王馳，尹卓然，軒棟棟，連文力，羅勇，張萍，符云鵬，賈宏昉*

1 河南農業(yè)大學煙草學院，鄭州 450002；2 廈門大學生命科學學院，廈門 361000

全球土壤鹽漬化面積約為9.5×108hm2，我國土壤鹽漬化面積約占三分之一，大面積土壤資源難以利用[1]?；实倪^量使用使土壤鹽漬化程度越來越嚴重，從而影響植物生長和作物產量品質[2]，鹽脅迫是限制全球農作物產量的非生物脅迫之一[3]。土壤中鹽分過多，會抑制植物進行光合作用、內源激素的合成和運輸、離子吸收等，影響植物的生長發(fā)育過程[4]。

生長素作為一種植物激素，能夠與植物體內的多種其他激素共同作用，參與從胚胎發(fā)生到衰老，調節(jié)植物的生長發(fā)育，以及響應鹽脅迫、干旱等非生物脅迫[5]。生長素/吲哚-3-乙酸（Aux/IAA）蛋白作為響應生長素信號的關鍵因子[6]，在生長素信號轉導過程中起重要的調控作用[7]。當Aux/IAA在生長素濃度較低時，與ARF形成ARF-Aux/IAA異質二聚體從而抑制ARF的轉錄活性；當生長素濃度較高時，生長素受體（TIR1/AFBs）與生長素結合后導致Aux/IAAs發(fā)生降解，ARF從Aux/IAA中釋放，從而調控下游基因表達[8]。

Aux/IAA家族基因已在許多植物中得到鑒定分析[9]，在擬南芥中有29個[10]，在水稻中有31個[11]，在馬鈴薯中有26個[12]等。擬南芥AtIAA19過量表達，會顯著促進植物根、莖、葉的生長[13]。StIAA2基因的下調表達使植株高度增加、葉片下垂、頂葉原基彎曲生長[14]。葡萄VvIAA18基因的過表達提高葡萄的抗氧化能力進而增強了對鹽脅迫的耐受性[15]。鹽脅迫和干旱脅迫均使高粱SbIAA1基因在根和葉中上調表達，該基因可能提高高粱的抗鹽抗旱能力[16]。以上結果表明，Aux/IAA家族對植物的生長發(fā)育起著重要的調控作用，并且可能提高植株對非生物脅迫的耐受性。

目前，對煙草基因組數(shù)據的生物信息學分析表明，煙草中至少有77個Aux/IAA成員[17]，但這些成員的功能仍不清楚。前期，從高鹽脅迫的轉錄組數(shù)據庫發(fā)現(xiàn)NtIAA17受鹽脅迫增強表達。因此，本研究以K326為試驗材料，克隆得到NtIAA17基因，對其生物學功能和表達模式進行系統(tǒng)分析，探究NtIAA17基因在抵御鹽脅迫中的功能，為培育煙草耐鹽新品種提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 植物材料與生長條件

使用野生型（Nicotiana tabacumcv，K326）煙草和NtIAA17基因過表達的K326轉基因煙草用于本研究。

首先挑選均勻飽滿的煙草種子在75%（v/v）乙醇溶液消毒30 s，然后在10%（v/v）次氯酸鈉溶液中消毒7 min，用高溫滅菌處理后的蒸餾水洗滌6次。將種子播種在海綿育苗盤中，用蒸餾水暗培養(yǎng)7 d催芽[19]，然后放置在人工智能培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21 d（白天28℃，14 h，晚上22℃，10 h，每24 h循環(huán)；濕度設置為60%），1～2 d使用蒸餾水培養(yǎng)，3～5 d（約長至兩片子葉）使用1/4 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)，5～7 d使用1/2 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)，然后7～14 d使用Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2 NtIAA17 基因全長cDNA的克隆

