唐惠蘭，李?yuàn)檴櫍屐`，江 焱，唐嬌嬌，林翰文，胡 光

(重慶理工大學(xué) 藥物化學(xué)與分子藥理學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400054)

1 研究背景

根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，在全球所有的致死病因中，由心腦血管疾病引起的死亡數(shù)量排第一位，全球每年死于心腦血管疾病的人數(shù)約有1 750萬[1]；在我國，每年的死亡人數(shù)高達(dá)260萬左右，發(fā)病率在0.38%～10%[2]。血栓(血管內(nèi)皮表面形成的塊狀物)是導(dǎo)致心腦血管疾病的主要病因，誘發(fā)血栓形成的主要因素有原發(fā)性因素和繼發(fā)性因素2種。動(dòng)脈血栓的形成多為血小板活化和發(fā)生聚集反應(yīng)，而深靜脈血栓是靜脈血栓常見的癥狀，其形成機(jī)制主要是血管壁異常、血流變緩或減少、促血栓形成因子增加等[3]。

近年來，關(guān)于抗血栓性疾病藥物的基礎(chǔ)性研究中，基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)平臺(tái)探究深靜脈血栓的形成是一種常見的研究方法，主要用來進(jìn)行抗血栓藥物的篩選。目前，關(guān)于抗血栓藥物的開發(fā)，抗血小板聚集藥物、抗凝血藥物和溶血栓藥物是3個(gè)常見的藥物開發(fā)種類及研究方向。已上市的抗血栓類西藥主要有阿司匹林、氯吡格雷、替格瑞洛等，其中阿司匹林是第一代抗血小板聚集藥，具有較為穩(wěn)定的抗血栓活性，常在實(shí)驗(yàn)中被用作抗血栓研究的陽性對(duì)照藥。而中藥研究中常見的抗血栓藥物主要包括丹參、水蛭、當(dāng)歸、虎杖、川芎、郁金、延胡索、紅花、三棱、莪術(shù)等。藁本內(nèi)酯(ligustilide，LIG，其結(jié)構(gòu)式如圖1)是當(dāng)歸的主要活性成分，研究顯示，它能很好地改善血液微循環(huán)，有助于平滑肌運(yùn)動(dòng)，抑制血管新生[4]，在整個(gè)心腦血管及循環(huán)系統(tǒng)中能發(fā)揮較強(qiáng)的藥理作用，是典型的抗栓藥物之一。

圖1 藁本內(nèi)酯(LIG)結(jié)構(gòu)式

斑馬魚是繼大鼠和小鼠后的世界第三大模式動(dòng)物，其基因測(cè)序已基本完成，被廣泛地應(yīng)用于各種體內(nèi)(in vivo)實(shí)驗(yàn)的研究。傳統(tǒng)的深靜脈血栓形成研究通常以家兔、犬等動(dòng)物為對(duì)象，對(duì)其組織器官進(jìn)行病理學(xué)分析。與傳統(tǒng)的動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)Ｐ拖啾?，斑馬魚具有體積小、預(yù)測(cè)性好、實(shí)驗(yàn)成本低、周期短、可比度高等優(yōu)勢(shì)；此外，斑馬魚與人類基因組的同源程度高[5-6]，在基因水平上，與人類基因組可以達(dá)到87%的相似度[7-8]，在胚胎早期的心血管系統(tǒng)的發(fā)育和人類極其相似，且與人類血液系統(tǒng)的凝血因子和血小板有諸多共同點(diǎn)[9-10]，因此用斑馬魚進(jìn)行試驗(yàn)可以模擬人類血栓的發(fā)病過程，得到的結(jié)果在一定程度上適用于人體。當(dāng)前對(duì)于斑馬魚血栓模型的研究中，以尾靜脈部位的血栓構(gòu)建為主，同時(shí)利用拍照、軟件處理等方法進(jìn)行結(jié)果分析[11]。

綜上所述，采用斑馬魚胚胎構(gòu)建藥物誘導(dǎo)的血栓模型并對(duì)相應(yīng)的評(píng)價(jià)方法加以優(yōu)化，能夠?yàn)楹罄m(xù)的藥物開發(fā)提供高通量篩選的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。本研究在優(yōu)化了相應(yīng)誘導(dǎo)劑給藥參數(shù)的基礎(chǔ)上，以阿司匹林為陽性對(duì)照藥，研究了LIG的斑馬魚體內(nèi)抗血栓作用，為抗血栓體內(nèi)模型的開發(fā)及LIG的抗血栓活性驗(yàn)證提供了數(shù)據(jù)參考。

