楊 磊,袁星星,李 瑩,王炳予,劉成祥,戰(zhàn)晶玉,郭雪瑩,劉長(zhǎng)發(fā)

(1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150006；2. 黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院南崗分院，黑龍江 哈爾濱 150006；3. 黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院三輔分院，黑龍江 哈爾濱 150036；4. 黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥研究所，黑龍江 哈爾濱 150036)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)作為一種常見(jiàn)的臨床病理綜合征，以肝細(xì)胞脂肪變性、脂質(zhì)蓄積和肝小葉內(nèi)空泡形成為主要特征。根據(jù)超聲表現(xiàn)可將NAFLD分為輕、中、重度，輕度患者可無(wú)任何臨床癥狀，部分患者可感到體倦乏力、厭食油膩，中、重度患者可出現(xiàn)食欲不佳、惡心、嘔吐、右上腹隱痛等臨床癥狀[1]。NAFLD包括非酒精性肝脂肪變、非酒精性脂肪性肝炎及其在此基礎(chǔ)上進(jìn)展而成的肝纖維化、肝硬化及肝細(xì)胞癌[2]。一項(xiàng)2016年的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，NAFLD已成為全球最常見(jiàn)的慢性疾病之一，普通成年人的患病率為6.3%～45%[3]，有效治療NAFLD已被當(dāng)代醫(yī)學(xué)列為亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。益氣健脾湯是治療NAFLD的臨床經(jīng)驗(yàn)方，前期研究顯示其具有抗炎、保肝、抑制脂質(zhì)蓄積作用[4-5]，但是其改善NAFLD糖脂代謝的具體機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)檢測(cè)肝臟組織中腺苷單磷酸活化蛋白激酶(AMPK)/固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)的表達(dá)情況，進(jìn)一步探索益氣健脾湯對(duì)肝臟糖脂代謝的調(diào)控機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只C57BL/6J小鼠，購(gòu)自黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證編號(hào)：SYXK(黑)2016-008。實(shí)驗(yàn)所有操作流程均嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(24±2)℃，相對(duì)濕度為50%～70%，光照12 h明暗交替，常規(guī)喂養(yǎng)和自由飲水。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 益氣健脾湯，組方：生黃芪15 g、丹參10 g、三七5 g、女貞子8 g、墨旱蓮8 g、西洋參10 g、澤瀉10 g、生山楂10 g、荷葉10 g、絞股藍(lán)5 g、生甘草3 g，各味藥材購(gòu)自黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院南崗分院，加5倍量水浸泡，回流提取0.5 h，趁熱過(guò)濾，藥渣再加4倍水回流提取0.5 h，趁熱過(guò)濾，合并濾液，濃縮至每1 mL含生藥2.34 g的濃縮液備用。二甲雙胍，購(gòu)于黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，國(guó)藥準(zhǔn)字H20023370。三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、游離脂肪酸(FFA)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)、蘇木素-伊紅染液(HE)及油紅O染液試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，貨號(hào)分別為C009-2-1，C010-2-1，A112-1-1，A113-1-1，A042-1-1，A111-1-1，A110-1-1，H203，F(xiàn)006-1-1，D006-1-1，D027-1-1。AMPK抗體、p-AMPK抗體、SREBP-1c抗體、β-actin單抗和辣根酶標(biāo)記的二抗購(gòu)于A(yíng)bcam公司，貨號(hào)分別為ab79885，ab68206，ab28481，ab8226，ab6721。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 所有C57BL/6J小鼠在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，之后按照體重隨機(jī)分為空白組、模型組、二甲雙胍組和益氣健脾湯組，每組10只。除空白組繼續(xù)給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)外，其他組均通過(guò)高脂飲食喂養(yǎng)構(gòu)建NAFLD模型。常規(guī)飼料組成成分：玉米粉40%、豆餅29%、麩皮26%、骨粉1%、賴(lài)氨酸1%、食鹽1%、維生素等，按照100∶12的比例加入蒸餾水；高脂飲食組成成分：84%基礎(chǔ)飼料、10%豬油、5%蛋黃粉、1%膽固醇。造模周期為12周，造模期間小鼠自由飲水。從第9周開(kāi)始，二甲雙胍組給予二甲雙胍100 mg/(kg·d)灌胃，益氣健脾湯組給予益氣健脾湯0.5 mL/d(生藥濃度2.34 g/mL)灌胃，空白組和模型組給予0.5 mL/d蒸餾水灌胃, 給藥劑量根據(jù)人與動(dòng)物每千克體重劑量折算法計(jì)算[小鼠給藥量(mg/kg)=折算系數(shù)W×人的給藥量(mg/kg)],均灌胃4周。

1.4觀(guān)察指標(biāo)及方法

1.4.1血清生化指標(biāo) 末次灌胃結(jié)束后禁食不禁水24 h，采用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后處死小鼠，收集腹主動(dòng)脈血2 mL，離心取上清，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測(cè)定血清TG、TC、FFA、ALT、AST、FPG、FINS水平，并根據(jù)公式計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR=FPG×FINS/22.5)。

