褚德朋，陳芊如，邰振益，趙福彬，張?chǎng)?，張廣雨，尹紹靜，杜本林，賈海江，尚憲超，ILYAS Naila，尤祥偉，黃崇峻*，李義強(qiáng)

1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，山東青島嶗山區(qū)科苑經(jīng)四路11號(hào) 266100；2 山東青島煙草有限公司，山東青島市北區(qū)延吉路150號(hào) 266000；3 廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，廣西南寧西鄉(xiāng)塘區(qū)北湖南路28號(hào) 530000

近年來(lái)，隨著生態(tài)農(nóng)業(yè)的逐步發(fā)展，我國(guó)煙田以施用無(wú)機(jī)化肥為主逐漸轉(zhuǎn)向施用有機(jī)肥為主[1]。有機(jī)肥對(duì)于平衡煙葉煙堿含量和香吃味有重要的作用[2]。研究表明，長(zhǎng)期施用有機(jī)肥可以增加土壤養(yǎng)分的有效性，提高土壤肥力[3]，提升土壤穩(wěn)定性和緩沖能力[4]，還可促進(jìn)細(xì)菌繁殖并調(diào)節(jié)土壤微生物群落的組成和多樣性，使土壤微生物形成更多潛在功能群。Yan等研究發(fā)現(xiàn)，施用生物炭基肥料提高了Sphingomonas和Sphingobium等細(xì)菌豐度，它們與煙草香氣呈正相關(guān)，可增加煙草香氣成分，改善煙葉品質(zhì)[5]。目前市面所售有機(jī)肥質(zhì)量參差不齊，肥料效果差別很大。本試驗(yàn)旨在通過(guò)海藻肥、大豆肥的試驗(yàn)，篩選優(yōu)化土壤結(jié)構(gòu)、改善土壤生態(tài)、提高煙葉品質(zhì)的有機(jī)肥種類及用量，以期為煙田土壤環(huán)境健康管理和煙草綠色發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2019年在山東省青島市黃島區(qū)六汪鎮(zhèn)西臺(tái)頭村（東經(jīng)119°44′18″，北緯35°57′16″）進(jìn)行，試驗(yàn)地土壤為棕壤，pH 4.18，有機(jī)質(zhì)15.94 g/kg，速效磷28.88 mg/kg，速效鉀276.60 mg/kg，銨態(tài)氮0.0187 g/kg，硝態(tài)氮0.0309 g/kg。供試烤煙品種為當(dāng)?shù)刂髟云贩N中煙100。按照煙葉生產(chǎn)實(shí)際肥料需求，施用煙草專用肥（N 10%、K2O 20%、P2O510%）450 kg/hm2，硫酸鉀225 kg/hm2。市售普通有機(jī)肥（N+P2O5+K2O≥5、有機(jī)質(zhì)≥65%）與大豆有機(jī)肥（N+P2O5+K2O≥8、有機(jī)質(zhì)≥95%、蛋白質(zhì)≥38%）均由青島農(nóng)特生物科技有限責(zé)任公司提供；海藻有機(jī)肥（N+P2O5+K2O≥5、有機(jī)質(zhì)≥45%、海藻酸≥4%、有機(jī)鈣≥10%）由青島明月海藻集團(tuán)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

所用有機(jī)肥分別與常規(guī)氮磷鉀復(fù)合肥和硫酸鉀混合，條施后起壟。試驗(yàn)采用單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，共設(shè)置8個(gè)處理（見(jiàn)表1），對(duì)照（CK）為常規(guī)施肥而不施有機(jī)肥處理，每小區(qū)3壟，每壟50株，重復(fù)3次，行株距為120 cm × 50 cm。試驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范執(zhí)行。煙苗于2019年4月28日移栽。

表1 試驗(yàn)處理Tab. 1 Experimental treatments kg·hm-2

1.3 測(cè)定內(nèi)容及方法

1.3.1 農(nóng)藝性狀調(diào)查

團(tuán)棵期各處理隨機(jī)選取煙株5株，將地上部和地下部于莖基部分離，地下部用清水洗凈泥沙晾干，分別稱取兩部分鮮重后放置于烘箱105℃殺青30 min，65℃烘干至恒重；旺長(zhǎng)后期—現(xiàn)蕾期每小區(qū)選擇有代表性10株煙，根據(jù)《煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查測(cè)量方法》（YC/T 142—2010）進(jìn)行農(nóng)藝性狀調(diào)查。

