蘭潔,田維兵,徐龍芳,徐慧,劉世國,王芳

(1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝性疾病科,山東 青島 266100；2 濰坊市婦幼保健醫(yī)院新生兒疾病篩查中心；3 菏澤市婦幼保健醫(yī)院新生兒疾病篩查中心；4 青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳科和產(chǎn)前診斷中心)

先天性甲狀腺功能低下癥(CH)是最常見的新生兒內(nèi)分泌疾病之一，由于胚胎期某些病因的作用使甲狀腺軸的發(fā)生、發(fā)育和功能出現(xiàn)異常，導(dǎo)致血循環(huán)中甲狀腺激素水平減低，引起病兒生長發(fā)育遲滯、智力發(fā)育障礙和生理功能低下等，俗稱呆小癥。全球范圍內(nèi)新生兒CH發(fā)病率為1/(1 400～2 800)，男女之比為1∶2[1-2]。雖然遺傳因素被證明與不到10%的CH有關(guān)[3]，但在此基礎(chǔ)上，CH可分為甲狀腺發(fā)育不全(TD)和甲狀腺激素合成障礙兩類，TD約占CH病人的85%，是甲狀腺形成過程異常導(dǎo)致的缺如、異位和發(fā)育不良等[4-5]，其中異位甲狀腺最常見，占TD病人的50%～60%，且通常位于舌下位置[5]。另外15%的CH是由甲狀腺激素合成及代謝障礙所引起，與雙氧化酶2(DUOX2)、甲狀腺球蛋白(TG)和甲狀腺過氧化物酶(TPO)等基因突變相關(guān)[6]。TD通常被認為是一種散發(fā)性疾病，盡管2%的家族性病例支持孟德爾遺傳，但不能排除其他遺傳方式，如多基因、多因素和表觀遺傳[7-8]。TD單基因遺傳方式可能和參與甲狀腺形成的幾個基因的突變有關(guān)，包括TSHR、NKX2.1、FOXE1以及PAX8[9-10]。最近研究又發(fā)現(xiàn)幾個與TD相關(guān)的致病基因：NKX2-5、GLIS3、JAG1、CDCA8、TUBB1、NTN1等[11]。然而，這些所有已知致病基因的病例只占TD病人的5%，大多數(shù)TD病例的病因分子機制尚未明確，可能存在未發(fā)現(xiàn)的新基因突變。

2003年有國外學(xué)者首次在HOXA5-/-小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，幸存的突變小鼠出現(xiàn)甲狀腺功能減退癥表現(xiàn)，包括短暫性生長遲緩、延遲眼開放和耳朵抬高等[12]。HOXA5屬于同源盒基因(HOX)家族，位于7p15.2，包含2個外顯子，編碼由270個氨基酸組成的ANTP類同源結(jié)構(gòu)域蛋白[13]，該蛋白作為一種轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控基因的表達、細胞分化和機體形態(tài)的發(fā)生。HOXA5基因在呼吸道、消化道的形態(tài)發(fā)生，甲狀腺和乳房的發(fā)育，以及卵巢的動態(tài)平衡中起重要作用[14]。MEUNIER等[12]證實，HOXA5基因可能作用于與甲狀腺功能和發(fā)育調(diào)節(jié)相關(guān)基因Nkx2-1、Pax8和Titf2的表達而影響甲狀腺的發(fā)育。但是，至今未見關(guān)于該基因在CH病人中突變的報道，其致病機制仍不清楚。故本研究對山東地區(qū)266例確診為CH伴TD的病兒進行了HOXA5基因變異篩查，旨在探討HOXA5基因突變與山東地區(qū)CH伴TD病兒的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2010 年6 月—2018 年10月，于山東省各地級市(濟南、青島、濟寧、臨沂、煙臺、棗莊、淄博、濰坊、聊城、泰安和德州)共選取266例CH伴TD病兒為研究對象，其中包括118例(44.4%)甲狀腺缺如，81例(30.5%)甲狀腺異位，67例(25.2%)甲狀腺發(fā)育不良。266例病兒中，男性120例，女性146例，男女之比為1∶1.2；平均年齡為(3.5±1.8)歲。納入標準：①出生后72 h～7 d的新生兒，用濾紙從足跟采血，酶聯(lián)免疫吸附法測定促甲狀腺激素(TSH)水平，TSH≥20 mU/L者召回復(fù)查，電化學(xué)發(fā)光免疫分析法測定游離甲狀腺素(FT4)水平低(正常范圍為12～22 pmol/L)、血清TSH水平高(正常范圍為0.27～4.20 mU/L)者，診斷為CH；②病兒經(jīng)甲狀腺B 超或甲狀腺核素掃描確診為TD；③所有病兒無血緣關(guān)系且經(jīng)過體檢已排除CH外的其他先天性疾病。選取新生兒篩查中甲狀腺功能正常的200例新生兒作為對照組。本研究獲得了青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(2018-036)，且已告知病兒及對照新生兒家屬并獲取知情同意。

