曾振芳，蔡杰慧，黃秋萍，韋友歡，陳麗苗，黃秋嬋

(廣西民族師范學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，崇左 532200)

0 引 言

金屬配合物被廣泛應(yīng)用于催化[1-3]、磁性[4-6]、殺蟲[7-9]和藥物釋放[10-12]等領(lǐng)域。金屬有機(jī)配合物兼具無機(jī)和有機(jī)特性，隨著越來越多配合物的合成，新型配合物的性質(zhì)如生物活性引起人們的關(guān)注[13]。過渡金屬銅離子為生物體內(nèi)源性元素，在生命體中擁有許多重要的生理功能，與配體形成配合物時，具有抗腫瘤等活性[14-16]。DNA是向生物體傳達(dá)遺傳信息的一種高分子物質(zhì)，DNA對許多抗癌藥物目標(biāo)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯起作用，藥物可以通過共價鍵和非共價干擾DNA的復(fù)制，使其生理功能受到影響[17]。為了研究新型銅配合物的抗腫瘤能力，為銅金屬配合物作為抗癌藥物研究領(lǐng)域提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，本文合成了一個新型的鄰甲苯甲酸銅(Ⅱ)配合物{[Cu(OMBA)2]2·(DMF)2}，通過紅外、元素分析及 X射線單晶衍射等方法對配合物進(jìn)行表征及結(jié)構(gòu)分析，研究了配合物與CT-DNA的相互作用方式以及配合物對胃癌細(xì)胞A549、宮頸癌細(xì)胞Hela和肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞抗增殖能力。

1 實 驗

1.1 實驗主要儀器、試劑

實驗儀器：XTL-220型顯微鏡(中國上海天省)，Spectrum 65型傅里葉變換紅外光譜儀(美國PerkinElmer)，HERA cell CO2型細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo)，Smart ApexII CCD X 型X-射線單晶衍射儀(德國 Bruker)，Multiskan Spectrum型酶標(biāo)儀(美國Thermo)，RF-5301 PC型熒光分光光度計(日本島津)，VarioEL Ⅲ元素分析儀(德國艾樂曼)，常數(shù)毛細(xì)管黏度計(中國上海申誼)，UV-8000型紫外可見分光光度計(中國上海元析儀器)。

實驗試劑：鄰甲基苯甲酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，三水合硝酸銅(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)，小牛胸腺DNA(CT-DNA，Sigma)，三羥甲基氨基甲烷(Tris，武漢市恒沃科技有限公司)，DMEM培養(yǎng)液(Hyclone)，F(xiàn)12K培養(yǎng)液(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，CCK-8試劑(Biosharp)，0.25%胰酶溶液(索來寶)，胃癌細(xì)胞A549、宮頸癌細(xì)胞Hela和肝癌細(xì)胞HepG2(中國科學(xué)院細(xì)胞庫)。

1.2 配合物{[Cu(OMBA)2]2·(DMF)2}的合成

取1 mmol的鄰甲基苯甲酸溶于4.0 mL DMF和2.0 mL水制得鄰甲基苯甲酸溶液。往4.0 mL水中加入1 mmol三水合硝酸銅制得硝酸銅水溶液，攪拌下將硝酸銅水溶液滴加至鄰甲基苯甲酸溶液中，滴加完畢，攪拌30 min，封膜置于陰涼處，10 d后析出細(xì)小的淡青色晶體，過濾后50 ℃下烘干3 h，收率54.3%。{[Cu(OMBA)2]2·(DMF)2}的分子式為C38H42Cu2N2O10，相對分子質(zhì)量MW=813.82。元素分析理論值(%)：C 56.08,H 5.20,N 3.44；實驗值(%)：C 56.21,H 5.24,N 3.35。

1.3 配合物的晶體結(jié)構(gòu)測定

將尺寸為 0.21 mm× 0.18 mm× 0.15 mm 的晶體置于CCD X 射線面探衍射儀上，晶體在296(2)K時使用Mo-Kα射線 (λ=0.071 073 nm)衍射收集數(shù)據(jù)。掃描角度θ范圍為2.08°～25.00°，衍射區(qū)為(12≤h≤11,-11≤k≤12,-11≤l≤13)，收集4 585個衍射點(diǎn)，其中獨(dú)立衍射點(diǎn)有3 304個。全部數(shù)據(jù)經(jīng)Lp因子和經(jīng)驗吸收校正。結(jié)構(gòu)分析工作采用OLEX2和 SHEXTL-97 軟件完成。晶體結(jié)構(gòu)由重金屬法解出，氫原子均為理論加氫。對非氫原子采用各向異性熱參數(shù)進(jìn)行全矩陣最小二乘法修正。配合物的金屬配合物的晶體學(xué)數(shù)據(jù)列于表1。CCDC:1888907。R(int)=0.027 1，R1=0.051 5，wR2=0.140 4。