1.3.2 土壤樣品采集及測(cè)定

于移栽后60 d左右進(jìn)行土樣采集，各處理均采用5點(diǎn)取樣法采集0～20 cm土層，采用抖根法收集其根際土壤[6]；在根系周?chē)?～5 cm的位置采集非根際土，將各處理采樣點(diǎn)土壤等量混合，按四分法分為2份，1份放于-80 ℃保存，用于土壤微生物測(cè)定分析；另外1份風(fēng)干后研磨過(guò)0.25 mm篩，進(jìn)行土壤理化性質(zhì)檢測(cè)。土壤理化性質(zhì)測(cè)定方法參照土壤農(nóng)化分析標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法[7]。

1.3.3 煙葉樣品采集及測(cè)定

旺長(zhǎng)后期每小區(qū)隨機(jī)采集中部煙葉5～6片放入烘箱105℃殺青30 min，65℃烘干至恒重，粉碎后過(guò)20目篩。采用H2SO4-H2O2法消解，煙葉氮、磷、鉀含量測(cè)定方法參照植物營(yíng)養(yǎng)元素標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法[7]。

1.3.4 高通量測(cè)序分析微生物群落

稱取0.50 g土壤，使用DNeasy?PowerSoil?Kit（100）試劑盒提取DNA。參照文獻(xiàn)[8]的方法使用引物341F（CCTAYGGGRBGCASCAG）和806R（GGACTACNNGGGTATCTAAT）以細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)域?yàn)榘悬c(diǎn)，采用熱循環(huán)PCR系統(tǒng)進(jìn)行DNA擴(kuò)增。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建和基于Illumina MiSeq平臺(tái)的測(cè)序由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)使用FLASH軟件對(duì)Reads拼接過(guò)濾后得到優(yōu)質(zhì)序列，利用Uparse軟件在相似性為97%的水平上，將序列聚類為操作分類單元（Operational taxonomic units，OTU）。通過(guò)對(duì)比silva 數(shù)據(jù)庫(kù)（細(xì)菌），對(duì)OTUs序列進(jìn)行物種注釋及豐度分析，得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息，揭示樣品的物種組成，分析樣品之間的微生物群落差異。采用WPS 2019計(jì)算原始數(shù)據(jù)的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并完成圖表制作；采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件Duncan法，比較分析相關(guān)數(shù)據(jù)在P≤0.05水平的差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 不同處理對(duì)烤煙生長(zhǎng)的影響

由表2可以看出，不同用量大豆有機(jī)肥和海藻有機(jī)肥的施用對(duì)煙株團(tuán)棵期地上部和地下部的鮮重產(chǎn)生了明顯影響。其中BOF30處理團(tuán)棵期地上部和地下部的鮮重均較CK顯著增加（P＜0.05），分別提高了131.39%和53.10%，而B(niǎo)OF20和BOF40處理與CK差異不顯著（P＞0.05）；施用海藻有機(jī)肥的各處理，煙株團(tuán)棵期地上部和地下部的鮮重與CK相比都有提高，但無(wú)顯著差異。說(shuō)明有機(jī)肥施用后煙株生長(zhǎng)狀況得到改善。

表2 不同試驗(yàn)處理團(tuán)棵期地上部與地下部鮮重Tab. 2 Aboveground and underground fresh weight under different experimental treatments at the cluster stage

反映煙株長(zhǎng)勢(shì)的指標(biāo)主要有株高、莖圍、有效葉數(shù)、節(jié)距、最大葉長(zhǎng)、最大葉寬和最大葉面積。由表3可知，施用大豆有機(jī)肥后，旺長(zhǎng)后期—現(xiàn)蕾期株高、莖圍、節(jié)距、最大葉長(zhǎng)以及最大葉面積5項(xiàng)指標(biāo)均高于CK，除莖圍外其它指標(biāo)與CK差異顯著。有效葉數(shù)與最大葉寬的BOF30和BOF40處理分別與CK差異顯著，與COF無(wú)顯著差異；施用海藻有機(jī)肥后，旺長(zhǎng)后期-現(xiàn)蕾期株高、莖圍、節(jié)距以及最大葉長(zhǎng)亦顯著高于CK，WOF30的有效葉數(shù)和最大葉寬顯著高于CK，較CK分別提高了15.58%、28.57%，但與COF差異不顯著，最大葉面積除WOF20外其余處理均顯著高于CK，且WOF30處理為最大值處理。綜上所述，兩種有機(jī)肥中施用量450 kg·hm-2的效果好于低用量（300 kg·hm-2）和高用量（600 kg·hm-2）。