1.2 基因提取

使用血凝塊DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，根據(jù)說明書操作，從266例病兒和200例對照新生兒的血液樣本中提取DNA，用紫外線分光光度計檢測其濃度與純度，需在OD260處有顯著吸收峰，OD260/OD280比值應(yīng)為1.7～1.9?；蛱崛『笾?20 ℃保存。

1.3 PCR擴增

①引物設(shè)計：使用DNASTAR 7.1軟件設(shè)計HOXA5基因全編碼區(qū)(外顯子區(qū)及外顯子與內(nèi)含子交界處100 bp的區(qū)域)引物，由美國賽默飛世爾公司合成。引物序列和擴增長度見表1。②反應(yīng)體系為：上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，雙蒸水7 μL，2×Master Mix(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)10 μL，DNA模板2 μL(50～100 μg/L)，共20 μL。③反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃再延伸5～10 min，4 ℃保存。

表1 HOXA5基因外顯子引物序列、擴增長度及退火溫度

1.4 PCR產(chǎn)物測序

將5 μL PCR產(chǎn)物原液和1 μL 6×DNA上樣緩沖液加入到10 g/L瓊脂糖凝膠孔中，在1×TAE電泳液中，130 V電泳25 min，采用Bio-Rad GelDocXR+凝膠成像系統(tǒng)進行結(jié)果分析。如果目的條帶單一且清晰明亮，則使用ABI 3730XL自動測序儀進行PCR產(chǎn)物純化及Sanger測序。

1.5 測序結(jié)果的生物信息學(xué)分析

應(yīng)用BioEdit V7.0.1分析測序結(jié)果并與NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中HOXA5基因序列(NM_019102.4)進行比對，從中找出可能存在的基因突變位點。對檢測到的突變體進行蛋白保守性分析，比較多個物種之間的同源性，最后通過 PROVEAN、SIFT(http://provean.jcvi.org/index.php)，Polyphen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)，MutationTaster(http://www.mutationtaster.org/)預(yù)測所發(fā)現(xiàn)突變的有害性，并依據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(ACMG)的評估指南[15]，對基因突變進行致病性分析。

2 結(jié) 果

2.1 HOXA5 基因檢測

在266例CH伴TD病兒中分別檢測到1例HOXA5基因c.34C>G(p.R12G)突變(圖1A)和1例HOXA5基因c.337G>A(p.D113N)突變(圖1B)，均為錯義雜合突變。2例病兒攜帶的突變均位于HOXA5基因第1號外顯子，其中c.34C>G的第34位堿基由C變?yōu)镚，導(dǎo)致第12位密碼子的精氨酸變?yōu)楦拾彼?p.R12G)，c.337G>A的第337位堿基由G變成A，使得第113位密碼子的天冬氨酸變成天冬酰胺(p.D113N)。在200例正常對照新生兒中均未檢測到這兩個變異(圖1)。

A中箭頭示病兒在第34堿基位點發(fā)生C>G的突變；B中箭頭示病兒在第337堿基位點發(fā)生G>A的突變(反向測序)

2.2 突變生物信息學(xué)分析

用DNAMAN軟件對不同物種的蛋白序列進行比對顯示，p.R12G、p.D113N兩個突變均位于HOXA5基因保守區(qū)域(圖2)。用多種生物信息學(xué)軟件(PROVEAN、SIFT、PolyPhen-2、MutationTaster)預(yù)測突變的蛋白危害性，依據(jù)ACMG遺傳變異分類標準和指南，本研究中檢測到的HOXA5基因的兩個突變c.34C>G/p.R12G (PS4、PM2、PM6、PP3)和c.337G>A/p.D113N(PS4、PM2、PM6)都被判定為“可能致病”。見表2。