表1 配合物的晶體學(xué)數(shù)據(jù)Table 1 Crystallographic data of the complex

1.4 配合物與CT-DNA的相互作用

1.4.1 溶液配制

緩沖溶液(Tris-HCl/NaCl)：稱取0.605 7 g (5 mmol)的Tris和2.910 2 g (50 mmol)的氯化鈉置于燒杯中，攪拌溶解，將緩沖液的pH值調(diào)整為7.2。

CT-DNA溶液：稱取10.0 mg小牛胸腺DNA溶解于緩沖溶液中。在260 nm及280 nm處測量其吸光度A，若A260/A280=1.8～1.9，說明其中沒有蛋白質(zhì)，不需進(jìn)一步處理。由公式(1)計算其濃度[18]：

[DNA]=K×A260/6 600 (mol/L)

(1)

式中:K為稀釋倍數(shù)，[DNA]是DNA的濃度。將配制的CT-DNA貯備液放置于4 ℃的冰箱內(nèi)，且放置時間不超過3 d。

1.4.2 電子吸收光譜

用緩沖溶液掃描基線，扣除空白背景。參比池和樣品池中分別加入3.0 mL緩沖溶液和濃度為50 μmol·L-1的配合物溶液，用移液槍往兩池中滴加等量(80 μL)的CT-DNA (2 mmo/L)溶液，使CT-DNA與配合物的濃度比值不斷增加，每次加CT-DNA溶液后，吹打混勻，靜置5 min，在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.4.3 熒光光譜

將8 μmol·L-1溴化乙啶(EB)與10 μmol·L-1的CT-DNA溶液等體積混勻，反應(yīng)12 h。將3.0 mL的EB-CT-DNA溶液加入樣品池中，于激發(fā)波長為565 nm、掃描速度為240 nm·s-1下，測定540～700 nm波長范圍內(nèi)的發(fā)射光譜。向EB-CT-DNA體系中滴加40 μL濃度為1 mmol·L-1的配合物溶液，待其反應(yīng)5 min后，測定其發(fā)射光譜。

1.4.4 黏度實驗

在溫度為(29.0±0.1)℃的恒溫水槽中，使用烏式黏度計測定CT-DNA溶液的黏度。使配合物與CT-DNA的濃度比值[Complex]/[DNA]=0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30。將20.0 mL的200 μmol·L-1的CT-DNA溶液放入黏度計中，用移液槍加入1 × 10-3mol·L-1的200 μL配合物，記錄通過毛細(xì)管的CT-DNA溶液的有效刻度的時間(s)，平行3次實驗，取得平均值，由公式η=(t-t0)/t0進(jìn)行計算CT-DNA溶液的相對黏度，其中t0是緩沖溶液流經(jīng)有效刻度所需時間，t是不同濃度的配合物作用于CT-DNA溶液時流經(jīng)有效刻度所需時間。以(η/η0)1/3(η0為未加配合物時CT-DNA溶液的相對黏度)對[Complex]/[DNA]作圖，得到配合物對CT-DNA黏度影響的變化圖。

1.5 細(xì)胞毒性

將HepG2、HeLa和A549細(xì)胞消化、計數(shù)、配制成濃度為5×104個/mL的細(xì)胞懸液，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液(每孔5×103個細(xì)胞)，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使用完全培養(yǎng)液(90%培養(yǎng)液+10%胎牛血清)分別配制含不同濃度配合物的工作液，混合均勻，每孔加入100 μL相應(yīng)工作液，每種濃度設(shè)置3重復(fù)，細(xì)胞在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h或96 h 后棄上清液，培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1次，將96孔板進(jìn)行CCK-8染色，波長λ=450 nm下，用酶標(biāo)儀測定OD值。

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物的紅外光譜分析

在4 000～500 cm-1范圍內(nèi)測試了原料及配合物的紅外光譜，如圖1和圖2所示。由圖1可以看出，配合物在3 527 cm-1為苯環(huán)質(zhì)子伸縮振動吸收峰，1 667 cm-1為羰基的伸縮振動吸收峰，1 600 cm-1為苯環(huán)的骨架振動吸收峰，1 432 cm-1為苯環(huán)上甲基伸縮運(yùn)動吸收峰，1 040 cm-1為OH…O的面外變形運(yùn)動吸收峰，742 cm-1為苯環(huán)質(zhì)子的面外變形運(yùn)動吸收峰。由圖2可以看出，與原料相比，配合物紅外光譜中某些譜帶發(fā)生了明顯位移，相對強(qiáng)度也有所變化，由此推斷銅離子與配體之間有鍵合作用，形成了配合物。

圖1 配合物紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectrum of the complex