使用Eastep?Super Total RNA Extraction Kit（上海普洛麥格生物產品有限公司）提取煙草根、莖和葉組織部位的總RNA，測定所提總RNA的OD260/280值，并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，使用HiScript?III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）試劑盒（南京諾唯贊生物技術有限公司）進行反轉錄，得到cDNA。采用Primer Premier 5.0設計煙草NtIAA17全長基因序列擴增引物（F：5’-ATGTCATCGGAGAAATTCAAAG-3’；R：5’-TTAGCTT GTACTCGAGCATTTC-3’），以反轉錄的根、莖、葉混合cDNA為模板進行PCR擴增，PCR產物末端加polyA后經電泳回收后克隆到pMD19-T載體（TaKaRa公司），轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑選陽性單克隆，然后送武漢伯遠生物科技有限公司進行測序，獲得全長 cDNA 序列信息[20]。

表1 qRT-PCR引物序列Tab. 1 qRT-PCR primer sequence

1.3 NtIAA17基因生物信息學分析

對測序結果進行生物信息學分析，使用ProtParam （http://web.expasy.org/protparam/） 預 測基因編碼數(shù)量、蛋白質相對分子量和理論等電點；用NCBI數(shù)據庫查找相關基因及其氨基酸序列，使用DNAMAN6.0（Lynnom Biosoft，美國）對氨基酸序列進行比對；使用PlantCare（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/）檢測啟動子區(qū)域中含有的順式作用元件；通過MEGA6.0軟件中的Neighbor-Joinning（NJ）算法構建了系統(tǒng)發(fā)育樹[21]。

1.4 NtIAA17-GFP融合蛋白的亞細胞定位

在煙草原生質體中分析NtIAA17的亞細胞定位，使用聚乙二醇介導的轉化將重組35S：NtIAA17-GFP和35S：GFP質粒導入從葉片組織中獲得的煙草原生質體中。用共聚焦激光掃描顯微鏡在轉化后16～20 h捕獲熒光信號[22]。核定位標記蛋白（NLS）如Shcherbo et al，2007所述[23]。

1.5 NtIAA17基因表達模式分析

1.5.1NtIAA17基因的組織特異性表達分析

培養(yǎng)10周的煙株用NaCl (150 mmol/L) 脅迫處理7 d，分別提取樣品根、莖、新葉和老葉（新葉為完全展開的葉片從上往下數(shù)第二片，老葉為完全展開的葉片從上往下數(shù)第七片）的總RNA，反轉錄成cDNA，并分析NtIAA17基因在煙草各個組織中的相對表達量。

1.5.2 鹽脅迫時間長度下煙草NtIAA17基因表達分析

培養(yǎng)約21 d的煙苗用NaCl (150 mmol/L) 脅迫處理，分別于0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、12 h后，提取煙草的總RNA，反轉錄成cDNA，并分析NtIAA17基因在NaCl（150 mmol/L）處理后的相對表達量變化情況。

1.5.3 實時熒光定量PCR

提取煙草根、莖和葉組織部位的總RNA,反轉錄后作為qRT-PCR反應的模板。煙草IAA17基因擴增引物qRT-NtIAA17的設計采用Primer Premier 5.0 軟件。qRT-PCR反應用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 熒光定量試劑盒（南京諾唯贊生物技術有限公司）說明書進行，3次重復，內參基因為煙草組成型表達基因NtL25（NCBI登錄號：L18908.1）。數(shù)據用2-△△Ct法處理。

1.6 pCAMBIA1305-NtIAA17過表達載體的構建及遺傳轉化

根據基因克隆測序正確的NtIAA17基因序列設計構建過量表達載體的引物（NtIAA17-OX），以測序正確的NtIAA17cDNA克隆為模板擴增NtIAA17的全長序列（NCBI ID：XM_016635452.1），將PCR產物連接到pCAMBIA1305載體中，該載體由花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動子和胭脂堿合成酶終止子驅動，轉化DH5α感受態(tài)細胞，經過菌液PCR檢測對比后，得到過表達載體pCAMBIA1305-NtIAA17。利用電轉化將其轉入農桿菌GV3101感受態(tài)細胞中，篩選得到陽性克隆，用陽性菌液侵染野生型煙草（Nicotiana tabacumcv，K326）中[20]，室內繁種，收取轉基因植株T0代種子，而后加代獲得T2代純合植株用于本研究。

