宋中邦，隋學藝，張誼寒，王亞輝，趙高坤，李勇，王丙武，劉加紅，解燕，楊世波，顧華國*

1 云南省煙草農業(yè)科學研究院/煙草行業(yè)煙草生物技術育種重點實驗室/國家煙草基因工程研究中心，昆明 650021；2 云南省煙草公司曲靖市公司，曲靖 655000；3 云南香料煙有限責任公司，保山 678000

栽培煙草（Nicotiana tabacum）是兩個祖先絨毛狀煙草（N. tomentosiformis）和林煙草（N. sylvestris）通過種間雜交形成的異源四倍體，其葉片生物堿譜與兩個祖先種存在顯著差異。大部分栽培煙草的綠色及衰老葉片中煙堿是主要生物堿，約占生物堿總量的90%～95%。絨毛狀煙草在綠色及衰老葉片中均積累去甲基煙堿；而林煙草在綠色葉片中主要積累煙堿，但在葉片衰老過程中大部分煙堿轉化為去甲基煙堿[1-2]。白肋煙“非轉化株”（Non-converter）葉片的主要生物堿為煙堿，但其子代群體中約有20%單株能發(fā)生自發(fā)突變，煙葉內的煙堿通過去甲基酶的作用轉化為去甲基煙堿，從而使去甲基煙堿成為煙葉中積累的主要生物堿之一，這樣的突變株稱為“轉化株”（Converter）[3]。烤煙也會發(fā)生類似自發(fā)突變導致其煙葉主要累積去甲基煙堿，且突變株烤后煙葉表面呈現(xiàn)紅色斑點，國外學者稱為“Cherry-red”[4-6]，我國民間稱之為“硃砂煙”。硃砂煙出現(xiàn)概率極低，有研究表明在538個單株中發(fā)現(xiàn)3株硃砂煙，概率僅為0.56%[5]。硃砂煙具有獨特的“糯米香”，云南地區(qū)煙民抽吸水煙筒時會將硃砂煙葉作為調香原料。

煙堿去甲基酶催化煙堿脫甲基產生去甲基煙堿，目前煙草基因組中煙堿去甲基酶基因家族共有4個功能基因被克隆，分別為CYP82E4、CYP82E5、CYP82E10、CYP82E21[7-12]。CYP82E21基因雖能編碼具有活性的煙堿去甲基酶，但僅在花藥中表達，不影響葉片去甲基煙堿含量[11]。研究表明白肋煙“轉化株”中CYP82E5、CYP82E10基因對去甲基煙堿合成無明顯貢獻，而CYP82E4在白肋煙“轉化株”受未知機制誘導高水平表達，是導致“非轉化株”自發(fā)突變成“轉化株”的關鍵基因[12]?！胺寝D化株”中過表達該基因可以顯著提高葉片煙堿轉化率（nicotine conversion rate，NCR，去甲基煙堿/（煙堿+去甲基煙堿）×100%），而通過RNAi抑制轉化株CYP82E4基因表達、轉化株中CYP82E4基因突變均能導致煙堿轉化率顯著下降[9-10]?？緹熤蠧YP82E4基因表達水平極低，煙堿去甲基化反應主要由CYP82E5、CYP82E10催化。云煙87中CYP82E4、CYP82E5、CYP82E10基因三突材料的葉片去甲基煙堿含量比對照下降約90%[13]。因堿譜類似白肋煙“轉化株”，推測烤煙“轉化株”（硃砂煙）中CYP82E4基因也可能被誘導高水平表達，導致其煙葉中主要累積的生物堿為去甲基煙堿。

硃砂煙作為一種自發(fā)突變材料，其突變概率可能受到品種、土壤、營養(yǎng)、生態(tài)等因素的影響。本研究對硃砂2號開展農藝、遺傳、基因、化學等特征特性分析，可為今后進一步研究硃砂煙成因提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2019年在云南省煙草農業(yè)科學研究院玉溪研和試驗基地發(fā)現(xiàn)云煙87部分單株烤后產生硃砂煙，留杈套袋自交收種獲得硃砂2號種子。

1.2 方法

1.2.1 田間試驗

2020年度硃砂2號在云南省煙草農業(yè)科學研究院玉溪研和試驗基地進行品比試驗，田間生產參考當?shù)卦茻?7的配套措施。設3個小區(qū)，每個小區(qū)種植100株左右，打頂后隨機選取10株調查農藝性狀?？竞鬅熑~根據(jù)硃砂紅色深淺程度人工分成淺紅、中等紅色、深紅3組進行相關研究。硃砂煙比率=當爐硃砂煙葉重量/當爐烤后煙葉總重×100%。