圖2 原料與配合物紅外光譜對比圖Fig.2 Infrared spectra of raw materials and complex

2.2 配合物晶體結(jié)構(gòu)解析

配合物部分鍵長、鍵角列于表2，50%的分子結(jié)構(gòu)如圖3所示，分子堆積圖如圖4所示。

表2 配合物的主要鍵長和鍵角Table 2 Selected bond lengths and bond angles of the complex

圖3 配合物的橢球率50%的晶體結(jié)構(gòu)圖Fig.3 Crystal structure of the complex with 50% thermal ellipsoids

圖4 配合物的晶胞堆積圖Fig.4 Packing structure of the complex

2.3 配合物與CT-DNA相互作用

2.3.1 電子吸收光譜分析

由圖5可看出，隨著CT-DNA的濃度增大，配合物在228 nm處具有減色效應(yīng)，吸收峰位置發(fā)生輕微紫移，由此推測配合物對 CT-DNA 具有插入作用。配合物和DNA的結(jié)合常數(shù)由公式(2)[19]計算得到：

圖5 配合物與CT-DNA作用的電子吸收圖Fig.5 Electron absorption spectra of the complex interacting with DNA

[DNA] /(εa-εf)=[DNA] /(εb-εf)+1/Kb(εb-εf)

(2)

式中：εa是游離配合物的摩爾吸光系數(shù)；εf是沒有與DNA作用時配合物的摩爾吸光系數(shù)；εb是DNA與配合物相互作用飽和時的摩爾吸光系數(shù)；Kb是結(jié)合常數(shù)；[DNA]是DNA的濃度。以C(DNA)/(εa-εf)對C(DNA)作圖，由公式(2)計算得到配合物與DNA的結(jié)合常數(shù)Kb=939.61 L·mol-1。

2.3.2 熒光光譜分析

如圖6所示，EB-CT-DNA在596 nm處有很強(qiáng)的熒光吸收峰。隨著配合物的濃度增大，熒光強(qiáng)度逐漸減小，初始熒光強(qiáng)度從96.43%降到68.11%。配合物與CT-DNA作用模式與EB相似，為經(jīng)典的插入模式。通過公式F0/F=1+Ksv[C](式中F0表示未加入配合物時EB-CT-DNA體系的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)分別表示加入配合物時EB-CT-DNA體系的熒光強(qiáng)度，Ksv表示猝滅常數(shù)，[C]表示配合物濃度)，計算得到Ksv=3.00×103L·mol-1，猝滅速率常數(shù)Kq=3.00×1011L·mol-1·s-1，遠(yuǎn)大于機(jī)理動態(tài)猝滅速率常數(shù)(2×1010L·mol-1)[19]，故配合物對EB-DNA的熒光猝滅是靜態(tài)猝滅。通過公式lg[(F0-F)/F]=lgKa+nlg[C](式中Ka是結(jié)合常數(shù)，n是結(jié)合位點(diǎn))計算得到靜態(tài)猝滅時配合物和CT-DNA結(jié)合速率常數(shù)Ka=5.38×103L·mol-1，結(jié)合位點(diǎn)n=1。

圖6 配合物作用下DNA的熒光圖Fig.6 Fluorescence spectra of DNA interacting with complex

2.3.3 黏度分析

CT-DNA與配合物有經(jīng)典插入和靜電或溝面作用的方式，前者使CT-DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)改變而增加其黏度，后兩者對CT-DNA黏度幾乎不改變[20]。由圖7可看出，隨著配合物濃度增大，CT-DNA的黏度增大，表明配合物以經(jīng)典插入的方式與CT-DNA結(jié)合。

圖7 配合物作用下CT-DNA的黏度圖Fig.7 Viscosity of CT-DNA interacting with complex

2.4 細(xì)胞毒性

由圖8(a)可計算出，配合物{[Cu(OMBA)2]2·(DMF)2}對胃癌細(xì)胞A549、宮頸癌細(xì)胞Hela及肝癌細(xì)胞HepG2作用48 h后細(xì)胞的IC50值分別為156.2 μmol/L、187.8 μmol/L、62.93 μmol/L。由表3可知，配合物對A549、Hela和HepG2細(xì)胞具有抗增殖作用，但是在相同條件下，抗增殖作用比順鉑差，但是比文獻(xiàn)報道的非銅配合物效果好[21]?？乖鲋吵潭染哂袧舛群蜁r間依賴性，即劑量越大、藥物作用時間越長，則對三種癌細(xì)胞的抑制率越高。

圖8 (a)配合物作用48 h后對HepG2、HeLa、A549細(xì)胞增殖的影響;(b)～(d)配合物對A549、Hela、HepG2在不同時間下對細(xì)胞增殖的影響Fig.8 (a)Effects of the complex on HepG2,HeLa,and A549 cell viability and proliferation after 48 h exposure;(b)～(d)time gradient of effects of the complex on A549,HeLa,and HepG2 cell viability and proliferation

表3 配合物的對A549、Hela和HepG2細(xì)胞的毒性Table 3 IC50 of the complex against A549,Hela,and HepG2 cell

3 結(jié) 論