鄧凱翔 黃津

作者單位：1 福建醫(yī)科大學(xué)附屬南平第一醫(yī)院中醫(yī)康復(fù)科，福建 南平 353000

2 福建省第二人民醫(yī)院感染科，福建 福州 350003

牡蠣肽（Oyster peptide，OP）屬性微寒、味咸，具有多種生物功效，包括調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抗腫瘤等，在我國中醫(yī)史籍《千金要方》、《本草綱目》中均有詳細(xì)記載[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，牡蠣提取物可以改善酒精性肝病患者的肝臟酶系統(tǒng)，穩(wěn)定肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，長期服用可以軟化肝臟，具有平肝潛陽、軟堅(jiān)散結(jié)之效。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究也顯示，其可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖、活化、凋亡，對不同組織器官均有一定的抗纖維化作用[2]。有研究發(fā)現(xiàn)核因子-κB（NF-κB）/iNOS 信號途徑在肝星狀細(xì)胞（Hepatic stellate cell，HSC）實(shí)驗(yàn)方面有重要作用，可以促進(jìn)HSC 凋亡，減少細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）成分的表達(dá)[3]。本研究通過大鼠肝纖維化模型了解牡蠣肽對肝組織NFκB、iNOS 表達(dá)的影響并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物清潔級SD 大鼠50 只，體重200～220g，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供[SCXK（閩）2018-0004]，雌雄各半，雌雄分開適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為5 組，每組10只。實(shí)驗(yàn)方案通過我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑OP（中國食品工業(yè)發(fā)酵研究院）；NF-κB p65 抗體、兔抗人iNOS 單克隆抗體（杰圣德生物有限公司，武漢）；CCl440ml+花生油60ml（第四化學(xué)試劑廠，天津）；RT-PCR 試劑盒（Sigma 公司，美國）；NO 檢測試劑盒（建成公司，南京）。

1.3 分組①正常組（A 組）：腹腔內(nèi)每周注射3 次等體積生理鹽水；②模型組（B 組）：腹腔內(nèi)每周注射2 次40% CCl4花生油溶液0.2ml/100g；③OP 低、中、高劑量組（C 組、D 組、E 組）：造模同時(shí)分別予OP 0.5g/kg、1.0g/kg、2.0g/kg。采用離體消化分離大鼠HSC，并對細(xì)胞活性及純度進(jìn)行鑒定[3]。

1.4 方法

1.4.1 免疫組織化學(xué)檢測肝組織Ⅰ、Ⅲ型膠原 每張切片觀察10 個(gè)高倍視野，記錄顯色程度和范圍。顯色程度用弱、中、強(qiáng)表示；顯色范圍占高倍視野＜1/4 時(shí)記（+）、1/4～2/4（++），2/4～3/4（+++），＞3/4（++++）。將顯色程度和范圍換算成顯色指數(shù)，即顯色指數(shù)=顯色程度×顯色范圍（+、++、+++、++++分別按1、2、3、4 分計(jì)算），以10 個(gè)視野顯色指數(shù)的平均數(shù)為蛋白表達(dá)的顯色指數(shù)。

1.4.2 吖啶橙/溴化乙錠（AO/EB）雙重染色檢測HSC凋亡 細(xì)胞凋亡率計(jì)算公式：細(xì)胞凋亡率=（凋亡早期細(xì)胞數(shù)+凋亡晚期細(xì)胞數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4.3 RT-PCR 檢測肝組織NF-κB 和iNOS mRNA 提取肝組織總RNA，進(jìn)行總RNA 純度分析、cDNA合成，PCR 反應(yīng)引物序列：iNOS（232bp）上游5'-CGAAAGGGGAATGGATGGC-3'，下游5'-ATTGCAG CGAAGTATTTGAACG-3'；NF-κB（164bp）上游5'-CGGGTTTGAGGCTGCTAT-3'，下游5'-CTCCTTTAC TCCCAGTTCTG-3'；β-actin（202bp）上游5'-GGT AAAACCTGCTATCCAACA-3'，下游5'-GGACTCAT CTCGTACCTGCT-3'。擴(kuò)增PCR 反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性1min 30s；94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)30 次；72℃延伸5min。以NF-κB/β-actin、iNOS/β-actin 表示mRNA。

1.4.4 Western blot 法檢測肝組織NF-κB、iNOS 蛋白肝組織總蛋白的提?。喊迅谓M織剪切成細(xì)小的碎片，加入RIPA 裂解液，混勻。RIPA 裂解液在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF 的最終溶度為1mM。按常規(guī)方法進(jìn)行蛋白檢測，采用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯影，結(jié)果以NF-κB/GAPDH、iNOS/GAPDH 表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0 軟件分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肝組織Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)比較A 組匯管區(qū)和中央靜脈管壁可見少量Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)。B組匯管區(qū)中可見大量Ⅰ、Ⅲ型膠原增生，呈棕褐色。與B 組比較，A 組、C 組、D 組、E 組的Ⅰ、Ⅲ型膠原均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ⅰ型膠原：F=65.32，P＜0.05；Ⅲ型膠原：F=57.49，P＜0.05）；與D 組比較，C 組的Ⅰ、Ⅲ型膠原均增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C 組、D 組與E 組比較，Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達(dá)情況（μg/L，±s）

表1 各組Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達(dá)情況（μg/L，±s）

注：與B 組比較，aP＜0.05；與E 組比較，bP＜0.05；與D 組比較，cP＜0.05

分組nⅠ型膠原Ⅲ型膠原A 組101.523±0.284a1.278±0.273a B 組106.904±0.4207.952±0.433 C 組105.321±0.312abc4.943±0.367abc D 組103.416±0.312ab3.262±0.239ab E 組102.314±0.352a2.143±0.341a

