(yàn)中，并未出現(xiàn)產(chǎn)酸產(chǎn)期現(xiàn)象，平板上無可疑菌落生長，且未檢測出革蘭氏陰性短桿菌，故按照規(guī)范未檢出耐熱大腸菌群。

依據(jù)檢測結(jié)果繪制表1，白及植物乳桿菌發(fā)酵液中的多糖含量顯著高于白及釀酒酵母發(fā)酵液中的多糖含量，表明植物乳桿菌相較于釀酒酵母更易富集白及塊莖中的多糖。同時(shí)，在顏色和氣味上，白及的植物乳桿菌發(fā)酵液較白及的釀酒酵母菌發(fā)酵液更淺。此外，乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)物與酵母菌發(fā)酵產(chǎn)物中均未檢出重金屬，不含金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和耐熱大腸菌群，且菌落總數(shù)及霉菌和酵母菌總數(shù)均符合《技術(shù)規(guī)范》的規(guī)定。

表1 兩種發(fā)酵液相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果Table 1 Two kinds of fermentation broth index detection results

上述試驗(yàn)表明，白及植物乳桿菌發(fā)酵液檢測結(jié)果優(yōu)于釀酒酵母發(fā)酵液，因此選擇植物乳桿菌發(fā)酵液進(jìn)行發(fā)育毒性測試，該試驗(yàn)選擇斑馬魚胚胎進(jìn)行檢測。

2.3 發(fā)育毒性結(jié)果對比

本試驗(yàn)利用斑馬魚胚胎對白及植物乳桿菌發(fā)酵液進(jìn)行安全性評價(jià)，白及植物乳酸發(fā)酵液發(fā)育毒性試驗(yàn)結(jié)果如表2～4 和圖1 所示。在試驗(yàn)條件下，空白對照組處理魚胚72 h 時(shí)死亡率、孵化率和畸形率分別為：0.0±0.0、98.3±2.9 和 0.0±0.0。從表 2 可知，在4 mg/mL 樣品的試驗(yàn)濃度下，斑馬魚胚胎在24 h、48 h、72 h 的死亡率均為 0，與空白對照組相比無顯著差異（P＞0.05），而8、16 mg/mL 濃度下，斑馬魚胚在48h 時(shí)出現(xiàn)大量死亡，其中16 mg/mL 給藥48h 死亡率為100%，相較于空白對照組出現(xiàn)極顯著差異（P＜0.001），表明低于4 mg/mL 的樣品不會引起斑馬魚魚胚死亡，而濃度高于4 mg/mL 的樣品均會導(dǎo)致斑馬魚魚胚大量死亡。

表2 白及發(fā)酵產(chǎn)物對魚胚死亡率的影響Table 2 Effects of B. striata fermentation products on mortality of fish embryos （%）

由表 3 可知，8 mg/mL 和 16 mg/mL 給藥時(shí)，斑馬魚魚胚均未孵化，相較于空白對照出現(xiàn)極顯著降低（P＜0.001）。

表3 白及發(fā)酵產(chǎn)物對魚胚孵化率的影響Table 3 Effects of B. striata fermentation products on hatchability of fish embryos （%）

白及植物乳桿菌發(fā)酵液對魚胚畸形率的影響見圖1和表4。4 mg/mL及以下濃度的樣品處理72 h時(shí)對魚胚無顯著致畸效應(yīng)，而8 mg/mL 和16 mg/mL的樣品處理組均未孵化。本次試驗(yàn)條件下，白及植物乳桿菌發(fā)酵液處理斑馬魚魚胚后的安全濃度范圍為≤4 mg/mL。

表4 白及發(fā)酵產(chǎn)物對魚胚畸形率的影響Table 4 Effects of B. striata fermentation products on deformity rate of fish embryos （%）

圖1 白及發(fā)酵產(chǎn)物對魚胚發(fā)育毒性的影響Fig. 1 Effects of B. striata fermentation products on developmental toxicity of fish embryos

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，植物乳桿菌發(fā)酵得到的白及發(fā)酵液多糖含量為3.78%，高于釀酒酵母菌發(fā)酵所得的發(fā)酵液中的多糖含量，且相關(guān)指標(biāo)大多優(yōu)于酵母菌發(fā)酵產(chǎn)物。乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)物的安全濃度最大為4 mg/mL。本試驗(yàn)利用雙向發(fā)酵技術(shù)對白及塊莖進(jìn)行發(fā)酵，對白及發(fā)酵產(chǎn)物的多糖含量及各項(xiàng)理化性質(zhì)等指標(biāo)進(jìn)行檢測，借助斑馬魚探究白及發(fā)酵產(chǎn)物的體內(nèi)發(fā)育毒性，可為白及的發(fā)酵產(chǎn)品提供參考，提高植物資源的高值利用。

目前，對發(fā)酵過程中微生物與植物或者中藥材之間的作用較多地停留在體外功效和活性物質(zhì)的研究上，隨著皮膚微生態(tài)研究領(lǐng)域的發(fā)展，還需要進(jìn)一步考慮發(fā)酵產(chǎn)物對人體皮膚微生態(tài)的影響。

雖然植物發(fā)酵技術(shù)在應(yīng)用中也存在著各種問題，但隨著相關(guān)理論和技術(shù)的不斷深入和完善，植物生物發(fā)酵技術(shù)會在化妝品中有更光明的應(yīng)用前景。生物雙向發(fā)酵技術(shù)把我國傳統(tǒng)的中醫(yī)藥優(yōu)勢與現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)相結(jié)合，將為我們進(jìn)行獨(dú)具中國特色的民族化妝品的開發(fā)提供一個(gè)新的思路。