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用斑馬魚購自上海費(fèi)曦生物科技有限公司，品系為野生型AB系，飼養(yǎng)于本實(shí)驗(yàn)室循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中。成年斑馬魚的養(yǎng)殖方法參照國家斑馬魚資源中心(CZRC)的相關(guān)規(guī)定，環(huán)境溫度控制在25～28 ℃，光照時(shí)間為14 h，黑暗時(shí)間為10 h。產(chǎn)卵雌魚和雄魚比為1∶2。

2.2 主要試劑和儀器

LIG，購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；苯肼(PH)、(±)-腎上腺素鹽酸鹽(AH)、3-3’-二甲氧基聯(lián)苯胺、阿司匹林購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；全自動(dòng)智能型霉菌培養(yǎng)箱；尼康E100雙目光學(xué)顯微鏡；Olympus正置熒光顯微鏡成像系統(tǒng)。

2.3 鄰聯(lián)茴香胺染色方法

用3-3′二甲氧基聯(lián)苯胺、無水乙醇、雙氧水、無水乙酸鈉配制鄰聯(lián)茴香胺染色液，斑馬魚胚胎經(jīng)過誘導(dǎo)劑和給藥處理后，轉(zhuǎn)移至鄰聯(lián)茴香胺染色液中避光染色一定時(shí)間(不同染色時(shí)間見表2、4)，染色處理完成后吸出染色液，用適量DMSO迅速清洗3次，在熒光顯微鏡下拍照并保存圖片。

2.4 PH誘導(dǎo)斑馬魚血栓模型相關(guān)參數(shù)的優(yōu)化

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)考察分析，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化PH誘導(dǎo)斑馬魚血栓模型的4個(gè)相關(guān)參數(shù)：PH濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、染色時(shí)間、魚齡。4個(gè)參數(shù)的具體選擇情況如表1所示：PH的濃度水平為0.75、1.5、3.0 μmol/L，血栓誘導(dǎo)時(shí)間水平為18、24、30 h；鄰聯(lián)茴香胺染液染色時(shí)間為25、30、35 min；魚齡水平為2、3、4 dpf。在斑馬魚胚胎發(fā)育至1 dpf時(shí)，向斑馬魚胚胎培養(yǎng)皿中加入0.2 mmol/L的1-苯基-2硫脲(PTU)處理24 h以抑制黑色素形成。在培養(yǎng)環(huán)境下選取生理狀況正常、活潑性好的幼魚進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并將其隨機(jī)放置于24孔板中，每孔放置10條，設(shè)置1個(gè)空白組(胚胎培養(yǎng)水)、1個(gè)溶劑組(0.1 %乙醇)、9個(gè)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組，取不同親本斑馬魚重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，正交實(shí)驗(yàn)組設(shè)計(jì)如表2所示。

表1 PH誘導(dǎo)斑馬魚血栓模型參數(shù)優(yōu)化的正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 PH誘導(dǎo)斑馬魚血栓模型參數(shù)優(yōu)化的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表

2.5 AH誘導(dǎo)斑馬魚血栓模型相關(guān)參數(shù)的優(yōu)化

AH正交實(shí)驗(yàn)方法采用與2.4節(jié)中類似的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取AH濃度為7.5、15、30 μmol/L；血栓誘導(dǎo)時(shí)間為12、16、20 h；鄰聯(lián)茴香胺染液染色時(shí)間為25、30、35 min；斑馬魚的不同魚齡為2、3、4 dpf，如表3所示。正交實(shí)驗(yàn)四因素三水平表設(shè)計(jì)如表4所示。

表3 AH誘導(dǎo)斑馬魚血栓模型參數(shù)優(yōu)化的正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表4 AH誘導(dǎo)斑馬魚血栓模型參數(shù)優(yōu)化的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表

2.6 LIG對(duì)斑馬魚血栓的作用探究

2.6.1LIG對(duì)PH誘導(dǎo)斑馬魚血栓的干預(yù)