表3 不同試驗(yàn)處理旺長(zhǎng)后期-現(xiàn)蕾期農(nóng)藝性狀Tab. 3 Agronomic traits under different experimental treatments at the vigorous growing and flower budding stage

2.2 不同處理對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

旺長(zhǎng)期各處理土壤理化性質(zhì)如表4所示。根際土壤中各處理pH、速效磷（Available phosphorus，AP）含量與CK均無(wú)顯著差異；土壤有機(jī)質(zhì)（Soil organic matter，SOM）WOF30處理較其他處理顯著升高；BOF30處理土壤速效鉀（Available K，AK）、銨態(tài)氮（Ammonium nitrogen，NH4+-N）以及硝態(tài)氮（Nitrate nitrogen，NO3--N）含量三指標(biāo)與CK均差異顯著，分別較CK提高了239.12%、46.48%以及216.13%。非根際土壤中BOF30和WOF30兩處理土壤有機(jī)質(zhì)和速效磷含量與CK無(wú)顯著差異，但均呈升高趨勢(shì)，COF處理土壤速效磷含量顯著高于其他處理；土壤pH、速效鉀和銨態(tài)氮含量三指標(biāo)僅有BOF30處理與CK差異顯著；土壤硝態(tài)氮含量各處理顯著高于CK，增幅為222.37%～488.16%。

表4 不同試驗(yàn)處理旺長(zhǎng)期土壤理化性質(zhì)Tab. 4 Soil physi-chemical properties under different experimental treatments at the vigorous growing stage

2.3 不同處理對(duì)煙葉氮、磷、鉀含量的影響

兩種有機(jī)肥不同施用量對(duì)旺長(zhǎng)后期煙草葉片氮、磷、鉀含量具有不同程度的影響（表5）。與CK相比，施用不同量大豆有機(jī)肥和海藻有機(jī)肥處理的煙葉氮、鉀含量均降低；煙葉磷含量WOF30處理顯著高于CK，較CK提高了47.37%，其他處理與CK均無(wú)顯著差異。

表5 不同試驗(yàn)處理旺長(zhǎng)后期煙葉氮、磷、鉀含量Tab. 5 Contents of N, P, K in tobacco leaves under different experimental treatments at the late vigorous growing stage %

2.4 不同處理對(duì)土壤微生物多樣性和結(jié)構(gòu)的影響

土壤細(xì)菌群落多樣性分析結(jié)果顯示（表6），根際土壤和非根際土壤中大豆有機(jī)肥和海藻有機(jī)肥施用后細(xì)菌群落豐富度和多樣性均與CK無(wú)顯著差異。此外，根際土壤大豆和海藻有機(jī)肥處理中除WOF30處理Chao 1指數(shù)、ACE指數(shù)高于CK外，其余均較CK降低，表明海藻有機(jī)肥施用后根際土壤中細(xì)菌群落豐富度升高多樣性降低，而大豆有機(jī)肥施用后豐富度和多樣性均降低。與CK相比，非根際土壤中WOF30處理Chao 1指數(shù)和ACE指數(shù)降低、香農(nóng)（Shannon）指數(shù)和辛普森（Simpson）指數(shù)升高，BOF30處理Chao 1指數(shù)和ACE指數(shù)升高、香農(nóng)指數(shù)降低，表明海藻有機(jī)肥施用后非根際土壤中細(xì)菌群落豐富度降低多樣性升高，而大豆有機(jī)肥施用后豐富度升高多樣性降低。

表6 不同試驗(yàn)處理根際和非根際土壤細(xì)菌群落多樣性指數(shù)分析Tab. 6 Diversity index analysis of bacterial communities in rhizosphere and non-rhizosphere soils under different experimental treatments

不同試驗(yàn)處理根際與非根際土壤微生物屬水平的群落組成及相對(duì)豐度如圖1所示。分析根際土壤中不同細(xì)菌屬的數(shù)量，表明其中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬包括（圖1(a)）：Chujaibacter、Sphingomonas、Phenylobacterium、Rhodanobacter以及Bryobacter。與CK相比，五種優(yōu)勢(shì)菌群在BOF組中Chujaibacter和Bryobacter豐度降低，Sphingomonas、Phenylobacterium和Rhodanobacter豐度升高，然而WOF組中Chujaibacter和Bryobacter豐度升高，Phenylobacterium和Rhodanobacter豐度則降低，兩組之間菌群變化趨勢(shì)相反。非根際土壤中（圖1(b)）的優(yōu)勢(shì)菌群則主要為Bryobacter、Chujaibacter、Acidibacter、Rhodanobacter以 及unidentified_Acidimicrobiia，與根際土壤大體一致。同CK相比較，Alicyclobacillus在BOF組中顯著升高，且Dyella為該組的特有菌，其相對(duì)豐度分別為0.08和0.02。

