譚 浩，周建平，許 燕，張旭婧

(新疆大學(xué) 機(jī)械工程學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830047)

0 引言

骨組織工程是將成骨細(xì)胞種植在具有高生物相容性并且可降解的支架上，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化為骨骼，同時(shí)支架材料逐漸被降解，達(dá)到治療骨缺損的目的[1-3]?，F(xiàn)階段針對(duì)疾病性骨缺損，在骨組織工程的基礎(chǔ)上，加入了對(duì)病灶處的藥物精準(zhǔn)、持續(xù)釋放，既保證了骨骼的生長(zhǎng)，也促進(jìn)了疾病的治療。異煙肼是骨結(jié)核治療的親水性藥物，并常與組織工程骨支架結(jié)合使用，但該類(lèi)藥物存在一定的毒副作用，過(guò)多藥物易使體內(nèi)臟器受損[4-6]，此類(lèi)藥物的控釋對(duì)載藥骨支架應(yīng)用尤為重要。

3D打印是目前新興的一種制造方法，利用3D打印技術(shù)結(jié)合不同患者病灶處的具體情況，能夠制備出在外形上與骨缺損地帶相匹配的骨支架，通過(guò)工藝調(diào)節(jié)將藥物與支架材料相結(jié)合打印，實(shí)現(xiàn)在病灶處藥物投放和緩釋?zhuān)岣咚幬锢寐什⒋蠓忍岣咧委熜Ч?。湖南大學(xué)喬小銀[7]通過(guò)3D打印的方法制備了負(fù)載阿霉素及順鉑雙藥物的抗癌緩釋支架，通過(guò)體外以及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，成功抑制原位乳腺癌小鼠的乳腺腫瘤生長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)病灶處的精準(zhǔn)靶向治療。載藥微球是可以實(shí)現(xiàn)藥物緩釋的載體，其對(duì)藥物的包覆是控制藥物緩釋的重要途徑。將微球與骨組織工程支架結(jié)合，能夠進(jìn)一步控制支架的藥物釋速度進(jìn)而提高藥物利用率，減少藥物對(duì)人體的損傷。

羥基磷灰石(Hydroxy Apatite,HA)是打印骨支架常用的天然骨材料，結(jié)合具有良好的生物相容性絲素蛋白(Silk Fibroin，SF)制備支架，能夠增加支架的骨誘導(dǎo)性和傳導(dǎo)性，促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)[8-10]。SF源于蠶絲脫膠而得的纖維狀蛋白質(zhì)，其二級(jí)構(gòu)象以無(wú)規(guī)線團(tuán)、α-螺旋及β-折疊形式存在。二級(jí)結(jié)構(gòu)可在外界因素如溫度、濃度、pH值、應(yīng)力、離子的影響下由無(wú)規(guī)線團(tuán)不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為β-折疊穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。在微球的制備中，聚乳酸-羥基乙酸、殼聚糖、SF是最常用的材料。聚乳酸-羥基乙酸是人工高分子聚合物，微球在使用過(guò)程中能夠較快降解，但同時(shí)會(huì)產(chǎn)生酸性環(huán)境。殼聚糖、SF同屬于天然高分子聚合物，而改變?chǔ)?折疊結(jié)構(gòu)含量可以調(diào)整SF的親疏水特性，能夠進(jìn)一步調(diào)整微球的載藥、緩釋以及力學(xué)性能，因此利用SF制備載藥微球，可以在保證微球的生物相容性的同時(shí)，進(jìn)一步優(yōu)化支架的釋藥、力學(xué)性能。蘭州大學(xué)的喬永杰、甄平等[11]利用聚乳酸聚羥基乙酸微球搭載了異煙肼以及鏈霉素藥物制備了載藥支架，結(jié)果表明支架和藥物之間具有良好結(jié)合性，并具有良好的藥物釋放效果。燕山大學(xué)宋河儒等人[12]利用殼聚糖制備了核殼結(jié)構(gòu)微球，提高了微球的緩釋性能。太原理工大學(xué)吉立靜等人[13]通過(guò)自組裝的方法，成功制備了負(fù)載姜黃素的SF微球，并通過(guò)調(diào)整微球的大小和乙醇介質(zhì)的體積分?jǐn)?shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)微球釋藥速率控制?，F(xiàn)階段微球探究已較為完備，通過(guò)微球能夠很好地調(diào)節(jié)藥物的釋放速率，進(jìn)一步完善藥物的控釋。

