陳婉珍，劉 翔，嚴(yán)展鵬，王震凱

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院，江蘇 南京 210022；2. 江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇 南京 210028)

慢性萎縮性胃炎是消化系統(tǒng)常見的難治性疾病，據(jù)最新全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，胃癌在全球癌癥死亡率及中國癌癥發(fā)病率中均高居第三位[1]。胃黏膜癌前狀態(tài)(萎縮和腸化生)和癌前病變(上皮內(nèi)瘤變)是在胃癌篩查中常見的胃黏膜病變，其中明確慢性萎縮胃炎發(fā)病的分子機(jī)制對早期胃癌的防治具有重要意義。研究認(rèn)為，Wnt/β-catenin信號通路是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖等過程的一條重要的保守通路，其在多種疾病的發(fā)生過程中均發(fā)揮著關(guān)鍵作用[2-3]。本實(shí)驗擬通過甲基硝基亞硝基胍(MNNG)為主要致病因素的綜合造模法建立慢性萎縮性胃炎大鼠模型，觀察大鼠胃組織中Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，以闡明慢性萎縮性胃炎發(fā)病與該信號通路密切相關(guān)的分子機(jī)制，為進(jìn)一步探究緩解及逆轉(zhuǎn)慢性萎縮性胃炎的療效機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗材料與方法

1.1實(shí)驗動物 健康清潔級SD大鼠40只，體重(220±20)g，購自南通大學(xué)，動物合格證號：SCXK(蘇)2017-0011。大鼠飼養(yǎng)于江蘇省中醫(yī)藥研究院SPF級動物實(shí)驗中心，中央空調(diào)下架式分籠飼養(yǎng)，每籠5只。實(shí)驗開始前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，環(huán)境溫度22～26 ℃，濕度50%～60%，實(shí)驗環(huán)境每12 h光暗循環(huán)。

1.2主要試劑 甲基硝基亞硝基胍(MNNG)購自日本東京化成工業(yè)株式會社；鹽酸雷尼替丁購自宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司；蘇木素和伊紅染液購自武漢博士德生物工程有限公司；羊抗兔二抗、抗大鼠Wnt-1、GSK-3β、P-β-catenin、LEFs、Cyclin D1及MMP-7 抗體均購自美國CST公司；含0.03%雷尼替丁顆粒狀大鼠飼料由南京安立默科技有限公司代生產(chǎn)[蘇A飼生字(2002)503]。

1.3實(shí)驗儀器 生物組織自動脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)及生物組織攤烤片機(jī)購自湖北定源醫(yī)用材料有限責(zé)任公司；全波長酶標(biāo)儀購自美國Thermo；CKX31倒置生物顯微鏡購自日本Olimpus公司；圖像分析系統(tǒng)購自德國LEICA公司。

1.4分組及造模方法 將40只清潔級SD大鼠隨機(jī)分為空白組10只和慢性萎縮性胃炎組30只。空調(diào)下架式分籠飼養(yǎng)，空白組大鼠予自由飲用清潔水，進(jìn)食普通顆粒狀SPF級飼料。慢性萎縮性胃炎組大鼠參照文獻(xiàn)[4-5]方法進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整進(jìn)行造模：大鼠自由飲用150 μg/mL MNNG溶液(提前配置1 g/L MNNG母液，避光冷藏保存，每日臨用時稀釋為150 μg/mL溶液裝于包裹避光紙的飲水瓶中)，每日更換1次，造模期間不予其他飲水；進(jìn)食含0.03%雷尼替丁顆粒狀飼料，同時配合饑飽失常(每進(jìn)食2 d禁食1 d)。每4周處死5只模型組大鼠觀察造模情況，干預(yù)20周確認(rèn)建立慢性萎縮性胃炎大鼠模型結(jié)束。

1.5觀察指標(biāo)及方法

1.5.1一般情況及體重 實(shí)驗過程中記錄2組大鼠反應(yīng)靈敏度、動作靈活性、毛色、體型及大便情況，每4周稱量1次體重。

1.5.2胃組織病理形態(tài) 造模結(jié)束后麻醉大鼠，剖開腹腔，充分暴露全胃，于距賁門及幽門0.5～1.0 cm處離斷，取出全胃，沿胃大彎側(cè)切開并展平，觀察胃黏膜大體形態(tài)。剪取胃竇及胃體部約0.5 cm×0.5 cm大小組織2塊，用10%福爾馬林溶液固定后，使用生物組織自動脫水機(jī)脫水、透明，石蠟包埋，石蠟切片機(jī)進(jìn)行切片(厚度為5 μm)。用鑷子平鋪切片于45 ℃水中，載玻片撈片中段，烤片3 h，將制備的石蠟切片放入37 ℃溫箱12 h，進(jìn)行HE染色，滴加中性樹膠，蓋玻片封片，光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠胃組織的病理形態(tài)。