1.2.2 定量PCR分析

分別在煙株田間生長的團棵期、現(xiàn)蕾期、打頂后3個時期對煙株中部葉片液氮取樣后-80℃保存?zhèn)溆?。提取總RNA，反轉錄獲得cDNA第一鏈（PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，Takara）。采用SYBR Green法（SYBR Green l Master Mix，Roche）對目標基因進行熒光實時定量PCR（qRT-PCR）分析（LightCycler 480，Roche），定量引物如表1所示。

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequences

1.2.3 生物堿檢測

烤后取中部煙葉用于化學成分檢測，設6個生物學重復。生物堿檢測：內標喹啉、去甲基煙堿購自Sigma-Aldrich公司，煙堿購自TRC公司，檢測儀器為Bruker 450GC-300MS氣相色譜-串聯(lián)質譜儀（Bruker）。準確稱取煙樣0.5 g于50 mL離心管中，加入5 mL 10%的NaOH溶液，搖勻，浸泡15 min，加入20 mL含內標的萃取液，超聲60 min，在離心機上5000 r/min離心5 min，取2 mL下層二氯甲烷清液過裝有2 g無水硫酸鈉的微孔過濾器后，用氣相色譜-串聯(lián)質譜儀分析[14]。

2 結果與分析

2.1 硃砂2號田間農藝性狀及硃砂煙葉產出規(guī)律

國外有文獻記載[4-6]，烤煙品種高轉化株的烤后煙葉也呈紅色，被命名為“Cherry-red”。2019年烤煙生產季在云南省煙草農業(yè)科學研究院玉溪研和試驗基地發(fā)現(xiàn)云煙87部分單株烤后煙葉呈紅色（圖1），這種外觀初烤煙葉在云南煙區(qū)長期存在，被煙農稱為“硃砂”煙，因此推測“硃砂”煙葉即是“Cherryred”煙，將該資源命名為硃砂2號。2020年烤煙生產季，對硃砂2號和對照云煙87進行了品系比較試驗。田間試驗結果表明，硃砂2號田間長勢強、煙株整齊度較高，株型、葉色、生育期等性狀與云煙87基本一致。硃砂2號打頂株高130.2 cm，有效葉片數(shù)26.5，莖圍10.0 cm，腰葉長寬分別為64.2 cm和30.5 cm，各項指標與對照云煙87相當（表2）。烘烤試驗分5次采烤完畢，按每一爐烤后獲得煙葉總質量及硃砂煙葉質量計算硃砂煙比率。根據(jù)圖2所示，下部葉也有一定比率硃砂煙葉產生，隨著葉位增高，硃砂煙比率迅速上升，最后一爐硃砂煙比率高達87.5%，整體硃砂煙產出率為64.3%。

圖1 硃砂煙葉烤后表型Fig. 1 Cherry-red phenotype of Zhusha tobacco leaves

圖2 不同烘烤階段硃砂煙葉比例Fig. 2 The percentage of Zhusha tobacco leaves in different curing stages

表2 硃砂2號農藝性狀Tab. 2 The agronomic traits of Zhusha2 tobacco

2.2 硃砂煙特征基因和化合物研究

生物堿分析表明，同田種植的云煙87烤后煙葉煙堿含量為1.59%，去甲基煙堿含量為0.09%，煙堿轉化率為5.12%（圖3）。硃砂2號煙葉的堿譜與云煙87不同，其主要生物堿為去甲基煙堿，顏色呈淺紅、中等紅色、深紅的硃砂煙葉去甲基煙堿含量依次增加，分別為0.97%、1.25%、1.78%，對應的煙堿轉化率分別為86.95%、90.86%、93.85%（圖3）。硃砂煙葉煙堿含量顯著低于云煙87，分別為0.15%、0.13%、0.12%（圖3）。目前已知CYP82E2基因家族的4個成員能夠編碼具有功能的煙堿去甲基酶基因，為明確硃砂2號高煙堿轉化率的原因，利用qPCR分析了鮮煙葉中上述基因的表達水平（圖4）。CYP82E21在云煙87和硃砂2號中均不表達，CYP82E5、CYP82E10表達水平在硃砂2號中更低。云煙87中CYP82E4不表達，但該基因在硃砂2號中高水平表達，可能是硃砂煙高煙堿轉化率的內在原因。