圖1 不同試驗(yàn)處理根際與非根際土壤微生物屬水平的群落組成及相對(duì)豐度Fig. 1 The community composition and relative abundance of microbial genus levels in rhizosphere and non-rhizosphere soil under different experimental treatments

PCA主成分分析能夠反映不同試驗(yàn)處理下煙株根際和非根際土壤細(xì)菌群落的變化情況。圖2(a)為根際土壤細(xì)菌屬水平上的PCA圖，可知WOF與另外3組均差異明顯，而B(niǎo)OF與CK、COF之間并未表現(xiàn)出明顯差異，表明WOF的施用改變了煙株根際土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，但BOF的使用并未明顯改變。在PC1維度上，可以將WOF處理和其他3組處理分開(kāi)，說(shuō)明WOF處理與其他處理間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異性。由圖2(b)可以看出，在非根際土壤中PC1是造成樣品差異性的最大主坐標(biāo)成分，其次是PC2，分別解釋了21.43%和15.72%的貢獻(xiàn)率，兩個(gè)主坐標(biāo)軸總貢獻(xiàn)率達(dá)37.15%。BOF和COF處理位于第1象限，CK和WOF處理位于第3象限，說(shuō)明不同有機(jī)肥的施用改變了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

圖2 不同試驗(yàn)處理根際（a）和非根際（b）土壤細(xì)菌群落主成分分析（PCA）Fig. 2 Principal component analysis (PCA) of bacterial communities in the rhizosphere soil ( a) and non-rhizosphere soil (b) under different experimental treatments

選取單因素方差分析法基于屬水平微生物的相對(duì)豐度分析各處理之間根際土壤和非根際土壤微生物的組成差異（圖3）。分析發(fā)現(xiàn)根際土壤中Cutibacterium在CK和WOF以及BOF和WOF中差異顯著，而Actinospica在COF和WOF中差異顯著，且兩種微生物在WOF中的豐度均高于另外3組；非根際土壤中Dyella和Pandoraea分別在CK和WOF以及BOF和WOF中差異顯著，且兩種微生物在WOF中的豐度低于對(duì)比組，然而Pseudonocardia在WOF中顯著高于COF。綜上所述，施用海藻有機(jī)肥后無(wú)論在根際土壤還是在非根際土壤中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化程度均大于其他處理組。

圖3 不同試驗(yàn)處理根際與非根際土壤微生物屬水平組間差異物種Fig. 3 Species difference between rhizosphere and non-rhizosphere soil microbial genus level under different treatments

2.5 不同試驗(yàn)處理土壤理化性質(zhì)與土壤微生物的關(guān)系

圖4分別估算了6種環(huán)境因子[pH值、NH4+-N、NO3--N、速效磷（AP）、AK和土壤有機(jī)質(zhì)（SOM）]對(duì)根際土壤和非根際土壤中微生物在屬水平上的相對(duì)貢獻(xiàn)。結(jié)果表明，根際土壤中pH值、AK和NH4+-N是影響微生物結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子，pH值對(duì)Sphingomonas和Bryobacter有正相關(guān)作用，AK對(duì)Sphingomonas和Bryobacter有負(fù)相關(guān)作用，而NH4+-N對(duì)Sphingomonas和Bryobacter分別有正相關(guān)和負(fù)相關(guān)作用。非根際土壤中AK、NO3--N和NH4+-N則是影響微生物結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子，三者均對(duì)Bryobacter有負(fù)相關(guān)作用。

圖4 不同試驗(yàn)處理根際（a）和非根際（b）土壤理化性質(zhì)與土壤微生物的冗余分析Fig. 4 Redundancy analysis of physi-chemical properties and soil microorganism in rhizosphere soil (a) and non-rhizosphere soil(b) under different experimental treatments