注：深藍色代表同源序列，A中紅色方框內(nèi)為HOXA5蛋白第12號(p.R12G)氨基酸，B中紅色方框內(nèi)為HOXA5蛋白第113號(p.D113N)氨基酸；兩個位點在哺乳動物中高度保守，自上到下分別為狗、倉鼠、人類、恒河猴、家鼠、黑猩猩和豬。

表2 HOXA5基因突變的致病性分析

2.3 基因型與表現(xiàn)型的關(guān)系

病兒1(HOXA5基因c.34C>G/p.R12G)為男性病兒，妊娠39周時經(jīng)剖宮產(chǎn)分娩，出生體質(zhì)量3 400 g，出生身高49 cm，Apgar評分10分。新生兒篩查示足跟血TSH 112.5 mU/L，出生后14 d被召回復(fù)查甲狀腺功能，結(jié)果示TSH 168.1 mU/L、FT45.8 pmol/L、FT34.5 pmol/L，診斷為CH。該病兒父母甲狀腺B超檢查均正常，無CH家族史。治療前行甲狀腺99mTc掃描示甲狀腺缺如。病兒表現(xiàn)為輕微的嗜睡和較嚴重的黃疸，服用左旋甲狀腺素(優(yōu)甲樂)治療至今，初始劑量為25 μg/d，5年后現(xiàn)用藥劑量為75 μg/d。病兒2(HOXA5c.337G>A/p.D113N)為女性病兒，母親有孕期一過性甲狀腺功能異常史，妊娠40周時經(jīng)陰道分娩，出生體質(zhì)量3 650 g，出生身高48 cm，Apgar評分10分。新生兒篩查示足跟血TSH 66.7 mU/L，出生12 d時被召回復(fù)查甲狀腺功能，結(jié)果示TSH 135 mU/L，F(xiàn)T44.2 pmol/L，F(xiàn)T33.8 pmol/L。甲狀腺99mTc掃描示甲狀腺發(fā)育不良，甲狀腺未分葉，呈球形，大小約為3.1 cm×2.0 cm。初始服用優(yōu)甲樂劑量為25 μg/d，7年后現(xiàn)用藥劑量為50 μg/d。現(xiàn)2例病兒生長發(fā)育和智力都正常。

3 討 論

甲狀腺的形態(tài)發(fā)育起源于原始咽部內(nèi)皮細胞和神經(jīng)嵴細胞這兩種不同的前體，前者形成甲狀腺濾泡細胞(TFC)，后者在發(fā)育早期遷移至雙側(cè)多鰓肌體，生成濾泡旁C細胞[11]。TFC是腺體中數(shù)量占95%的細胞群，形成甲狀腺濾泡，其球形結(jié)構(gòu)用于儲存和控制甲狀腺激素的釋放[16-17]。在原始咽部的內(nèi)皮細胞中，甲狀腺原基的發(fā)育分別發(fā)生在小鼠和人胚胎發(fā)育的8.0～8.5 d和20.0～22.0 d，分別在13.5 d和45.0～50.0 d完成向下遷移[18]。從小鼠胚胎發(fā)育8.5 d開始，TFC已經(jīng)獲得明顯的分子特征，即共表達4種轉(zhuǎn)錄因子(HHEX、Nkx2.1、Pax8和Foxe1)[19]，這表明它們是甲狀腺早期階段形態(tài)發(fā)生所必需的。甲狀腺形態(tài)發(fā)生異?；蚣谞钕侔l(fā)育不全通常是由于調(diào)節(jié)甲狀腺發(fā)育的基因發(fā)生突變，然而僅有小部分是由NKX2.1、FOXE1、PAX8、HHEX和TSHR等這些已知的基因缺陷造成的，大多數(shù)TD病例的病因分子機制目前尚不清楚。本文納入266例確診CH伴TD病兒，對可能和甲狀腺發(fā)育相關(guān)的基因HOXA5進行全編碼區(qū)PCR擴增及Sanger測序篩查突變，發(fā)現(xiàn)了2例(0.75%)病兒均攜帶一個可能致病的突變基因。