圖3 硃砂煙葉生物堿譜Fig. 3 Alkaloid profile of Zhusha tobacco leaves

注：誤差線代表6個生物學重復，*表示與對照云煙87相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.3 硃砂煙不同生育期CYP82E4基因表達模式及煙堿轉化率分析

為明確硃砂2號生長過程中CYP82E4基因表達水平變化及其導致的堿譜變化規(guī)律，采集團棵期、現(xiàn)蕾期、打頂后大田植株的中部煙葉進行分析（圖5）。各時期云煙87樣品中均未檢測到CYP82E4基因表達，但硃砂2號中CYP82E4基因隨著煙株生長發(fā)育水平逐步上升。云煙87中煙堿轉化率在不同生長時期無明顯差異，而硃砂2號煙堿轉化率在不同時期均顯著高于云煙87，且隨著生長發(fā)育逐步上升，與CYP82E4基因表達水平變化趨勢一致（圖5）。

圖5 全生育期CYP82E4基因表達模式及煙堿轉化率分析Fig. 5 The CYP82E4 expression pattern and NCR during different growth periods

2.4 硃砂煙遺傳穩(wěn)定性分析

硃砂2號套袋自交收種后在漂浮盤播種，苗期隨機選擇單株進行CYP82E4基因表達水平分析及生物堿檢測（圖6）。云煙87葉片中無法檢測到CYP82E4基因表達，但所有硃砂2號樣品的CYP82E4基因高水平表達。相比之下，所有硃砂2號樣品的煙堿轉化率均遠高于云煙87。上述硃砂2號單株烤后煙葉均呈現(xiàn)明顯的硃砂特征，表明硃砂煙可以穩(wěn)定遺傳。

圖6 CYP82E4基因表達水平及煙堿轉化率分析Fig. 6 Analysis of the CYP82E4 expression level and NCR

3 討論

栽培煙草中的去甲基煙堿含量通常低于總生物堿的5%，然而在白肋煙“轉化株”中，煙堿被大量轉化為去甲基煙堿，使后者比例可高達95%。通過比較“轉化株”和“非轉化株”葉片基因微矩陣[15]差異，發(fā)現(xiàn)CYP82E2基因家族基因表達存在差異?；赗NAi沉默CYP82E2基因家族基因和酵母異源表達實驗發(fā)現(xiàn)CYP82E4基因為煙堿轉化為去甲基煙堿的重要基因[12]。根據(jù)qPCR結果，栽培烤煙品種云煙87煙葉中CYP82E4基因表達水平極低，往往低于檢測限。相比之下，硃砂2號中CYP82E4基因被誘導表達，從而導致煙葉中煙堿大部分被轉化成去甲基煙堿。這與白肋煙中CYP82E4基因被誘導表達，導致“非轉化株”向“轉化株”轉化相似。

硃砂煙和白肋煙“轉化株”子代中CYP82E4基因仍保持高表達，表明該性狀能穩(wěn)定遺傳，但烤煙和白肋煙中誘導CYP82E4基因高表達的機制尚不明確。據(jù)統(tǒng)計，烤煙品種自然條件下，自發(fā)突變產生硃砂煙的概率約為0.56%，遠低于白肋煙“轉化株”產生概率20%，這可能由烤煙和白肋煙基因組水平差異引起。Sanger測序表明普通烤煙、硃砂煙、白肋煙“轉化株”、白肋煙“非轉化株”的CYP82E4基因上游啟動子2000 bp區(qū)域堿基序列完全一致（數(shù)據(jù)未發(fā)表），可以推測CYP82E4基因誘導表達與啟動子DNA一級結構關聯(lián)不大。因此，推測與白肋煙“轉化株”形成相似，田間硃砂煙自發(fā)突變形成可能也受到表觀遺傳控制。CYP82E4基因誘導機理、白肋煙和烤煙中是否存在不同誘導機制需要進一步研究。

4 結論

硃砂煙基因及化學特征主要表現(xiàn)為煙堿去甲基酶基因CYP82E4被激活表達，導致去甲基煙堿成為主要生物堿，硃砂煙農藝性狀與對照相比無顯著差異，烤后煙葉硃砂紅性狀能夠穩(wěn)定遺傳。