1.5.3胃組織中P-β-catenin、LEFs及Cyclin D1蛋白表達(dá)及分布情況 造模20周后，采用免疫組織化學(xué)法(IHC)檢測：取制備好的石蠟切片，放入二甲苯、乙醇及蒸餾水中進(jìn)行組織脫蠟；將切片放入切片架置于不銹鋼罐中，用檸檬酸鈉抗原修復(fù)液煮沸10 min進(jìn)行抗原修復(fù)；將玻片放于免疫組化盒內(nèi)后用油性筆(PAP Pen)畫圈，PBS沖洗，滴加一抗使之充分浸潤，放入4 ℃冰箱過夜；取出免疫組化盒，室溫放置30 min，PBS沖洗玻片，洗掉一抗，滴加二抗；滴加DAB顯色液，觀察顯色至棕褐色時，入水停止顯色反應(yīng)；沖洗掉DAB顯色液，蘇木素60 s復(fù)染，分化液作用4～5 s，沖洗后入溫水反藍(lán)襯染；乙醇進(jìn)行脫水，二甲苯進(jìn)行脫蠟，封片。 在顯微鏡下，每一組蛋白均手動調(diào)節(jié)曝光和增益值在同一環(huán)境，隨機(jī)選取5個視野采集照片，采用Image J圖像分析軟件，選擇常用指標(biāo)參數(shù)陽性面積比分析P-β-catenin、LEFs及Cyclin D1蛋白表達(dá)及分布情況。

1.5.4胃組織中Wnt-1、GSK-3β及MMP-7蛋白表達(dá)情況 造模20周后，采用Western blot法檢測：取-80 ℃冰箱凍存胃組織，放入預(yù)冷的研缽中加入液氮進(jìn)行快速研磨，加入Western及IP細(xì)胞裂解液，超聲細(xì)胞破碎儀及離心機(jī)處理后取上清，加入loading buffer后煮沸保存。蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液將蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶解，在96孔板內(nèi)滴加標(biāo)準(zhǔn)品及樣本，加入BCA工作液，酶標(biāo)儀測定A562波長的吸光度并計算，進(jìn)行蛋白濃度測定。配制SDS-PAGE 10%分離膠及5%濃縮膠；電泳：上清煮沸并離心，點(diǎn)樣，配電泳液進(jìn)行電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)跑到膠板底時，停止電泳；轉(zhuǎn)膜：現(xiàn)配1×轉(zhuǎn)膜液，整套轉(zhuǎn)膜裝置于轉(zhuǎn)膜液中浸泡處理，去除上層濃縮膠后置于轉(zhuǎn)移槽中進(jìn)行冰水轉(zhuǎn)膜；5%奶粉中進(jìn)行封閉；參照marker蛋白紅線，去掉兩層護(hù)卡膜，將膜夾入長盒中，方格中提前放置一抗孵育過夜；加二抗與一抗結(jié)合；掃膜，分析。

2 結(jié) 果

2.12組大鼠一般情況及體重比較 空白組大鼠反應(yīng)靈敏，動作靈活，毛色光滑、亮白，體型肥胖，大便呈正常顆粒狀，體重增長迅速；慢性萎縮性胃炎組大鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡，喜臥扎堆，活動減少，皮毛稀疏且毛色發(fā)黃、光澤度差，大便時呈溏稀或不成形狀態(tài)，體重增長相對緩慢，16周后體重呈緩慢上升及平穩(wěn)趨勢，且造模12周、16周、20周的體重均明顯低于空白組(P均<0.05)。見表1。

表1 2組大鼠不同時間點(diǎn)體重比較

2.22組大鼠胃組織病理表現(xiàn) 空白組大鼠胃黏膜腺體形狀規(guī)則、排列緊密，上皮層次完整，細(xì)胞排列緊密、整齊。造模20周后，慢性萎縮性胃炎組大鼠胃黏膜變薄、缺失，腺體明顯減少、結(jié)構(gòu)紊亂，胃小凹延長、扭曲，可見杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞或異性細(xì)胞；黏膜肌層增厚，甚或向胃黏膜固有層呈樹枝樣延伸。見圖1及圖2。

圖1 空白組大鼠胃組織病理形態(tài)(HE染色，×100)

圖2 慢性萎縮性胃炎組大鼠胃組織病理形態(tài)(HE染色，×200)