HOX是一個高度保守的基因家族，在控制體節(jié)特異性結(jié)構(gòu)的形成中占據(jù)中心地位[20]。因此，HOX基因的突變會改變節(jié)段的同一性并導(dǎo)致形態(tài)缺陷[21]。在哺乳動物中，HOX家族包含4個HOX簇(A、B、C和D)中的39個基因，這39個基因又可進一步細分為13個平行對數(shù)組(PG1～PG13)[22]，HOXA5是A簇、PG5的一個成員。人類HOXA5基因編碼分子量29 000大小、包含270個氨基酸的蛋白，該蛋白是調(diào)節(jié)細胞生長、分化和凋亡的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[23]。目前對于HOXA5的研究主要集中于其在多種癌癥中的異常表達，研究表明其可能與癌細胞的增殖、遷移和凋亡過程有關(guān)[24]，而其與甲狀腺疾病關(guān)系的相關(guān)研究較少。MEUNIER等[12]對hoxa5-/-突變小鼠的表型調(diào)查結(jié)果表明，幸存的突變小鼠表現(xiàn)出一過性生長遲緩、睜眼和耳朵抬起延遲等甲狀腺功能減退的癥狀；hoxa5-/-小鼠與野生型雜合子小鼠相比較，T4水平差異無顯著性，但在15日齡時，hoxa5-/-小鼠TSH水平比野生型高43%，2 d后二者水平一致；此外，進一步的研究表明，HOXA5基因功能喪失導(dǎo)致甲狀腺功能和發(fā)育的基本調(diào)節(jié)因子的表達水平發(fā)生了短暫的變化[12]。這與HOXA5基因敲除后在呼吸道形態(tài)發(fā)生過程中觀察到的結(jié)果有相似之處，即突變體中多個基因表達水平的微小變化可能是由于HOXA5功能缺乏而導(dǎo)致的整體變化[25]。然而，在CH的人群中，到目前為止未有HOXA5基因突變的報道。本研究發(fā)現(xiàn)2例病兒分別攜帶HOXA5 c.34C>G/p.R12G和c.337G>A/p.D113N雜合突變，且這兩個變異為國內(nèi)外首次報道。其中突變c.34C>G/p.R12G使HOXA5第12位的精氨酸變?yōu)楦拾彼?，而c.337G>A/p.D113N導(dǎo)致第113位的天冬氨酸變?yōu)樘於０?。進一步生物信息學(xué)分析表明，兩個突變都位于HOXA5蛋白相對保守區(qū)，而且多種致病性預(yù)測軟件和ACMG評級的結(jié)果均顯示，c.34C>G/p.R12G、c.337G>A/p.D113N均為“可能致病”變異。本研究首次發(fā)現(xiàn)HOXA5基因突變與人類CH的發(fā)病有關(guān)，并且認為HOXA5可能是CH伴TD的候選致病基因。此外，本研究發(fā)現(xiàn)2例攜帶HOXA5基因突變的病兒均有明顯的甲狀腺結(jié)構(gòu)和功能異常，在新生兒篩查時期也均檢測到高水平的TSH。甲狀腺超聲檢查示1例病兒甲狀腺缺如，另1例病兒甲狀腺發(fā)育不良。然而，基因型和表現(xiàn)型的關(guān)系還可能受其他多種因素的影響，仍需要進一步擴大樣本進行研究。

上述HOXA5基因突變引起CH的機制尚不清楚，HOXA5的表達僅限于毗鄰甲狀腺的間質(zhì)，提示該基因?qū)谞钕侔l(fā)育和功能的作用必須由信號分子介導(dǎo)[12]。HOXA5在肺、胃和腸形態(tài)發(fā)生過程中控制間充質(zhì)-上皮串擾的報道[26]進一步支持了這一假說。關(guān)于這種非細胞自主方式如何影響甲狀腺的形成還有待進一步研究。此外，由于本研究中山東地區(qū)HOXA5基因變異率較低，僅為0.75%，我們正在全國范圍內(nèi)擴大樣本量，將通過新一代高通量測序進一步篩選HOXA5基因變異，并通過后續(xù)的體內(nèi)外實驗驗證HOXA5基因變異的致病性。