為了制備能夠控釋藥物，并具有高生物相容性的載藥微球骨支架，本文以異煙肼作為代表性藥物，利用擠出沉積式3D打印法，將SF微球與支架材料混合制備載藥骨支架。通過(guò)支架材料與藥物的量效關(guān)系，計(jì)算出不同載藥量下骨支架所需的總藥量，并通過(guò)微球的釋藥機(jī)理，探究出微球?qū)χЪ艿木忈?、降解、力學(xué)性能的影響，為制備可控釋載藥微球支架提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 試劑和儀器

SF(粒徑350 nm，新天絲生物技術(shù)有限公司)；HA(純度96%，粒徑40 nm，南京愛(ài)普瑞納米材料有限公司)；異煙肼(上海源葉生物科技有限公司)；磷酸鹽緩沖液(pH=7.0～7.2，0.006 7 M(PO4)，HyClone公司);Span-80、溴化鋰、聚乙烯醇(Poly Vinyl Alcohol,PVA)、碳酸鈉(北京博奧拓達(dá)科技有限公司)；數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(常州越新儀器制造有限公司)；紫外分光光度計(jì)(浙江力辰科技有限公司)；恒溫振蕩器(浙江納德科學(xué)儀器有限公司);微機(jī)控制電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)(WDW-20，方辰儀器設(shè)備公司)，自主研制3D打印機(jī)。

1.2 異煙肼標(biāo)曲

精準(zhǔn)稱(chēng)量異煙肼藥物50 mg加入100 mL磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Saline，PBS)，配置為500 μg/mL的緩沖液，將其分別稀釋成0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL的異煙肼標(biāo)準(zhǔn)液，利用紫外分光光度計(jì)，得到異煙肼藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)得到異煙肼藥物標(biāo)準(zhǔn)試樣溶液的吸光度。經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)得最大吸光值在262.5 nm處，回歸方程為y=0.343 97x-0.016 25，R2=0.994 9。

1.3 SF溶液制備

稱(chēng)取一定質(zhì)量的蠶繭，以浴比為1∶50加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的碳酸鈉溶液中，清洗烘干以浴比1∶4浸潤(rùn)于9.3 mol/L的溴化鋰溶液中溶解，用去離子水在透析袋中透析4天，每7 h更換溶液，之后離心制備成SF溶液冷藏備用，通過(guò)干燥法測(cè)量得到SF溶液濃度為3%。

1.4 載藥微球制備及性能測(cè)試

采用乳化法制備異煙肼微球。將Span-80與液體石蠟共混作為油相，以400 r/min磁力攪拌20 min至充分混勻，將SF溶液與異煙肼按比例混合作為水相。將水相緩慢滴入油相中，油相與水相比例在6∶1～14∶1之間，400 r/min持續(xù)攪拌乳化30 min，得到穩(wěn)定均勻的油包水相(W/O)初乳液，將異丙醇滴入W/O初乳液中持續(xù)攪拌30 min。將混合乳液以3 000 r/min離心3次，每次10 min，再用異丙醇洗滌兩次，超純水洗滌一次。離心后收集沉淀物，真空冷凍干燥，獲得粉末狀異煙肼載藥微球。微球形貌電鏡圖如圖1所示，微球表面較為光滑，粒徑均勻且成球效果較好。通過(guò)吸光度檢測(cè)得知微球的載藥率為3.2%。

圖1 載藥微球電鏡圖Fig.1 Electron microscopy of drug-loaded microspheres

1.5 PVA/SF水凝膠制備

通過(guò)加熱法將PVA與蒸餾水按比例制備成15%濃度的PVA溶液，將SF溶液與PVA溶液按照1∶4質(zhì)量比混合制備成PVA-SF凝膠。有研究表明SF與PVA結(jié)合，可增強(qiáng)水凝膠材料的生物相容性及增加孔隙率，加快支架內(nèi)外物質(zhì)的交換速度，促進(jìn)支架內(nèi)部藥物的釋放[14]。