2.2 各組HSC 凋亡率比較B 組HSC 凋亡率為（3.89±0.59）%，C 組為（5.97±1.46）%，D 組為（21.85±3.98）%，E 組為（32.64±5.06）%。B 組和C 組之間HSC 凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；經(jīng)中高劑量OP 干預(yù)后HSC 凋亡率與其他各組比較明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 OP 處理前后HSC AO/EB 雙重染色結(jié)果（×40）

2.3 各組NF-κB 和iNOS mRNA 表達(dá)比較A 組NF-κB、iNOS mRNA 僅有少量表達(dá)，B 組表達(dá)明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。OP 干預(yù)組NF-κB、iNOS 表達(dá)較B 組明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；隨著OP 劑量的增加，NF-κB、iNOS mRNA 表達(dá)逐漸減少，各干預(yù)組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2、表3。

表3 各組NF-κB、iNOS mRNA 表達(dá)（±s）

表3 各組NF-κB、iNOS mRNA 表達(dá)（±s）

注：與B 組比較，aP＜0.05；與E 組比較，bP＜0.05；與D 組比較，cP＜0.05

分組nNF-κBiNOS A 組100.213±0.062a0.328±0.062a B 組101.432±0.2571.731±0.316 C 組100.957±0.203abc 0.889±0.183abc D 組100.513±0.154ab0.613±0.114ab E 組100.291±0.048a0.273±0.053a

圖2 各組NF-κB、iNOS mRNA 表達(dá)

2.4 各組NF-κB 和iNOS 蛋白表達(dá)比較A 組NF-κB、iNOS 蛋白表達(dá)較少，B 組表達(dá)明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各OP 干預(yù)組NF-κB、iNOS 表達(dá)較B 組明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；隨著OP 劑量的增加，NF-κB、iNOS 蛋白表達(dá)逐漸減少，各干預(yù)組之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 各組NF-κB、iNOS 蛋白表達(dá)（±s）

表4 各組NF-κB、iNOS 蛋白表達(dá)（±s）

注：與B 組比較，aP＜0.05；與E 組比較，bP＜0.05；與D 組比較，cP＜0.05

分組nNF-κBiNOS A 組100.194±0.081a0.102±0.053a B 組101.283±0.1281.101±0.253 C 組100.898±0.189abc 0.752±0.148abc D 組100.449±0.063ab0.497±0.081ab E 組100.212±0.051a0.189±0.065a

3 討論

OP 是通過肽分子生物技術(shù)將牡蠣酶解制作而成，屬于小分子低聚肽，完全保留牡蠣原有的營養(yǎng)成分，比氨基酸、蛋白質(zhì)吸收效率高，在機(jī)體代謝方面具有更佳的生物活性，比普通牡蠣制品的生物效價(jià)更高[4]。本研究通過AO/EB 染色檢測OP 對HSC生長情況的影響，發(fā)現(xiàn)OP 具有抑制HSC 凋亡的作用，提示牡蠣小分子肽可能參與肝纖維化的修復(fù)。

肝纖維化的主要病理特征是ECM 的過度增生和沉積，HSC 可通過肝細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等旁分泌的NF-κB 刺激轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，活化、增殖并自分泌NF-κB，進(jìn)而促進(jìn)HSC 進(jìn)一步活化，不斷合成ECM，肝纖維化得以持續(xù)進(jìn)展[5]。在HSC 活化早期，NF-κB 可刺激ECM 的合成與分泌，其中主要包括促進(jìn)Ⅰ、Ⅲ型膠原等的合成[6]。早期臨床研究發(fā)現(xiàn)肝硬化患者NF-κB 濃度較正常對照組明顯增高，同時(shí)Ⅰ、Ⅲ型前膠原含量也明顯增加，并與NF-κB 呈正相關(guān)[7，8]，說明NF-κB 可刺激硬化肝組織合成ECM。

iNOS 在除神經(jīng)元外的多種細(xì)胞中均有表達(dá)，催化NO 生成速度慢、量較多，造成細(xì)胞和組織損傷[9，10]。本研究免疫組化染色結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)較對照組明顯增高，而OP 干預(yù)組表達(dá)均較模型組減少，尤其以O(shè)P 高劑量組最顯著?？赏普揙P 具有減少細(xì)胞外基質(zhì)成分Ⅰ、Ⅲ型膠原合成，防治肝纖維化的作用。同時(shí)檢測NF-κB、iNOS mRNA 在各組中的表達(dá)，結(jié)果顯示NF-κB、iNOS mRNA 在模型組中高表達(dá)，在OP干預(yù)組表達(dá)明顯減少，模型組與OP 干預(yù)組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；同時(shí)NF-κB、iNOS蛋白的表達(dá)在各OP 干預(yù)組之間比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明可能存在劑量依賴性。由以上可知，OP 在減少Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)的同時(shí)可抑制纖維化肝組織NF-κB、iNOS 的表達(dá)。因此，推論OP 可能通過下調(diào)NF-κB 和iNOS 的表達(dá)，從而減少ECM 的合成，發(fā)揮防治肝纖維化的作用。

綜上所述，本研究通過細(xì)胞組織學(xué)、分子生物學(xué)等方面研究發(fā)現(xiàn)OP 可防治大鼠肝纖維化，具有一定劑量依賴性，經(jīng)過干預(yù)后肝組織Ⅰ、Ⅲ型膠原的增生受抑制，其抗肝纖維化機(jī)制可能與下調(diào)NFκB、iNOS 的表達(dá)有關(guān)，OP 可介導(dǎo)NF-κB/iNOS 信號通路的發(fā)生發(fā)展過程。