1.4.2肝指數(shù) 取血后分離小鼠肝臟組織，稱(chēng)重并計(jì)算肝指數(shù)，肝指數(shù)=肝臟重量/體重×100%。

1.4.3肝臟組織病理學(xué)觀(guān)察 取肝組織，制備石蠟切片，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行HE染色和油紅O染色，在電子顯微鏡下觀(guān)察肝臟的脂質(zhì)聚集情況。肝臟病理組織學(xué)改變參照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院指南標(biāo)準(zhǔn)[10]評(píng)估，其中脂肪變性、肝小葉炎癥均評(píng)0～3分，氣球樣變性評(píng)0～2分，NAS總分0～8分。同時(shí)采用Image J軟件計(jì)算油紅O染色面積。

1.4.4肝組織中AMPK/SREBP-1c信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測(cè)：取各組小鼠適量肝組織，冰上剪成細(xì)小碎片，加入RIPA裂解液后于冰上制備組織勻漿，12 000×g離心10 min收集上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度，取50 μg蛋白上樣后聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)印，加入脫脂牛奶封閉1 h。按照說(shuō)明書(shū)加入適當(dāng)比例的AMPK、p-AMPK、SREBP-1c和β-actin兔抗鼠單克隆抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，加入稀釋后的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗后孵育1 h。加入超敏ECL顯影液顯影，室溫下放置2 min，凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析，以目標(biāo)蛋白與β-actin條帶的比值計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4.5肝組織中AMPK/SREBP-1c信號(hào)通路相關(guān)mRNA表達(dá)情況 使用RT-qPCR法檢測(cè)：用TRIzol試劑盒提取肝組織總RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶的催化下合成cDNA，以cDNA為模板在Taq DNA聚合酶催化下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，循環(huán)40次；72 ℃ 10 min。AMPK引物為5’-TAGACAGAAGATTCGCAGTT-3’和5’-CCAGACACATATTCCATTACC-3’；SREBP-1c引物為5’- GTACAGAAAGTTGCA GGGGAAG-3’和5’- ACATAGCACCAACATGGGATTC-3’；β-actin引物為5’-GG AGATTACTGCCCTGGCTCCTA3’和5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’。PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像儀采集圖像，PCR儀獲得產(chǎn)物Ct值,采用2-ΔΔCt相對(duì)定量計(jì)算公式計(jì)算分析。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠血清生化指標(biāo)水平比較 模型組小鼠血清TG、TC、FFA、ALT、AST、FPG、FINS水平及HOMA-IR均明顯高于空白組(P均<0.05)，二甲雙胍組和益氣健脾湯組各指標(biāo)均明顯低于模型組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 空白組和非酒精性脂肪性肝病各組小鼠血清生化指標(biāo)水平比較

2.2各組肝臟組織病理形態(tài) HE染色及油紅O染色顯示，模型組小鼠肝組織可見(jiàn)肝細(xì)胞明顯腫脹、氣球樣變性，大泡樣脂滴形成并融合；二甲雙胍組和益氣健脾湯組肝細(xì)胞腫脹、氣球樣病變、脂肪變性均較模型組輕，尤其是益氣健脾湯組油紅O染色以小脂滴形式存在。見(jiàn)圖1。

圖1 空白組和非酒精性脂肪性肝病各組小鼠肝臟組織HE染色及油紅O染色表現(xiàn)

2.3各組小鼠肝指數(shù)及肝臟組織病理形態(tài)NAS評(píng)分和油紅O染色面積比較 模型組小鼠肝指數(shù)、NAS評(píng)分和油紅O染色面積均明顯高于空白組(P均<0.05)，二甲雙胍組和益氣健脾湯組各指標(biāo)均明顯低于模型組(P均<0.05)，并且益氣健脾湯組NAS評(píng)分及油紅染色面積均明顯低于二甲雙胍組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 空白組和非酒精性脂肪性肝病各組小鼠肝指數(shù)及肝臟組織病理形態(tài)NAS評(píng)分和油紅O染色面積比較

2.4各組小鼠肝組織中AMPK/SREBP-1c蛋白表達(dá)情況比較 各組小鼠肝組織中AMPK蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；與空白組比較，模型組小鼠p-AMPK蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，SREBP-1c蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，二甲雙胍組及益氣健脾湯組p-AMPK蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P均<0.05)，SREBP-1c蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P均<0.05)，并且益氣健脾湯組SREBP-1c蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于二甲雙胍組(P<0.05)。見(jiàn)圖2及表3。

圖2 空白組和非酒精性脂肪性肝病各組小鼠肝組織中AMPK、p-AMPK及SREBP-1c蛋白表達(dá)情況

表3 空白組和非酒精性脂肪性肝病各組小鼠肝組織中AMPK、p-AMPK及SREBP-1c蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.5各組小鼠肝組織中AMPK和SREBP-1c mRNA表達(dá)情況比較 各組小鼠肝組織中AMPK mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；模型組小鼠肝組織中SREBP-1c mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于空白組(P<0.05)，二甲雙胍組和益氣健脾湯組均明顯低于模型組(P均<0.05)，并且益氣健脾湯組明顯低于二甲雙胍組(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 空白組和非酒精性脂肪性肝病各組小鼠肝組織中AMPK和SREBP-1c mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