1.6 載藥支架制備

1.6.1藥物含量計(jì)算

由于載藥骨支架的藥量通常需要根據(jù)打印支架的數(shù)量或浸泡載藥等方式進(jìn)行后處理計(jì)算，而材料遺留以及藥物與支架結(jié)合方式不穩(wěn)定將造成較大誤差。為此本文采用質(zhì)量控制法，基于單位材料與單個(gè)支架的質(zhì)量比，得出實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)加入的藥物總質(zhì)量My,具體計(jì)算公式為

(1)

式中，Mo為單個(gè)支架質(zhì)量，Mu為1 g支架材料(HA+β-磷酸三鈣)與PVA混合冷凍干燥后的質(zhì)量，X0為單個(gè)支架中應(yīng)載的藥物量，Ma為實(shí)驗(yàn)時(shí)加入的材料(HA+β-磷酸三鈣)總質(zhì)量。

1.6.2 微球支架制備

按照式(1)和微球的載藥率計(jì)算出應(yīng)加入的藥量和微球質(zhì)量，制備成總藥量均為18 mg的3組藥物粉末。分別為異煙肼純藥物粉末，總藥量的3%為微球的混合藥物粉末，總藥量的6%為微球的混合藥物粉末。

將HA與β-磷酸三鈣按照質(zhì)量比3∶2制備成固體打印芯材，分別與3組藥物粉末均勻混合加入PVA/SF水凝膠中，按照質(zhì)量比5∶8均勻攪拌，制作成3種不同微球含量的3D打印芯材。在3D打印機(jī)中利用G代碼控制機(jī)進(jìn)行支架打印，制備成高1 cm，長(zhǎng)、寬0.8 cm的載藥支架，最后通過(guò)冷凍干燥的方式對(duì)支架進(jìn)行定形處理，3種支架如圖2所示。

圖2 3D打印載藥骨支架Fig.2 3D printed drug-loaded polymer scaffolds

1.7 載藥骨支架藥物釋放性能測(cè)試

將3組載藥支架放在PBS溶液中，在37 ℃恒溫振蕩器中累計(jì)釋藥84 d，分別在1 d、2 d、7 d、14 d、28 d、42 d、56 d、70 d、84 d更換并留存緩釋液，通過(guò)紫外分光光度計(jì)分別測(cè)出每階段的藥物濃度，累加后得出累計(jì)釋藥率Q,具體計(jì)算公式為

(2)

式中，t為測(cè)樣次數(shù),n為測(cè)樣總次數(shù),Ct為第t次測(cè)得的藥物濃度,Vt為第t次測(cè)樣所取的液體體積,X0為每個(gè)支架的載藥量。

1.8 載藥骨支架體外降解研究

對(duì)載藥支架采用模擬體液浸泡法對(duì)支架進(jìn)行體外降解研究。將異煙肼載藥支架放入PBS緩沖液中，并在恒溫振蕩器中，37 ℃條件下培養(yǎng)84 d。根據(jù)人體體液更換規(guī)律，設(shè)置每14 d更換一次，設(shè)置每2周更換一次PBS溶液，并取出支架進(jìn)行干燥稱(chēng)重，持續(xù)觀察支架形貌[15]。

1.9 力學(xué)性能測(cè)試

將制備的載藥支架放在壓縮試樣機(jī)上進(jìn)行壓力測(cè)試，設(shè)置速度為2 mm/min，通過(guò)傳感器得到壓力數(shù)據(jù)，并用Origin軟件繪制壓力/應(yīng)變曲線。根據(jù)壓縮強(qiáng)度公式以及彈性模量公式分別計(jì)算3組支架的最大抗壓強(qiáng)度σmax及彈性模量E:

式中，F(xiàn)max為破壞時(shí)的最大載荷,A為樣本試驗(yàn)接觸面面積,F為試驗(yàn)力，L為試樣高度，ΔL為軸向變形，σ為正應(yīng)力，ε為應(yīng)變。

2 結(jié)果與討論

2.1 載藥骨支架藥物分析

2.1.1異煙肼微球支架釋藥量分析

在3種載藥支架中各取出3個(gè)緩釋樣品，計(jì)算得出3種載藥支架前一周的累計(jì)藥物釋放量如圖3所示。通過(guò)圖3可以得出，在1 d及1～3 d時(shí)間段內(nèi)，各組平行支架間藥物釋放量基本相同，藥量誤差在10～14 μg范圍內(nèi)，采用SPSS 2.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行組間多重比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。經(jīng)SPSS軟件分析得出P>0.05，說(shuō)明同種支架的差異性不顯著。由于前期為支架表面藥物釋放，支架形貌和結(jié)構(gòu)對(duì)藥物釋放的影響較大會(huì)造成較大誤差，因此通過(guò)3D打印方法控形，結(jié)合藥物計(jì)算，減少了同種支架藥物釋放的誤差，確保了支架藥量控制的準(zhǔn)確性。2 d后，微球支架藥物釋放量開(kāi)始小于純藥物支架。這是由于微球搭載藥物存在于微球表面以及微球內(nèi)部，當(dāng)微球緩釋時(shí)會(huì)將表面藥物優(yōu)先釋放，隨著微球的降解微球內(nèi)部的傳質(zhì)通道逐漸增多、擴(kuò)大，使微球內(nèi)部藥物緩慢釋放，因此加入微球的支架釋放速率更為緩慢[16]。

圖3 各時(shí)間階段內(nèi)支架累計(jì)釋藥量Fig.3 Cumulative amount of drug released from stents in each time phase

2.1.2 異煙肼微球支架釋藥率分析

通過(guò)3D打印的方法，保證了支架間形貌的一致，減小了因支架的形貌不同造成的緩釋誤差。圖4是根據(jù)式(2)計(jì)算出的3種支架的藥物累計(jì)緩釋率，圖4(a)為純藥物支架中取出的3個(gè)平行支架的累計(jì)藥物釋藥率，圖4(b)為含有3%藥物量微球的平行支架累計(jì)藥物釋藥率，圖4(c)為含有6%藥物量微球的平行支架累計(jì)藥物釋藥率。通過(guò)圖4可以看出，平行支架間的累積釋藥率趨勢(shì)基本相同。由于支架結(jié)構(gòu)相同，內(nèi)部的材料分布情況不同，支架降解、脹大后造成的傳質(zhì)通道不同，藥物釋放量在后期存在一定的差異，但平行組誤差都在1%～2%之間，誤差較小，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算其中(a)、(b)、(c)三組數(shù)據(jù)均為P>0.05同組間差異性不顯著，保證了試驗(yàn)的可重復(fù)性。因此通過(guò)3D打印的方法制備載藥支架可以穩(wěn)定控制支架中的藥物含量和支架的藥物釋放量，一定程度上減少了相同支架的藥物釋放誤差。

微球通過(guò)球壁的傳質(zhì)通道并利用內(nèi)外藥物濃度梯度減緩藥物釋放，因此可以通過(guò)改變微球含量達(dá)到減緩支架藥物釋放速率目的[16]。對(duì)3組支架的平行樣求均值后數(shù)據(jù)如圖4(d)所示。1～3 d左右3種支架的藥物釋放量基本相同，在3 d后搭載微球的支架釋放速率明顯慢于純藥物支架，并且微球的含量越多，緩釋速率越緩慢，6%微球支架相比于純藥物支架釋藥降低了2.27%，由于其釋藥趨勢(shì)基本相同，因此推斷微球支架可以延長(zhǎng)載藥時(shí)間2.27%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算3組支架間的P<0.01，不同組間差異性極其顯著，可以說(shuō)明微球?qū)χЪ茚屗幮阅茉斐闪烁拘愿淖?，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。支架的藥物釋放率和釋放模式是由藥物擴(kuò)散以及支架的降解共同決定的[17]。異煙肼為親水性藥物，前期支架表面的藥物會(huì)大量釋放溶解。后期由于支架中PVA與HA的交聯(lián)致密，結(jié)晶程度高，對(duì)內(nèi)部藥物釋放起到一定的阻礙作用，阻擋了液體在支架內(nèi)的流動(dòng)與交換，在支架降解、溶脹時(shí)傳質(zhì)通道擴(kuò)大，藥物才能大量釋放到支架外；同時(shí)基于微球的釋藥機(jī)理，將支架部分藥物轉(zhuǎn)化為微球內(nèi)藥物同樣減緩了藥物的釋放[12]。微球以及支架本身的共同影響造成了微球支架釋藥慢的現(xiàn)象。

