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五個(gè)煙草野火菌株的生理小種鑒定

2022-01-17 06:44:48于爽于洋喬嬋楊鵬九劉琳潘洪杏崔曉劉德育孫劍萍萬秀清郭兆奎李若
中國(guó)煙草學(xué)報(bào) 2021年6期
關(guān)鍵詞:小種野火黃花

于爽,于洋,,喬嬋,楊鵬九,劉琳,潘洪杏,崔曉,劉德育,孫劍萍,萬秀清,郭兆奎,李若*

1 牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,牡丹江市愛民區(qū)文化街191號(hào) 157011;2 黑龍江省公司煙草科學(xué)研究所,哈爾濱市哈藥路17號(hào) 150076;3 中國(guó)煙草總公司黑龍江省公司科技處,哈爾濱市地段街173號(hào) 150010

煙草野火?。═obacco Wildfire)是危害煙葉生產(chǎn)的主要細(xì)菌性病害之一。我國(guó)自上世紀(jì)四十年代有報(bào)道記錄以來,野火病已在國(guó)內(nèi)所有煙區(qū)發(fā)生并逐步上升為主要病害之一[1]。野火病在煙草整個(gè)生育期均可發(fā)生,病菌侵染初始產(chǎn)生褐色水漬樣小圓點(diǎn),周圍被寬的圓形黃色暈圈環(huán)繞。該黃色暈圈是病菌產(chǎn)生的野火毒素所致,此為野火病區(qū)別于煙草角斑?。ˋngular Leafspot of Tabacco)的主要特征。遇到陰雨連綿的適宜氣候條件,野火病斑迅速擴(kuò)大融合,對(duì)煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量常造成重大損失。

野火病致病菌為野火菌(Pseudomonas syringaepv. tabaci,Pta),為丁香假單胞桿菌屬煙草致病變種。除侵染煙草外,人工接種還能侵染大豆、菜豆、番茄、辣椒、馬鈴薯、黃瓜、龍葵等植物。迄今為止,以長(zhǎng)花煙和黃花煙為抗性鑒定宿主,野火菌至少存在4個(gè)生理小種,即0、1、2和3號(hào)生理小種[2-4]。其中,既不能侵染長(zhǎng)花煙也不能侵染黃花煙但能侵染(不含任何抗野火基因的)普通栽培煙草的野火菌株歸為0號(hào)小種;能侵染長(zhǎng)花煙但不能侵染黃花煙的歸為1號(hào)小種;能侵染包括長(zhǎng)花煙、黃花煙等抗病煙草在內(nèi)的所有已知煙草的歸為2號(hào)小種;能侵染黃花煙但不能侵染長(zhǎng)花煙的歸為3號(hào)小種。

國(guó)際上,1955 年Heggestad等育成第一個(gè)抗野火菌0號(hào)小種的栽培品種 Burley21[5]。之后,Stavely和Skoog將黃花煙N. rustica pumila的0和1號(hào)野火菌小種抗性導(dǎo)入普通煙草[6]。雖然2號(hào)小種能克服已知所有煙草的野火病抗性,但煙草育種人員將長(zhǎng)花煙和黃花煙來源的抗性聚合起來育成的品種則能減輕2號(hào)小種所產(chǎn)生病癥的嚴(yán)重程度[4]。目前,國(guó)內(nèi)烤煙主栽品種均感野火病,不排除有個(gè)別中等抗性栽培品種,但也主要是水平抗性,未明確報(bào)道有長(zhǎng)花煙或黃花煙垂直抗性來源。國(guó)內(nèi)煙草植保、育種人員前期主要以生理生化試驗(yàn)來鑒別野火菌[7],以各煙區(qū)主栽品種作為鑒別宿主對(duì)野火菌進(jìn)行生理小種劃分,在抗野火病抗性遺傳規(guī)律方面?zhèn)戎剌^少[8-9]。本研究首次在國(guó)內(nèi)開展了基于抗病遺傳規(guī)律的煙草野火菌生理小種鑒定,為今后加快培育垂直抗性的抗野火病煙草和克隆煙草特異抗0號(hào)和1號(hào)小種抗病基因提供了重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