1.7 轉基因煙草株系的耐鹽性鑒定

1.7.1 觀察煙草表型并記錄整株生物量

將野生型和過表達株系OX1、OX2用上述水培法培養(yǎng)約21 d，用NaCl（150 mmol/L）脅迫處理7 d后，觀察60株煙苗的整體表型并記錄單株生物量。

1.7.2 MDA，脯氨酸的測定

通過MadhavaRao和Sresty（2000）的方法測定MDA含量[24]。使用茚三酮比色法測定游離脯氨酸含量[25]。

1.7.3 抗氧化酶相關基因的測定

qRT-PCR反應用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 熒光定量試劑盒（南京諾唯贊生物技術有限公司），測定NtSOD、NtPOD基因的相對表達量。

1.8 統(tǒng)計分析

使用t檢驗比較兩個樣本組，結果用平均值和相應的標準誤差表示。使用IBM SPSS Statistics軟件版本21（IBM）進行統(tǒng)計分析。圖片使用Origin2018（Origin Labinv，Northampton，MA，USA）軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 NtIAA17的克隆和序列分析

以煙草cDNA為模板，利用特異性引物NtIAA17-OX進行PCR擴增，獲得NtIAA17基因片段, 目標條帶與瓊脂糖凝膠電泳顯示的結果大小一致（Marker條帶為2000 bp）（圖1），對測序結果進行分析表明，NtIAA17基因片段為 624 bp，編碼207個氨基酸（圖2），NtIAA17蛋白的相對分子質量為23.07 kD，理論等電點（pl）為8.24。

圖1 NtIAA17基因的PCR擴增Fig. 1 PCR amplification of NtIAA17 gene

圖2 煙草NtIAA17的全長cDNA序列及其編碼的氨基酸Fig. 2 cDNA full length sequence and deduced amino acid sequence of tobacco NtIAA17

2.2 NtIAA17蛋白生物信息學分析

2.2.1NtIAA17基因同源序列比對及進化分析

利用DNAMAN軟件將NtIAA17與其他物種氨基酸序列進行同源比對,結果顯示，NtIAA17的蛋白序列具有Aux/IAA家族的四個典型結構域（I-IV），表明NtIAA17是煙草Aux/IAA蛋白（圖3）。利用MEGA 6.0軟件進行系統(tǒng)進化樹分析表明NtIAA17基因與菠菜MoIAA13基因（ID：XM_021983619.1）的親緣關系最近（圖4）。

圖3 NtIAA17與其同源氨基酸序列比對Fig. 3 Sequence alignment of NtIAA17 and its homologous amino acid

圖4 煙草NtIAA17及其同源氨基酸序列的進化樹分析Fig. 4 Phylogenetic tree analysis of sequence of tobacco NtIAA17 and its homologous amino acid

2.2.2NtIAA17基因啟動子序列分析

由圖5可知，NtIAA17啟動子區(qū)含有多種順式作用元件，例如防衛(wèi)和脅迫響應順式作用元件，如W-box、MYB；鹽脅迫誘導型啟動子，如G-box、Box-III；植物激素響應元件，如TGA-element、Auxr r-core、ABRE。

圖5 NtIAA17的啟動子序列分析Fig. 5 Promoter sequence analysis of NtIAA17

2.2.3 NtIAA17亞細胞定位分析

通過在煙草原生質體中驗證NtIAA17的亞細胞定位發(fā)現(xiàn)，如圖6所示，NtIAA17-GFP的GFP熒光位置與NLS核定位標記蛋白的位置完全匹配，結果表明NtIAA17定位在細胞核內。