圖4 載藥支架累積釋藥率Fig.4 Scaffolds cumulative release rate

2.2 載藥骨支架體外降解分析

HA作為磷酸鈣鹽類(lèi)自然礦化物，其降解主要是溶解、水解、沉淀和相變共同作用的結(jié)果[18]。體外緩釋主要是水解的方式，由于HA、PVA是難以降解的材料，因此水解作用中體降解速度大于面降解速度，滲水的速率大于水解的速率，使支架的表面降解速度大于內(nèi)部的降解速度[19-20]。由于支架材料攪拌過(guò)程中并不能保證材料均勻分布，因此在降解時(shí)會(huì)造成一定誤差，每次取樣從每組支架中取出3個(gè)作為平行樣，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得平行樣間P>0.05，同組間差異性不顯著，保證了平行支架的可重復(fù)性；對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組間重量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得0.01

表1 載藥支架12周降解率Tab.1 Degradation rate of drug-loadedscaffolds at 12 weeks

圖5 載藥支架質(zhì)量變化曲線Fig.5 Curve of mass change of drug-loading scaffolds

2.3 載藥骨支架力學(xué)強(qiáng)度分析

如表2所示，純藥物支架的最大抗壓強(qiáng)度為7.572 MPa，而加入SF微球支架的最大抗壓強(qiáng)度分別只有7.244 MPa和7.182 MPa，結(jié)合圖6所示的應(yīng)力-應(yīng)變曲線圖，可以看出彈性模量也隨微球含量的增加降低，支架的力學(xué)性能出現(xiàn)了一定的降低?？赡苡捎谖⑶蛴蒘F構(gòu)成，力學(xué)強(qiáng)度低且分子空間體積較大，從而使支架內(nèi)部孔隙率增加，降低了支架的彈性模量，使支架在同等受力情況下應(yīng)變擴(kuò)大[21]。

表2 載藥支架壓縮性能Tab.2 Compression performance of drug-loaded scaffolds

圖6 載藥支架應(yīng)力-應(yīng)變曲線Fig.6 Stress-strain of drug-loaded scaffolds

3 結(jié)論

本文采用擠出沉積式3D打印技術(shù)，選取生物性能較好的HA、SF以及PVA作為支架主體材料，在控制總藥量的基礎(chǔ)上，制備了純異煙肼藥物支架、3%載藥微球支架和6%載藥微球支架。通過(guò)緩釋、降解和力學(xué)實(shí)驗(yàn)可以得出，SF微球的加入可以減緩支架的釋藥速率，增加HA支架的降解速率，并在一定程度上降低支架的力學(xué)性能。因此，在使用微球的同時(shí)需要注意微球?qū)χЪ芰W(xué)性能的影響，使微球支架力學(xué)性能控制在許用范圍之內(nèi)。通過(guò)SF微球改變異煙肼載藥支架的釋藥速率，有利于降低異煙肼藥物的毒副作用，對(duì)載藥微球骨支架的制備以及應(yīng)用具有一定的借鑒意義，使支架降解速度與骨生長(zhǎng)速度相匹配，更好地促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)，治療骨結(jié)核等骨缺損性疾病。下一步，需要對(duì)支架中的形貌以及降解后支架內(nèi)部微球形貌進(jìn)行分析，深度揭示微球?qū)χЪ艿挠绊憴C(jī)理。