3 討論

本研究表明大豆和海藻有機(jī)肥的施用促進(jìn)了煙株的生長(zhǎng)發(fā)育，煙株團(tuán)棵期地上部與地下部鮮重以及旺長(zhǎng)期農(nóng)藝性狀都較CK顯著增加，這與前人的研究結(jié)果一致。劉麗輝等[9]研究表明，不同施用量生物有機(jī)肥對(duì)煙草植株的農(nóng)藝性狀和光合色素含量的提高具有不同程度的促進(jìn)作用；呂大樹(shù)等[10]研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)肥與無(wú)機(jī)肥配合施用，可以改善煙株的植物學(xué)性狀和農(nóng)藝性狀，降低煙株發(fā)病率。本研究表明施用大豆和海藻有機(jī)肥后，根際土壤和非根際土壤的有機(jī)質(zhì)和氮磷鉀含量呈升高趨勢(shì)，這與前人的研究結(jié)果一致。朱益等[11]、蒲全明等[12]研究表明，有機(jī)肥施入能改善土壤理化性質(zhì)，減少養(yǎng)分向深層土壤流失、提高土壤中有機(jī)質(zhì)的含量、提高養(yǎng)分的有效性，從而顯著提高土壤速效養(yǎng)分的含量，且養(yǎng)分含量隨有機(jī)肥比例上升而提高。氮、磷、鉀與植物的物質(zhì)合成和新陳代謝密切相關(guān)[13]。本研究表明，大豆和海藻有機(jī)肥施用后煙葉的氮、磷、鉀含量與CK相比均降低，可能原因?yàn)榇蠖购秃Ｔ逵袡C(jī)肥施用后促進(jìn)了煙株的新陳代謝和物質(zhì)合成，大量消耗氮、磷、鉀，因而導(dǎo)致煙葉氮、磷、鉀含量降低，具體原因還需進(jìn)一步研究。

土壤微生物作為評(píng)價(jià)土壤的重要生物學(xué)指標(biāo)，與土壤質(zhì)量和土壤健康變化密切相關(guān)[14]。微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性、微生物生物量以及微生物活性作為常用的土壤健康微生物指標(biāo)[15-16]，同時(shí)是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量和土壤健康的關(guān)鍵指標(biāo)[17]。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性在評(píng)價(jià)土壤健康方面的潛力被充分挖掘。本研究中，大部分處理根際土壤的細(xì)菌群落豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)都高于非根際土壤，表現(xiàn)出了明顯的根際效應(yīng)。施用海藻有機(jī)肥使得根際土壤微生物群落豐富度升高多樣性降低，非根際土壤與之相反；大豆有機(jī)肥施用后根際土壤微生物群落豐富度和多樣性均降低，非根際土壤則豐富度升高多樣性降低。可能原因?yàn)椴煌袡C(jī)肥所包含的成分有所區(qū)別，不同細(xì)菌生活所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也有差異，導(dǎo)致土壤中細(xì)菌對(duì)其響應(yīng)出現(xiàn)差別，而且由于某些根系分泌物吸引有益微生物，抑制有害微生物，從而使土壤微生物群落豐富度和多樣性出現(xiàn)變化。有研究已表明根系釋放的各種分泌物可以選擇性地刺激微生物種群生長(zhǎng)，并可以為微生物提供營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，從而使微生物富集在根際土壤中，因此根際土壤微生物豐度和活性遠(yuǎn)高于非根際土壤[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，根際土壤中Bryobacter、Sphingomonas、Actinospica以及非根際土壤中Pseudonocardia為主要有益菌。Bryobacter隸屬于酸桿菌門(mén)（Acidobacteria），能夠降解植物殘?bào)w、參與單碳因子代謝且喜貧瘠的土壤，在增加土壤有機(jī)質(zhì)和提高植物抵抗逆境能力等方面有重要作用[19-20]。Sphingomonas是促進(jìn)植物生長(zhǎng)的有益細(xì)菌，能夠產(chǎn)生IAA并誘導(dǎo)根系生長(zhǎng)，并且該菌與煙草香氣呈正相關(guān)，可增加煙草香氣成分[5]。Actinospica可通過(guò)調(diào)控土壤微環(huán)境從而提高植物對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的適應(yīng)能力[8]。Pseudonocardia參與土壤養(yǎng)分循環(huán)，并且與土壤碳、氮含量呈正相關(guān)，可促進(jìn)煙草生長(zhǎng)以及改善煙葉品質(zhì)[5]。

4 結(jié)論

大豆與海藻有機(jī)肥對(duì)烤煙生長(zhǎng)和土壤細(xì)菌群落的影響主要有：（1）兩種有機(jī)肥提高了土壤有機(jī)質(zhì)和氮、磷、鉀含量，對(duì)團(tuán)棵期、旺長(zhǎng)期的農(nóng)藝性狀都有很好的促進(jìn)效果，其中450 kg/hm2處理為最佳處理。（2）兩種有機(jī)肥改變了土壤細(xì)菌群落的豐富度和多樣性，Sphingomonas、Actinospica、Pseudonocardia等有益細(xì)菌豐度增加。