圖6 NtIAA17的亞細胞定位Fig. 6 Subcellular localization of NtIAA17

2.3 NtIAA17基因的表達模式分析

對檢測不同煙草組織中NtIAA17基因的組織特異性表達的結果表明，NtIAA17在莖中表達量最高, 老葉中其次, 新葉中最低（圖7A）。培養(yǎng)21 d的煙苗用高鹽NaCl（150 mmol/L）脅迫處理，分別于0 h，1 h，2 h，4 h，6 h，12 h取樣測定煙草中NtIAA17的相對表達水平，結果顯示高鹽脅迫上調煙草中NtIAA17基因的表達，在2 h時，NtIAA17的表達量最高（圖7B）。這些發(fā)現(xiàn)表明，NtIAA17基因參與了植物生長發(fā)育，鹽脅迫可以調控NtIAA17基因表達。

圖7 NtIAA17在煙草不同器官和鹽脅迫時間長度的表達模式。Fig. 7 Expression patterns of NtIAA17 in different tobacco organs under different salt stress duration

2.4 鹽脅迫對NtIAA17轉基因煙草生物量表型及抗氧化活性的影響

為了研究NtIAA17的功能，通過轉基因技術獲得了10個過量表達煙草株系（T0代轉基因煙草株系與野生型K326植株在大田生育期無顯著差異），進一步通過qRT-PCR分析鑒定了兩個過量表達效果較好的煙草轉基因株系（命名為OX1和OX2）（圖8A）。為了研究鹽脅迫下NtIAA17的功能，檢測了煙草的耐鹽表型和單株生物量。在對照條件下，過表達NtIAA17-OX和野生型（WT）煙草之間的表型和生物量沒有顯著差異。在高鹽脅迫NaCl（150 mmol/L）條件下，NtIAA17-OX煙株的長勢較好，生物量更高（圖8B，C，D），這表明NtIAA17的過表達可以增加煙草的生物量，緩解鹽脅迫帶來的傷害。通過測定丙二醛（MDA）和脯氨酸含量可知，與高鹽脅迫下的野生型相比，過表達NtIAA17煙草植物顯著減少了MDA的積累，增加了游離脯氨酸的含量（圖8E，F(xiàn)），進一步對抗氧化酶相關基因進行qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫條件下，NtIAA17-OX煙草的NtSOD、NtPOD的表達量明顯高于野生型（圖9）。這表明NtIAA17的過表達可以增強煙草的抗氧化能力。

圖8 鹽脅迫對NtIAA17轉基因煙草表型和抗氧化活性的影響Fig. 8 Effect of salt stress on the phenotype and antioxidant activity of NtIAA17 transgenic tobacco

圖9 鹽脅迫對NtIAA17轉基因煙草抗氧化酶基因的影響Fig. 9 Effect of salt stress on antioxidant enzyme genes of NtIAA17 transgenic tobacco

3 討論

Aux/IAA蛋白是生長素反應因子，通過與生長素響應因子ARF蛋白相互作用來介導生長素信號通路[26]，可調節(jié)下游多種生長素反應基因的表達，該基因在調控植物的生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用[27]。先前的研究表明，Aux/IAA家族基因的功能在許多作物中均有研究，但關于Aux/IAA家族在煙草中的功能研究還不夠深入。在本研究中，從煙草中分離了NtIAA17基因，并首次在煙草中進行了功能研究。NCBI網站上的Blastp分析顯示，NtIAA17與其他植物Aux/IAA基因具有高度相似性，并且與菠菜MoIAA13（ID：XM_021983619.1）的關系最為密切。Aux/IAA 基因家族是一個生長素誘導表達的多基因家族[28]，包含四個保守的結構域I、II、III和IV。結構域I具有轉錄抑制功能[29]。結構域II是生長素信號轉導的必需元件，與F-box蛋白TIR1相互作用，導致Aux/IAA的不穩(wěn)定性和快速降解[30]。結構域III和IV能與其他Aux/IAA或ARF相互作用，形成同源二聚體和異源二聚體，抑制生長素反應基因轉錄，影響信號轉導[31]。NtIAA17具有四個高度保守的結構域（I-IV），是典型的Aux/IAA蛋白，屬于Aux/IAA家族成員，此外，亞細胞定位結果顯示NtIAA17蛋白位于細胞核中。