2.32組大鼠胃組織中P-β-catenin、LEFs、Cyclin D1蛋白分布及表達(dá)情況 P-β-catenin陽性信號主要位于細(xì)胞質(zhì)，空白組呈顆粒狀深紫色，模型組呈紫色，模型組P-β-catenin陽性面積比明顯低于空白組(P<0.05)。LEFs陽性信號主要位于細(xì)胞核內(nèi)，空白組呈紫棕色顆粒狀，模型組呈深紫褐色，模型組LLEFs陽性面積比明顯高于空白組(P<0.05)。Cyclin D1陽性信號主要位于細(xì)胞核內(nèi)，空白組呈棕褐色，模型組呈深棕褐色，模型組Cyclin D1陽性面積比明顯高于空白組(P<0.05)。見圖3及表2。

圖3 2組大鼠胃組織中P-β-catenin、LEFs、Cyclin D1蛋白表達(dá)及分布情況(免疫組化染色，×200)

表2 2組大鼠胃組織中P-β-catenin、LEFs、Cyclin D1陽性面積比

2.42組大鼠胃組織中Wnt-1、GSK-3β及MMP-7蛋白表達(dá)情況 慢性萎縮性胃炎組大鼠胃組織中Wnt-1和MMP-7蛋白相對表達(dá)量明顯高于空白組(P<0.05)，GSK-3β蛋白相對表達(dá)量明顯低于空白組(P<0.05)。見圖4。

圖4 2組大鼠胃組織中Wnt-1、GSK-3β及MMP-7蛋白表達(dá)情況

3 討 論

慢性萎縮性胃炎是臨床常見的慢性胃部疾病，其發(fā)生機(jī)制尚不明確，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對該病以對癥治療及定期內(nèi)鏡隨訪為主，缺乏更優(yōu)效的治療方案[6]。中醫(yī)藥在慢性萎縮性胃炎的治療方面具有一定優(yōu)勢，通過中醫(yī)思路的診療，可有效改善患者臨床癥狀，且可逆轉(zhuǎn)輕、中度萎縮及局灶性腸化生等病理改變[7]；對于重度萎縮及低級別上皮內(nèi)瘤變者，可達(dá)到減輕病變程度及延緩病情進(jìn)展的效果[8]。

目前研究顯示，Wnt/β-catenin信號通路在胃癌發(fā)生、胃黏膜損傷修復(fù)等過程中均發(fā)揮關(guān)鍵作用[9-10]。一般情況下，Wnt信號處于未激活狀態(tài)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成Axin/GSK-3/APC復(fù)合物，CK1及GSK-3等對β-catenin殘基進(jìn)行磷酸化后由泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解。而在一定條件下，Wnt蛋白家族與細(xì)胞膜上的Frizzled、LRP 5/6受體結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)Dvl蛋白激活并磷酸化，抑制GSK-3蛋白活性，從而干擾胞質(zhì)內(nèi)Axin/GSK-3/APC/β-catenin復(fù)合物形成，導(dǎo)致β-catenin不能磷酸化而降解，故β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)富集后進(jìn)入細(xì)胞核，與LEF/TCF結(jié)合后激活下游的轉(zhuǎn)錄過程，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖等過程[11-12]。Wnt-1蛋白是該信號通路上游重要的蛋白，張曉峰等[13]研究顯示，在胃癌組織中Wnt-1蛋白異常高表達(dá)，且與胃癌組織的癌灶大小、分化程度以及浸潤深度等均有一定關(guān)系，認(rèn)為其可作為評價胃癌病情及預(yù)后的參考指標(biāo)之一。Wang等[14]報道，Wnt拮抗基因APC、SFRP1、WIF-1、DKK-1等的高甲基化狀態(tài)與胃癌有一定關(guān)系，且可能與慢性萎縮性胃炎的發(fā)生相關(guān)。

本實(shí)驗結(jié)果顯示，以MNNG為主要致病因素的綜合造模法可成功建立慢性萎縮性胃炎大鼠模型；慢性萎縮性胃炎大鼠胃組織中P-β-catenin蛋白陽性信號主要位于細(xì)胞質(zhì)，通路下游LEFs及Cyclin D1蛋白陽性信號主要位于細(xì)胞核內(nèi)，且胃組織中β-catenin蛋白陽性面積比和GSK-3β蛋白相對表達(dá)量均明顯降低，LEFs及Cyclin D1蛋白陽性面積比和Wnt-1、MMP-7蛋白相對表達(dá)量均明顯增加。說明慢性萎縮性胃炎大鼠的發(fā)病與Wnt/β-catenin信號通路密切相關(guān)，為慢性萎縮性胃炎的療效機(jī)制研究提供了一定思路和科學(xué)基礎(chǔ)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。