煙草材料黃花煙(寧安)(下文簡(jiǎn)稱黃花煙)、長(zhǎng)花煙、KRK26、Burley 21(B21)、Ky14、龍江911(LJ911)和Kutsaga E1(KE1)種子由黑龍江省煙草科學(xué)研究所高新技術(shù)室保存。其中,黃花煙為晾曬煙栽培種,KRK26為津巴布韋烤煙普通栽培品種(雄性不育雜交種),黃花煙和KRK26抗野火菌0和1號(hào)小種,KRK26抗性來源于黃花煙。長(zhǎng)花煙為煙草野生種,B21為白肋煙普通栽培品種,長(zhǎng)花煙和B21抗野火菌0號(hào)小種,B21抗性來源于長(zhǎng)花煙。LJ911為黑龍江省自育主栽烤煙品種,KE1為津巴布韋烤煙普通栽培品種,LJ911和KE1均感野火菌各小種,作為感病對(duì)照品種。Ky14為白肋煙普通栽培品種,抗0號(hào)小種[10]。各煙草材料相關(guān)信息見表1。

表1 試驗(yàn)所用煙草材料Tab. 1 Tobacco materials used in tests

煙草野火菌ATCC11528訂購(gòu)自美國(guó)ATCC機(jī)構(gòu),作為0號(hào)小種標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照[11]。野火菌株ZD、M109、D151和W11分別采集自黑龍江省肇東市、穆棱市、東寧市和寧安市。采集的菌株經(jīng)涂板—挑選單克隆—菌落PCR鑒定等多輪循環(huán)純化至無雜菌[12]。煙草角斑菌217為黑龍江省煙草科學(xué)研究所高新技術(shù)室保存,作為菌種鑒定對(duì)照菌株。

1.2 方法

試驗(yàn)采用黃花煙、長(zhǎng)花煙等晾曬煙栽培種、野生種,以及B21、Ky14等白肋煙栽培種等開展接種試驗(yàn),煙草材料的異質(zhì)性會(huì)使試驗(yàn)結(jié)果均一性不高;又由于抗野火病煙草材料在接種高濃度、大劑量野火菌時(shí)因超敏反應(yīng)(Hypersensitive Response,HR反應(yīng))產(chǎn)生的壞死斑與感病煙草上的野火病斑難于區(qū)分。本研究在田間及溫室分別設(shè)計(jì)了1個(gè)和3個(gè)接種試驗(yàn),力圖采用具有不同優(yōu)點(diǎn)的多個(gè)試驗(yàn)來交叉驗(yàn)證野火菌的生理小種分類。

1.2.1 野火菌的PCR鑒定

以煙草角斑菌217為陰性對(duì)照,以野火菌ATCC11528為陽性對(duì)照,參照張萌等[12]方法對(duì)收集的野火菌株進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證,具體方法如下。取各野火菌株菌液10 μL,12000 r/min離心2 min,移去上清液后,菌體沉淀作為PCR擴(kuò)增模板。煙草野火菌特異性鑒定PCR引物序列如下:上游引物:tabB1F:5’-ATTGAAGAAGCGTTCGAGCG-3’;下游引物:tabB1R:5’-GTTTCGGGTCGGCACGATTG-3’,擴(kuò)增片段大小為709 bp。PCR反應(yīng)體系加入Premix Ex Taq Hot Start Version 5 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1μL,用雙蒸水補(bǔ)足反應(yīng)體系至10 μL并混勻。PCR反應(yīng)條件為,95℃ 5 min;95℃ 40 s,58℃ 40 s,72℃ 1 min,72℃ 5 min,33個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2 野火菌田間生理鑒定