啟動子作為調控基因表達的重要元件, 通過分析啟動子區(qū)所含有的順式作用元件可以推斷下游基因編碼蛋白可能具有的功能[32]，其中的順式作用元件可以與轉錄因子相結合，應答相關基因轉錄[33]。啟動子分析結果表明，煙草NtIAA17基因的啟動子區(qū)域存在有多種激素響應和脅迫響應的順式作用元件，其中發(fā)現(xiàn)NtIAA17啟動子存在鹽脅迫誘導型元件和生長素響應元件，推斷該基因可能參與調控下游生長素相關基因表達，并可能在調節(jié)煙草的生長發(fā)育和耐鹽性中起關鍵作用。

Aux/IAA家族基因廣泛參與植物生長發(fā)育的調控，還可以參與響應不同環(huán)境脅迫[34]。前人研究發(fā)現(xiàn)，香蕉MaIAA20、MaIAA25均可響應干旱、高鹽、高溫等逆境脅迫，在鹽脅迫下，MaIAA15也顯著上調表達，增強香蕉的耐鹽性[35]。水稻OsIAA6基因由干旱脅迫高度誘導，其在轉基因水稻中過表達，可能通過調控生長素蛋白生物合成基因提高對干旱脅迫的耐受性[36]。本實驗中，NtIAA17基因的表達模式分析表明，NtIAA17基因在煙草的根、莖、新葉和老葉中均有表達，但表達量存在明顯差異，在莖和老葉中高表達，結果表明NtIAA17基因具有組織特異性并參與煙草生長發(fā)育過程。NtIAA17的表達水平是在鹽脅迫條件下誘導的，并且在鹽脅迫處理2 h的表達量最高，這表明NtIAA17可能在調節(jié)煙草的耐鹽性中起重要作用。

為了驗證NtIAA17的功能，通過轉基因技術，研究了過量表達NtIAA17對煙草生長發(fā)育的影響。通過分析在高鹽脅迫（NaCl 150 mmol/L）條件下的表型和生物量發(fā)現(xiàn)，與野生型煙草相比，NtIAA17過表達顯著增加了轉基因植物的生物量，這表明NtIAA17基因參與調控在鹽脅迫下的生長發(fā)育。

前人的研究表明，滲透脅迫通常會導致更多的脯氨酸積累，而脯氨酸的積累水平與耐鹽性有關[37-38]。在這項研究中，鹽脅迫條件下，NtIAA17-OX轉基因煙草植物的脯氨酸含量明顯高于野生型，以保護細胞膜免受鹽誘導的傷害，并參與細胞質滲透壓平衡的調節(jié)，提高植物對鹽脅迫的耐受性。而MDA含量可反映膜脂過氧化損傷程度[39]，在本研究中，與野生型相比，鹽脅迫下，NtIAA17-OX轉基因煙草植物中MDA含量積累顯著降低。NtIAA17過表達可調節(jié)鹽脅迫下抗氧化酶相關基因如NtSOD、NtPOD的表達，因此，以上結果表明，NtIAA17-OX轉基因植物提高煙草在高鹽脅迫下的生物量可能是由于提高了煙草的抗氧化能力。

4 結論

Aux/IAA 家族基因參與調控植物生長發(fā)育過程，本研究首次從普通煙草K326中克隆并鑒定了一個Aux/IAA家族基因NtIAA17，亞細胞定位結果表明該蛋白是一個核蛋白，調控煙草的生長發(fā)育；啟動子和表達模式分析表明該基因受鹽脅迫誘導表達，參與應答鹽脅迫反應。進一步通過轉基因技術，獲得NtIAA17基因過量表達的轉基因株系，生理試驗初步表明NtIAA17可以通過調控煙草的抗氧化能力，抵御鹽脅迫帶來的危害，增加轉基因煙草的在鹽脅迫下的生物量，影響煙株的生長發(fā)育；本研究為后續(xù)普通煙草耐鹽脅迫分子機制研究和耐鹽新品種的培育提供候選基因和理論依據。