在向1 dpf的斑馬魚胚胎加入0.2 mmol/L的PTU處理1 d后，選取生理狀況、活動(dòng)狀況優(yōu)良的2 dpf幼魚胚胎，隨機(jī)放置于24孔板中，每組10條。設(shè)置6個(gè)實(shí)驗(yàn)組：空白對(duì)照組，誘導(dǎo)劑(PH)組，陽性對(duì)照(PH+阿司匹林)組，LIG藥物組(PH+20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L LIG)。其中，在斑馬魚處于48 hpf時(shí)，誘導(dǎo)劑組用0.75 μmol/L苯肼誘導(dǎo)24 h，陽性對(duì)照組于42 hpf時(shí)，加入22.5 mg/L阿司匹林6 h，再用苯肼誘導(dǎo)24 h；LIG藥物組在27 hpf時(shí)給藥21 h后，再用苯肼誘導(dǎo)24 h。取不同親本幼魚重復(fù)試驗(yàn)3次，拍照保存染色結(jié)果圖。

2.6.2LIG對(duì)AH誘導(dǎo)斑馬魚血栓的干預(yù)

實(shí)驗(yàn)方法與2.6.1中的類似，設(shè)置6個(gè)實(shí)驗(yàn)組：空白對(duì)照組，誘導(dǎo)劑(AH)組，陽性對(duì)照(AH+阿司匹林)組，LIG藥物組(AH+20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L LIG)。其中，在斑馬魚處于48 hpf時(shí)，誘導(dǎo)劑組用15 μmol/L鹽酸腎上腺素誘導(dǎo)16 h；陽性對(duì)照組處于42 hpf時(shí)，加入22.5 mg/L阿司匹林6 h后，用鹽酸腎上腺素誘導(dǎo)16 h；LIG藥物組在27 hpf時(shí)，給藥21 h后用鹽酸腎上腺素誘導(dǎo)16 h，其余實(shí)驗(yàn)操作方法與2.6.1相同。

2.7 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理

尾部血栓定量分析：藥物誘導(dǎo)使斑馬魚尾部血流發(fā)生聚集現(xiàn)象，因而生成血栓；采用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)已拍照的圖片進(jìn)行尾部染色面積計(jì)算，通過尾部染色面積S定量分析血栓形成情況；統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果需采用SPSSAU project(2020)進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和分析，2組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 藥物誘導(dǎo)斑馬魚血栓模型參數(shù)優(yōu)化的結(jié)果

3.1.1PH正交實(shí)驗(yàn)

對(duì)PH的正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析，如表5所示，極差：誘導(dǎo)時(shí)間>染色時(shí)間>PH濃度>魚齡，說明PH誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)斑馬魚尾部血栓形成具有最重要的影響，其次是染色時(shí)間，而PH濃度和魚齡對(duì)尾部血栓的影響較小且兩者比較接近。根據(jù)表中均值K的數(shù)據(jù)可知，PH誘導(dǎo)的最優(yōu)條件為PH濃度0.75 μmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間24 h，染色時(shí)間35 min，魚齡2 dpf。

表5 PH正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.2AH正交實(shí)驗(yàn)

對(duì)AH正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果所得數(shù)據(jù)的極差分析可得，極差：魚齡>AH濃度>誘導(dǎo)時(shí)間>染色時(shí)間，即影響斑馬魚血栓形成的主要因素是魚齡和AH濃度，染色時(shí)間和誘導(dǎo)時(shí)間次之。根據(jù)各因素的均值K可知，AH最佳誘導(dǎo)條件是濃度15 μmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間16 h，染色時(shí)間30 min，魚齡4 dpf，如表6所示。