2020年在黑龍江省煙草科學(xué)研究所賓西實(shí)驗(yàn)場(chǎng)大田種植了黃花煙、KRK26、長(zhǎng)花煙、B21、Ky14、LJ911和KE1等7個(gè)煙草材料,每個(gè)材料種植20壟,每壟12株,株距0.5 m,行距1.15 m。對(duì)7個(gè)煙草材料接種了ATCC11528、ZD、D151、M109和W11等5個(gè)野火菌株。取出-80℃保存的野火菌株,在超凈工作臺(tái)中將野火菌液加入到500 mL LB液體培養(yǎng)基中,180 r/min,28℃震蕩培養(yǎng)過夜。接種前用蒸餾水稀釋至5 L,并加入表面活性劑Silwet L-77至終濃度0.01%。待煙草長(zhǎng)至團(tuán)棵期,用噴壺對(duì)田間煙草進(jìn)行噴霧接種,每菌種接種2壟各煙草材料。兩周后拍攝記錄各煙草材料的病理表現(xiàn),兩周后葉片上出現(xiàn)壞死斑點(diǎn)且圍繞寬的黃色暈圈的典型煙草野火病癥狀的即判定為感病。試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2.3 煙草對(duì)野火菌接種濃度的病理反應(yīng)

參照Knoche等[11]的試驗(yàn)方法在溫室中進(jìn)行野火菌接種濃度梯度試驗(yàn),具體方法如下。將ATCC11528等5個(gè)野火菌株用LB液體培養(yǎng)基28℃振蕩培養(yǎng)過夜,搖起的菌液5000 r/min離心10 min,菌體沉淀用PBS溶液重懸洗滌,再次離心沉淀,并用PBS溶液重懸,配制成濃度為0.1 OD(約108CFU/mL)的懸液。以此濃度為起始濃度,用PBS溶液依次5倍稀釋,制成12個(gè)濃度梯度。用1 mL規(guī)格注射器針頭在葉片上穿刺,在小孔處用一手按住葉片上表面,從葉片下表面注射入菌液。待煙草長(zhǎng)至團(tuán)棵期,將5個(gè)野火菌株12個(gè)濃度的菌液注射到黃花煙、KRK26、長(zhǎng)花煙、B21、LJ911和KE1等6種煙草材料上。其中每個(gè)菌株接種每個(gè)煙草材料的4株煙,每株煙接種頂部完全展開的2片葉,每片葉片上接種6個(gè)濃度的菌液,各濃度的接種位置隨機(jī)。接種后1~10 d,每天觀察記錄葉片上出現(xiàn)的病斑數(shù)量。試驗(yàn)重復(fù)2次。設(shè)定每個(gè)菌株菌液的最低一個(gè)濃度為基準(zhǔn)C0,以菌液濃度的對(duì)數(shù)值(以5為底,起始濃度為0對(duì)應(yīng)實(shí)際濃度為C0)為橫坐標(biāo)、以時(shí)間(天數(shù))為縱坐標(biāo),繪制不同煙草接種了不同菌株、不同濃度野火菌液后最早出現(xiàn)的病理反應(yīng)時(shí)間與野火菌濃度的關(guān)系圖。

1.2.4 基于病斑大小的野火菌定量評(píng)價(jià)

參照Cole等[4]的試驗(yàn)方法,稍作改動(dòng),在溫室中進(jìn)行野火菌無損傷接種試驗(yàn),具體方法如下。ATCC11528等5個(gè)野火菌株28℃在LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過夜后,用PBS溶液洗滌后再用PBS溶液制備成濃度為106CFU/mL濃度的菌液,作為接種液備用。打開與噴槍(Hansa Aero-pro 251,0.2 mm nozzle)連接的真空泵,向噴槍液體槽中加入菌液。在葉片下表面,噴槍噴嘴距葉面1 cm左右,噴射葉面,菌液在葉片內(nèi)擴(kuò)展達(dá)到直徑約0.5 cm大小。待煙草長(zhǎng)至團(tuán)棵期,把5個(gè)野火菌株接種到黃花煙等6個(gè)煙草材料上。每菌種接種各煙草的2株煙,每株煙接種頂部完全展開的2片葉,每片葉接種4個(gè)點(diǎn),在葉片上的接種位置隨機(jī)。接種10 d后,測(cè)量病斑直徑(測(cè)病斑兩條互相垂直的直徑,最終使用兩條直徑長(zhǎng)度相乘再開平方值)。試驗(yàn)重復(fù)2次。用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 同一片葉上的對(duì)比試驗(yàn)