NAFLD的具體發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，“多重打擊”學(xué)說(shuō)近些年來(lái)已逐漸被大家認(rèn)可[6]?！岸嘀卮驌簟睂W(xué)說(shuō)認(rèn)為胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、脂肪組織功能障礙、脂肪酸、腸道菌群、線(xiàn)粒體功能障礙、炎癥激活、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、飲食因素、鐵超載等代謝功能障礙以及遺傳等因素均參與NAFLD的進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)以“多重打擊”中占主導(dǎo)地位的糖脂代謝異常為出發(fā)點(diǎn)進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示NAFLD模型小鼠血脂指標(biāo)、肝功能指標(biāo)、FPG、FINS、HOMA-IR、肝指數(shù)、NAS評(píng)分和油紅O染色面積均明顯高于正常小鼠，證實(shí)NAFLD存在明顯糖脂代謝異常。

AMPK是一種異源三聚體，由α、β和γ亞基組成，其中α為催化亞基，β、γ為調(diào)節(jié)亞基。AMPK具有調(diào)節(jié)能量代謝的作用，其作為高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶廣泛存在于真核生物體內(nèi)[7-8]，在體內(nèi)的多個(gè)臟器中均有表達(dá)，能感受到機(jī)體細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP比值的變化，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的能量代謝過(guò)程，是機(jī)體的“代謝主控開(kāi)關(guān)”[9-10]。目前關(guān)于NAFLD的研究顯示， AMPK的活化對(duì)脂質(zhì)代謝具有重要調(diào)控作用[11-12]。激活后的AMPK可增強(qiáng)脂肪分解代謝而產(chǎn)生ATP，并同時(shí)降低ATP的消耗來(lái)維持細(xì)胞能量的穩(wěn)定狀態(tài)，以此調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝相關(guān)酶的活性，調(diào)控肝內(nèi)脂肪酸的合成與氧化[13]。AMPK 可通過(guò)磷酸化以增強(qiáng)下游線(xiàn)粒體的功能，提高能量代謝率；也可抑制脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)等脂肪合成酶活性，抑制脂肪合成，減少脂質(zhì)在肝臟中的沉積[14]。

固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBPs)是肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積的重要調(diào)控因子[15]，其由SREBP-1a、SREBP-1c及SREBP-2三種同型異構(gòu)體組成，其中 SREBP-1c構(gòu)成了動(dòng)物體內(nèi)90%的SREBP-1。SREBP-1c主要在肝臟和脂肪細(xì)胞中表達(dá)[16],其通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪代謝相關(guān)酶來(lái)調(diào)控體內(nèi)的脂肪合成,并能抑制線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,促進(jìn)三酰甘油正平衡,減少極低密度脂蛋白膽固醇的合成。同時(shí)高胰島素可促進(jìn)SREBP-1c表達(dá)，SREBP-1c表達(dá)失調(diào)與脂肪肝、血脂異常和2型糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)[17]。AMPK是負(fù)向調(diào)控SREBP-1c的上游因素之一[18]。AMPK/SREBP-1信號(hào)軸在脂肪肝發(fā)病機(jī)制中被認(rèn)為是非常重要的分子靶點(diǎn)，AMPK磷酸化可以間接抑制SREBP-1c的表達(dá)[19]。由此可見(jiàn)，AMPK/SREBP-1c信號(hào)通路是改善肝臟糖脂代謝的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠p-AMPK蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，SREBP-1c蛋白和 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯升高，證實(shí)NAFLD模型小鼠存在A(yíng)MPK/SREBP-1c表達(dá)異常。

益氣健脾湯方中黃芪、丹參、澤瀉、黃連等多味中藥有改善糖脂代謝的作用[20-23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，益氣健脾湯組小鼠血脂指標(biāo)、肝功能指標(biāo)、FPG、FINS、HOMA-IR、肝指數(shù)、NAS評(píng)分和油紅O染色面積均明顯低于模型組，提示益氣健脾湯可以顯著改善高脂飲食誘導(dǎo)產(chǎn)生的胰島素抵抗及高血脂癥，改善肝臟組織的脂質(zhì)蓄積。AMPK/SREBP-1c表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果顯示，益氣健脾湯組p-AMPK蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于模型組，SREBP-1c蛋白和 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于模型組。提示益氣健脾湯可以上調(diào)小鼠肝臟組織中p-AMPK表達(dá)，下調(diào)SREBP-1c表達(dá)，AMPK/SREBP-1c是益氣健脾湯治療NAFLD的靶點(diǎn)之一，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，益氣健脾湯對(duì)NAFLD小鼠的糖脂代謝具有一定調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制可能與調(diào)控AMPK/SREBP-1c信號(hào)通路有關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。