表6 AH正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2 LIG抑制斑馬魚血栓形成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1以PH為誘導(dǎo)劑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖2所示，與空白對(duì)照組相比，誘導(dǎo)劑組心臟染色強(qiáng)度降低而尾部染色增強(qiáng)，說明尾部血流出現(xiàn)聚集現(xiàn)象而形成血栓，PH試劑誘導(dǎo)斑馬魚血栓建模成功；由統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(圖3)可知，陽性對(duì)照組及20 μmol/L與40 μmol/L的LIG給藥組的斑馬魚尾部染色強(qiáng)度與誘導(dǎo)劑組相比，都呈現(xiàn)出了顯著差異(P<0.05)，說明阿司匹林和20 μmol/L與40 μmol/L的LIG能夠有效降低PH誘導(dǎo)的斑馬魚血栓形成；60 μmol/L的LIG給藥組與誘導(dǎo)劑組相比沒有顯著性差異。具體情況如下：加入阿司匹林的陽性對(duì)照組比誘導(dǎo)劑組的尾部染色面積小，且心臟染色面積有部分增加；加入LIG的給藥組與誘導(dǎo)劑組相比，20 μmol/L和40 μmol/L的LIG能明顯(P<0.001)減少斑馬魚尾部血栓形成的面積，心臟染色面積明顯增強(qiáng)；20 μmol/L和40 μmol/L LIG給藥組2組間抗血栓效果無明顯差異；而60 μmol/L LIG給藥組與誘導(dǎo)劑組相比，斑馬魚尾部血栓形成的面積沒有顯著性差異。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LIG 20 μmol/L和40 μmol/L給藥組的尾部血栓面積也顯著性低于陽性對(duì)照組，但由于LIG與阿司匹林的給藥濃度、時(shí)長等參數(shù)不同，所以無法進(jìn)一步比較哪種藥物抑制斑馬魚尾部血栓面積效果更好。綜上所述，20 μmol/L和40 μmol/L LIG能夠顯著降低PH誘導(dǎo)的斑馬魚尾部血栓形成。圖2中(A1)～(A4)分別為空白對(duì)照組，PH誘導(dǎo)劑組，陽性對(duì)照組，40 μmol/L LIG給藥組；(B1)～(B4)分別為空白對(duì)照組，PH誘導(dǎo)劑組，陽性對(duì)照組，40 μmol/L LIG給藥組。

圖2 PH誘導(dǎo)的斑馬魚血栓模型各組染色效果圖

注：與誘導(dǎo)劑組相對(duì)比，***P<0.001；與陽性對(duì)照組相比，ΔΔP<0.01

3.2.2以AH為誘導(dǎo)劑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖4所示，與空白對(duì)照組相比，誘導(dǎo)劑組的斑馬魚心臟染色強(qiáng)度降低而尾部染色增強(qiáng)，說明在斑馬魚尾部形成血栓，AH誘導(dǎo)的斑馬魚血栓模型建模成功；同3.2.1統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析(圖5)，陽性對(duì)照組及20 μmol/L與40 μmol/L的LIG給藥組的斑馬魚尾部染色強(qiáng)度與誘導(dǎo)劑組相比，都呈現(xiàn)出了顯著性差異(P<0.05)，說明阿司匹林和20 μmol/L與40 μmol/L的LIG都能有效降低AH誘導(dǎo)的斑馬魚血栓形成。

注：與誘導(dǎo)劑組相比，***P<0.001；與陽性對(duì)照組相比，ΔP<0.05

圖4 AH誘導(dǎo)的斑馬魚血栓模型各組染色效果圖

具體情況如下：加入阿司匹林的陽性對(duì)照組比誘導(dǎo)劑組的斑馬魚尾部染色面積小，心臟染色面積增加；加入LIG的給藥組與誘導(dǎo)劑組相比，20 μmol/L和40 μmol/L的LIG給藥組能顯著(P<0.001)減少斑馬魚尾部的血栓形成面積，增加心臟染色面積，而20 μmol/L和40 μmol/L LIG給藥組之間抗血栓效果并無顯著性差異；60 μmol/L LIG給藥組與誘導(dǎo)劑組相比無顯著性差異。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:40 μmol/L的LIG給藥組的尾部血栓面積顯著(P<0.05)低于陽性對(duì)照組，但由于LIG與阿司匹林的給藥濃度、時(shí)長等參數(shù)不同，所以無法進(jìn)一步比較在該模型中哪種藥物抑制斑馬魚尾部血栓面積效果更好。綜上所述，20 μmol/L和40 μmol/L LIG在AH誘導(dǎo)的斑馬魚血栓模型中，能顯著抑制血栓的形成。(A1)～(A4)分別為空白對(duì)照組，AH誘導(dǎo)劑組，陽性對(duì)照組，40 μmol/L LIG給藥組；(B1)～(B4)分別為空白對(duì)照組，AH誘導(dǎo)劑組，陽性對(duì)照組，40 μmol/L LIG給藥組。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)試劑誘導(dǎo)法，利用PH的強(qiáng)氧化作用[12]對(duì)血管造成損傷和AH的刺激血小板高度異常聚集作用[13]，誘導(dǎo)斑馬魚血栓的形成，并在4 d內(nèi)完成藥物的抗血栓作用。實(shí)驗(yàn)所用斑馬魚魚齡小、藥物吸收快、觀察方便，相較于在傳統(tǒng)大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上采用物理、化學(xué)等方法建立血栓模型而言，血栓形成時(shí)間更短，節(jié)約研究時(shí)間。