五個(gè)野火菌株接種液的制備同上節(jié)(接種液濃度為106CFU/mL),野火菌接種操作同1.2.3節(jié)(針刺結(jié)合無針頭注射)。待煙草長(zhǎng)至團(tuán)棵期,在溫室中將ATCC11528等5個(gè)野火菌株接種到黃花煙等6個(gè)煙草材料上,每個(gè)煙草材料接種2株煙,每株煙接種頂部完全展開的2片葉,每片葉上接種5個(gè)菌株。接種10 d后,拍攝記錄各煙草材料的病理反應(yīng)。試驗(yàn)重復(fù)2次。

2 結(jié)果

2.1 野火菌的PCR鑒定

如圖1所示,對(duì)收集的野火菌株進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)檢測(cè)靶標(biāo)為煙草野火菌特有的野火毒素合成基因tabB基因,因?yàn)闊煵萁前呔≒seudomonas syringaepv. angulata,P. S. angulata)不能產(chǎn)生野火毒素,故用其作為陰性對(duì)照。如圖所示,包括陽性對(duì)照野火菌株ATCC11528在內(nèi)的所有檢測(cè)野火菌株均能擴(kuò)增出與預(yù)設(shè)片段大小709 bp一致的單一條帶。這表明所收集的菌株均為野火菌,這些菌株可用于后續(xù)接種試驗(yàn)。

圖1 PCR鑒定野火菌Fig. 1 Identification of Pta using PCR

2.2 野火菌田間生理鑒定

表2總結(jié)了田間5個(gè)野火菌株在7種不同野火病抗性煙草上的病理反應(yīng),圖2展示了大田野火菌接種試驗(yàn)的代表性圖片(未展示陰性結(jié)果)。如表2和圖2所示,所有5個(gè)野火菌株均能侵染感病對(duì)照煙草LJ911和KE1,2周后均能在它們的葉片上產(chǎn)生典型的野火病癥即點(diǎn)狀壞死斑且周圍環(huán)繞寬的黃色暈圈(如圖2“LJ911-D151”和“KE1-D151”兩小圖所示)。這表明整個(gè)試驗(yàn)系統(tǒng)正常。野火菌D151能感染感病煙草LJ911和KE1,但既不能使長(zhǎng)花煙抗性來源的B21感病,也不能使黃花煙和黃花煙抗性來源的KRK26感病,這表明D151屬于0號(hào)小種。ZD和M109既能感染感病野草,也能在B21上產(chǎn)生病斑(如圖2“B21-ZD”和“B21-M109”),但不能感染黃花煙和KRK26,因此將野火菌ZD和M109歸為1號(hào)小種。ATCC11528和W11既能感染感病野草,也能感染黃花煙和KRK26(如圖2“NR-W11”、“NR-11528”、“KRK26-W11”和“KRK26-11528”),因此把野火菌ATCC11528和W11歸為3號(hào)小種。這里,野火菌W11在黃花煙葉片上產(chǎn)生的野火病斑發(fā)生合并、蔓延,表明其具有比ATCC11528更強(qiáng)的侵染黃花煙的能力。另外,ATCC11528原本是作為0號(hào)小種標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照從美國(guó)引進(jìn),但在本試驗(yàn)中卻被判定為3號(hào)小種,與先前其他研究人員結(jié)果不一致[11],而且后面的幾個(gè)試驗(yàn)結(jié)果也把ATCC11528歸為3號(hào)小種,具體結(jié)果詳見下文。

圖2 野火菌大田接種試驗(yàn)結(jié)果Fig. 2 Result of Field trial of Pta inoculation

表2 野火菌大田接種試驗(yàn)結(jié)果Tab. 2 Result of field trial of Pta inoculation

2.3 煙草對(duì)野火菌接種濃度的病理反應(yīng)

參照Knoche等[11]的試驗(yàn)方法,在溫室中進(jìn)行的野火菌接種濃度梯度試驗(yàn)可以反應(yīng)不同野火病抗性的煙草當(dāng)接種不同濃度、不同小種野火菌株時(shí)所產(chǎn)生病理反應(yīng)的差別。圖3展示了5個(gè)野火菌株在6個(gè)煙草材料上不同接種菌液濃度與發(fā)生病理反應(yīng)時(shí)間(壞死斑)之間的關(guān)系。菌液濃度由100~108CFU/mL的12個(gè)梯度組成(對(duì)應(yīng)關(guān)系圖中的菌液濃度對(duì)數(shù)值0,1,2,…,11),病害調(diào)查時(shí)間為10 d。每個(gè)野火菌-病理反應(yīng)時(shí)間組合用4株煙,關(guān)系圖中顯示的數(shù)據(jù)點(diǎn)為首次出現(xiàn)病理反應(yīng)的最低濃度梯度(1個(gè)以上濃度梯度同一天出現(xiàn)壞死斑,只顯示最低濃度梯度數(shù)據(jù)),對(duì)應(yīng)的病理反應(yīng)時(shí)間為4株煙的均值(平均反應(yīng)時(shí)間)。

圖3 野火菌接種濃度與煙草病理反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系圖Fig. 3 Relationship of Pta inoculation concentration and pathological response time of tobacco plants

如圖4黃花煙和KRK26小圖,野火菌株ZD、D151、M109在菌液濃度對(duì)數(shù)值4(約103CFU/mL)以下的低濃度梯度時(shí),接種黃花煙和KRK26不能使其感病,說明三者歸類為0號(hào)或1號(hào)生理小種。野火菌株ATCC11528和W11在低菌液濃度時(shí)仍可使黃花煙和KRK26感病,說明二者歸類為2號(hào)或3號(hào)生理小種。如圖4長(zhǎng)花煙和B21小圖,野火菌株ATCC11528、D151、W11在菌液濃度對(duì)數(shù)值4以下的低濃度梯度時(shí)(對(duì)于長(zhǎng)花煙濃度對(duì)數(shù)值則相應(yīng)為8,約106CFU/mL),接種長(zhǎng)花煙和B21不能使其感病,說明三者歸類為0號(hào)或3號(hào)生理小種。野火菌株ZD和M109在低菌液濃度時(shí)仍可使長(zhǎng)花煙和B21感病,說明二者歸類為1號(hào)或2號(hào)生理小種。如圖4 LJ911和KE1小圖,5個(gè)野火菌株在所有濃度梯度均能感染兩種感病對(duì)照煙草。

綜上所述,依據(jù)各野火菌株在抗性鑒別宿主上的病理表現(xiàn),將D151歸類為0號(hào)生理小種,ZD和M109為1號(hào)生理小種,ATCC11528和W11為3號(hào)生理小種。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),各煙草材料展現(xiàn)了不同抗性水平。其中,長(zhǎng)花煙對(duì)野火菌0號(hào)小種D151和3號(hào)小種ATCC11528和W11展現(xiàn)了強(qiáng)的抑制作用,表現(xiàn)為3個(gè)野火菌株在高濃度梯度106CFU/mL(相當(dāng)于對(duì)數(shù)濃度值8)以下時(shí),已不能出現(xiàn)任何癥狀。B21的0號(hào)小種抗性來自長(zhǎng)花煙,但其抗性弱于長(zhǎng)花煙,表現(xiàn)在3個(gè)野火菌株在達(dá)到濃度梯度103CFU/mL(相當(dāng)于對(duì)數(shù)濃度值4)以下時(shí),才不表現(xiàn)病理癥狀。其中,試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),黃花煙和KRK26表現(xiàn)出的對(duì)野火菌0號(hào)小種D151的抗性弱于長(zhǎng)花煙,它們的抗性水平略高于B21。