在實(shí)驗(yàn)過程中，可以觀察到加入誘導(dǎo)劑后的斑馬魚活動(dòng)狀態(tài)逐漸變差，心臟血流速度減緩；由斑馬魚血栓模型誘導(dǎo)參數(shù)結(jié)果分析可知，PH誘導(dǎo)18 h、AH誘導(dǎo)12 h時(shí)，在顯微鏡下能直接觀察到斑馬魚尾部有明顯的血栓形成，且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，血栓形成數(shù)量先增加后減少，心臟染色強(qiáng)度與尾部血栓形成情況相反[14]，這與國家專利(國家專利號(hào)：201110126427.2)報(bào)道的結(jié)果相符[15]。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，通過對(duì)PH和AH誘導(dǎo)濃度的篩選試驗(yàn)結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)部分較高濃度的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的血栓形成效果不及較低濃度，如0.75 μmol/L的PH誘導(dǎo)效果優(yōu)于3 μmol/L的PH誘導(dǎo)效果，15 μmol/L的AH誘導(dǎo)效果比30 μmol/L誘導(dǎo)效果更好，這些都可能與誘導(dǎo)劑濃度過高可能引起斑馬魚生理狀態(tài)大幅改變相關(guān)。

本課題組還在預(yù)實(shí)驗(yàn)中對(duì)PTU的給藥時(shí)長進(jìn)行了考察，即在加入PTU后，觀察斑馬魚表面黑色素抑制的恢復(fù)情況。96 hpf時(shí)，黑色素基本沒有恢復(fù)，104 hpf時(shí)，在魚的第一背鰭和第二背鰭附近開始有明顯的黑色素恢復(fù)，120 hpf時(shí)，在魚的背部生成大面積黑色素。因此實(shí)驗(yàn)中選用的斑馬魚胚胎不宜超過4 dpf，以減輕黑色素的恢復(fù)對(duì)實(shí)驗(yàn)觀察的影響，這也是本研究在AH誘導(dǎo)斑馬魚血栓模型組的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化參數(shù)中，雖然得到了魚齡為4 dpf為最優(yōu)參數(shù)，但在LIG的給藥實(shí)驗(yàn)中，依然選擇在2 dpf附近的時(shí)期進(jìn)行給藥的原因之一；另一個(gè)原因是考慮到斑馬魚作為高通量篩選模型，時(shí)間短、篩選效率高，因此最后還是選擇了2 dpf左右作為實(shí)際LIG的給藥處理時(shí)期，以縮短試驗(yàn)周期，體現(xiàn)高通量的特色。

LIG能對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用[16]，因此針對(duì)本實(shí)驗(yàn)2種誘導(dǎo)劑構(gòu)建的血栓模型能產(chǎn)生一定作用效果。據(jù)有關(guān)報(bào)道，LIG在10 μmol/L的低濃度下作用效果不佳，而80 μmol/L濃度時(shí)對(duì)斑馬魚會(huì)產(chǎn)生一定毒性，100 μmol/L濃度就能抑制魚卵孵化、影響魚體形態(tài)發(fā)育[17]。在本實(shí)驗(yàn)中，20 μmol/L和40 μmol/L LIG對(duì)斑馬魚尾部血栓有顯著抑制作用，然而在濃度為60 μmol/L時(shí)，有些斑馬魚已經(jīng)開始出現(xiàn)游動(dòng)緩慢、尾巴彎曲、心臟水腫，甚至死亡等現(xiàn)象(死亡率30%～40%)，體現(xiàn)出了較大的毒性作用，這也可能是由于60 μmol/L的LIG的抗血栓效果不如20、40 μmol/L的LIG。

綜上所述，本研究采用PH和AH通過損傷斑馬魚血管內(nèi)皮表面誘導(dǎo)血栓模型，通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)找到了建立模型的誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、染色時(shí)間、魚齡的最佳參數(shù)；同時(shí)通過該模型發(fā)現(xiàn)20 μmol/L和40 μmol/L的LIG在斑馬魚體內(nèi)具有一定的抗血栓效果，對(duì)采用斑馬魚模型評(píng)價(jià)藥物的抗血栓活性及LIG的體內(nèi)抗血栓研究提供了一定的數(shù)據(jù)支持。