2.4 基于病斑大小的野火菌定量評(píng)價(jià)

圖4統(tǒng)計(jì)了5個(gè)野火菌株接種在6個(gè)煙草材料上所產(chǎn)生病斑的大小。野火菌D151在黃花煙和KRK26上產(chǎn)生小病斑(<0.2 cm2),在長(zhǎng)花煙和B21上則不產(chǎn)生病斑或小病斑,說明D151屬于0號(hào)小種。ZD和M109在黃花煙和KRK26上產(chǎn)生小病斑,在長(zhǎng)花煙和B21上誘發(fā)大病斑,說明二者歸類為1號(hào)小種。野火菌ATCC11528和W11在黃花煙和KRK26上誘發(fā)大病斑,在長(zhǎng)花煙和B21上則不產(chǎn)生病斑或小病斑,說明二者屬于3號(hào)生理小種。試驗(yàn)中ATCC11528仍表現(xiàn)出對(duì)黃花煙和KRK26強(qiáng)的侵染性。

圖4 野火菌無損傷接種試驗(yàn)結(jié)果Fig. 4 Result of non-invasive inoculation of Ptas

M109表現(xiàn)出對(duì)黃花煙和KRK26的侵染,這使它類于能侵染目前所有已知抗性煙草的2號(hào)小種。另外,W11雖未在長(zhǎng)花煙上產(chǎn)生病斑,但在同一抗源的B21上產(chǎn)生較大病斑。綜合這些結(jié)果,參考上節(jié)濃度梯度試驗(yàn)結(jié)果,原因是不同抗性材料抗性水品不同,而本試驗(yàn)所用的接種濃度(106CFU/mL)偏高,也即對(duì)于長(zhǎng)花煙這樣抗性強(qiáng)的煙草采用此濃度適合,將此接種濃度用在黃花煙、KRK26和B21上則偏高。

2.5 同一片葉上的對(duì)比試驗(yàn)

如圖5,把5個(gè)相同濃度(106CFU/mL)的野火菌株接種到6個(gè)煙草材料的同一葉片上,對(duì)比不同野火菌株在同一煙草材料上的病理反應(yīng)。在黃花煙上,5個(gè)菌株均造成了病斑,但ZD、D151和M109的病斑僅局限于接種區(qū)域內(nèi),而W11和ATCC11528的病斑則突破接種區(qū)域并蔓延擴(kuò)大;在KRK26上,5個(gè)菌株均造成病斑,但W11產(chǎn)生的病斑則發(fā)生明顯蔓延擴(kuò)大。這表明,野火菌W11和ATCC11528能克服黃花煙類抗源抗性,而ZD、D151和M109不能(盡管它們也造成病斑,可能是由接種濃度偏高造成,但壞死斑不發(fā)生擴(kuò)散)。在長(zhǎng)花煙和B21上,ATCC11528、D151和W11沒有產(chǎn)生病斑(3個(gè)菌株在B21上只在接種部位產(chǎn)生褪綠現(xiàn)象),說明三者不能侵染長(zhǎng)花煙和B21;而ZD和M109則能在長(zhǎng)花煙和B21上造成較大病斑,說明二者可以突破長(zhǎng)花煙類抗源的抗性。5個(gè)菌株在LJ911和KE1等兩個(gè)感病對(duì)照煙草上均能產(chǎn)生典型野火病斑。綜合以上結(jié)果,可以判定,D151屬于野火菌0號(hào)生理小種,ZD和M109屬于1號(hào)小種,11528和W11屬于3號(hào)生理小種。本試驗(yàn)結(jié)果與上述幾個(gè)抗性鑒定試驗(yàn)一致。

圖5 野火菌接種對(duì)比試驗(yàn)Fig. 5 Comparative test of Pta inoculation

綜合大田接種試驗(yàn)和溫室接種試驗(yàn),四個(gè)試驗(yàn)得到的5株野火菌生理小種分類情況基本一致,分類情況見表3。此處將ATCC11528歸類為3號(hào)小種的原因?qū)⒃谟懻撝芯唧w論述。

表3 煙草野火菌生理小種分類Tab. 3 Race classification of Ptas

3 討論

3.1 野火菌接種方法

煙草野火病抗性鑒定存在接種方法和接種結(jié)果判定方面的困難。如在大田中采用噴霧方法接種野火菌,由于自然環(huán)境下紫外線強(qiáng)、溫濕度條件差,低濃度的菌液不易在煙草葉片上定殖就過早死亡。另外,在無傷口情況下野火菌只能通過葉面氣孔侵入,侵染效率低,發(fā)病時(shí)間長(zhǎng),需2周時(shí)間才能出現(xiàn)病癥。如在溫室中采用針刺法接種野火菌,則難于控制接種量,同時(shí),抗病煙草在高接種量情況下所表現(xiàn)出的超敏反應(yīng)形成的壞死斑與野火病斑難于區(qū)分,造成結(jié)果判定困難。

考慮到這些情況,設(shè)計(jì)多個(gè)具有不同優(yōu)點(diǎn)的平行試驗(yàn),從多方面鑒定、驗(yàn)證野火菌的生理小種分類。首先,大田接種試驗(yàn)?zāi)苣M野火菌在自然條件下侵染煙草,也可避免損傷式接種(如注射)接種量過大的缺點(diǎn)。其次,接種濃度梯度試驗(yàn)反映了不同小種野火菌在不同抗性煙草上病理反應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間與其接種濃度的關(guān)系,是對(duì)具有不同特征生理小種的驗(yàn)證試驗(yàn)。同時(shí),該試驗(yàn)也有利于區(qū)分野火病斑和由超敏反應(yīng)造成的壞死斑(由野火菌超敏反應(yīng)產(chǎn)生的壞死斑常常表現(xiàn)為短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)、壞死斑顏色發(fā)白且周圍黃色暈圈較小或沒有):如果在高接種濃度梯度下(如對(duì)于長(zhǎng)花煙106CFU/mL以上,對(duì)于B21 103CFU/mL以上)某野火菌株可以短時(shí)間內(nèi)(1~2 d內(nèi))造成某煙草材料出現(xiàn)壞死斑,而在低濃度梯度下對(duì)該煙草材料長(zhǎng)時(shí)間后卻不出現(xiàn)任何病理反應(yīng)(見濃度梯度接種試驗(yàn)),則能據(jù)此判定出現(xiàn)的壞死斑為超敏反應(yīng)造成。無損傷接種試驗(yàn)則是在不產(chǎn)生創(chuàng)口的情況下,實(shí)現(xiàn)對(duì)接種試驗(yàn)所產(chǎn)生野火菌病斑大小的精確量化,是對(duì)大田試驗(yàn)這樣的定性試驗(yàn)及造成創(chuàng)口的注射接種試驗(yàn)的較好補(bǔ)充。接種對(duì)比試驗(yàn)是在同一煙草材料的同一片葉上接種所有野火菌株,以更清晰地呈現(xiàn)各野火菌株的差異。

3.2 試驗(yàn)結(jié)果討論

首先試驗(yàn)將收集的野火菌株用特異性分子標(biāo)簽進(jìn)行多輪純化,得到了純的野火菌株,排除了其他雜菌干擾,這是進(jìn)行下面接種試驗(yàn)的必要步驟(因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下,即使有極少雜菌,其增殖速度也比野火菌快得多)。四個(gè)平行接種試驗(yàn)獲得的五株野火菌生理小種分類的結(jié)果基本一致,即把野火菌D151歸為0號(hào)小種,把ZD和M109歸為1號(hào)小種,把ATCC11528和W11歸為3號(hào)小種,試驗(yàn)中未檢測(cè)到2號(hào)小種。綜合幾個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,同為1號(hào)小種的M109比ZD毒力強(qiáng),表現(xiàn)在能以更低接種濃度、更短時(shí)間內(nèi)使長(zhǎng)花煙類抗源發(fā)病(濃度梯度試驗(yàn)),同一接種濃度下使長(zhǎng)花煙類抗源更早出現(xiàn)、出現(xiàn)更大的病斑(無損傷接種試驗(yàn)及接種對(duì)比試驗(yàn));同為3號(hào)小種的W11比ATCC11528毒力強(qiáng),表現(xiàn)為能以更低接種濃度、更短時(shí)間內(nèi)使黃花煙類抗源發(fā)病(濃度梯度試驗(yàn)),同一接種濃度下使黃花煙類抗源更早出現(xiàn)、出現(xiàn)更大的病斑(無損傷接種試驗(yàn)及接種對(duì)比試驗(yàn))。從接種用煙草材料來看,長(zhǎng)花煙表現(xiàn)出了對(duì)0和3號(hào)小種強(qiáng)的抑制能力;B21的抗性由長(zhǎng)花煙而來,但其抗性水平相對(duì)長(zhǎng)花煙減弱不少(濃度梯度試驗(yàn)及無損傷接種試驗(yàn))。黃花煙與KRK26對(duì)0和1號(hào)小種的抗性水平與B21對(duì)0和3號(hào)小種的抗性水平相當(dāng)。

與先前的研究結(jié)果對(duì)比,試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)原本引進(jìn)作為0號(hào)小種對(duì)照的野火菌株ATCC11528[11]在多個(gè)試驗(yàn)中均表現(xiàn)出了對(duì)黃花煙類抗源的侵染能力(盡管其毒力弱于W11),這使它在本研究中被歸為3號(hào)小種。這種情況類似3號(hào)小種的發(fā)現(xiàn)過程[4],在本試驗(yàn)中有可能再次發(fā)生。這一結(jié)果,也會(huì)在后續(xù)煙草野火菌基因組測(cè)序試驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。與先前的研究結(jié)果對(duì)比,大田接種試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Ky14品種不抗野火菌任何小種,甚至比作為感病對(duì)照的LJ911和KE1病情更嚴(yán)重,這與先前研究中用其作為抗0號(hào)小種材料不一致[10]。與先前的研究結(jié)果對(duì)比[4],本試驗(yàn)由于采用了野生煙(長(zhǎng)花煙)、黃花煙栽培種(黃花煙)、白肋煙普通栽培煙草(B21),使得試驗(yàn)結(jié)果的勻質(zhì)性受到影響,尤其表現(xiàn)在用同一接種濃度接種各煙草材料時(shí),出現(xiàn)與其他幾個(gè)試驗(yàn)結(jié)果不相一致的情況,如無損傷接種試驗(yàn)中野火菌M109的表現(xiàn)。參考濃度梯度接種試驗(yàn)結(jié)果,如用不同接種濃度接種不同煙草材料(但同一種煙草材料各野火菌株接種濃度相同),應(yīng)能達(dá)到與其他幾個(gè)試驗(yàn)相一致的試驗(yàn)結(jié)果。這也同時(shí)提示,在以后做抗病基因功能驗(yàn)證時(shí),需要考慮到轉(zhuǎn)基因煙草抗性水平很有可能并不能達(dá)到其抗性來源一樣高的抗性的情況。

4 結(jié)論

由于目前國(guó)內(nèi)尚未以國(guó)際通行的抗性鑒別宿主區(qū)分煙草野火菌生理小種,本文首次基于抗性遺傳規(guī)律對(duì)收集的野火菌株進(jìn)行了生理小種鑒定。通過野火菌大田接種、濃度梯度接種、無損傷接種及同一葉片上的對(duì)比試驗(yàn)等4個(gè)各具優(yōu)勢(shì)的平行試驗(yàn),將收集的野火菌D151、ZD和M109、ATCC11528和W11分別鑒定為0、1、3等3個(gè)小種。這為下一步培育野火菌小種?;剐詿煵萜贩N及克隆小種?;共』蛱峁┝酥匾A(chǔ)。

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