湯清涵,高潔,董潔,張啟清，陳軍

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 210023;2.江蘇省中醫(yī)外用藥開(kāi)發(fā)與應(yīng)用工程研究中心,江蘇 南京 210023；3.上海潔士寶日化集團(tuán)有限公司，上海 201400)

靈芝(Ganoderma lucidum)是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥,是一種藥食兩用大型真菌,不僅具有極高的藥用價(jià)值,還具有良好的美容護(hù)膚功效[1-2]。靈芝發(fā)酵液(Ganoderma lucidum fermentative liquid,GLFL)中含有蛋白多肽、多糖等多種活性成分,具有清除自由基、抗氧化、抗衰老、美白、保濕等護(hù)膚功效,將其作為功效成分添加在化妝品中正在成為產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)[3-4]。然而,GLFL中主要活性物質(zhì)多具有較強(qiáng)的親水性以及較大的相對(duì)分子質(zhì)量,從而不易穿過(guò)皮膚角質(zhì)層屏障,皮膚滲透性差,功效得不到充分發(fā)揮,是限制其實(shí)際應(yīng)用的瓶頸問(wèn)題。

神經(jīng)酰胺脂質(zhì)體(Cerosomes,CS)是一種新型皮膚局部給藥載體,是由磷脂、神經(jīng)酰胺、膽固醇等組成的具有類脂雙分子層結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體,具有優(yōu)良的穩(wěn)定性和皮膚耐受性[5-6]。研究表明,在脂質(zhì)體雙分子層中加入神經(jīng)酰胺可以顯著影響脂質(zhì)體的經(jīng)皮遞送效果,與普通脂質(zhì)體(Conventional liposomes,CL)相比,CS能夠顯著促進(jìn)藥物的經(jīng)皮滲透[7-8]。

本文選用水溶性大分子熒光素異硫氰酸酯-葡聚糖(Fluorescein isothiocyanate-dextran,FD)作為熒光探針,摻入GLFL中制成FD-GLFL-CS,以考察加入神經(jīng)酰胺對(duì)于脂質(zhì)體經(jīng)皮遞送效果的影響及其機(jī)制,為提高極性大分子的經(jīng)皮遞送效果提供制劑技術(shù)。

1 材料

RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);DZF-6020真空干燥箱(上海精宏儀器設(shè)備有限公司);Zetasizer Nano ZS90激光散射粒徑測(cè)定儀(英國(guó)馬爾文儀器有限公司);JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(浙江寧波新芝生物科技股份有限公司);S-4800掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司);HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司);TK-24BL透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀(上海鍇鎧儀器設(shè)備有限公司);LS55熒光分光光度計(jì)(美國(guó)PerkinElmer公司);DSC200F3差示掃描量熱儀(德國(guó)NETZSCH公司);Axio Scope. A1正置熒光顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司);VERTEX 70傅里葉變換紅外光譜儀(德國(guó)Bruker公司)。

靈芝發(fā)酵液(批號(hào):20200710,上海潔士寶日化集團(tuán)有限公司);大豆磷脂(批號(hào):SY-SI-190602,上海艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司);膽固醇(批號(hào):B80859,上海艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司);油溶性神經(jīng)酰胺3(批號(hào):201901219,韓國(guó)斗山集團(tuán));吐溫80(化學(xué)純,批號(hào):20190220,上海國(guó)藥集團(tuán));BCA試劑盒(批號(hào):20190910,北京索萊寶科技有限公司);FD(分子量:4 000,批號(hào):46955-500MG-F,美國(guó)Sigma公司);其它試劑均為市售分析純。

雄性SD大鼠,SPF級(jí),體質(zhì)量(200±20)g,購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,合格證號(hào):SCXK(浙)2019-0001。

2 方法

2.1 FD-GLFL脂質(zhì)體的體外經(jīng)皮遞送研究

2.1.1 FD-GLFL脂質(zhì)體的制備 采用薄膜分散法制備FD-GLFL脂質(zhì)體。將2.5 mg FD溶解在5 mL GLFL中得到FD-GLFL，按表1稱取處方量大豆磷脂、膽固醇、神經(jīng)酰胺3，加入5 mL乙醇超聲溶解，轉(zhuǎn)移至250 mL茄形瓶中，40 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30 min除去有機(jī)溶劑至瓶壁形成一層均勻的薄膜后，繼續(xù)真空旋蒸除盡剩余溶劑，真空干燥過(guò)夜，加入5 mL FD-GLFL溶液(含0.5 mg·mL-1FD，0.5%吐溫80)水合1 h，得到FD-GLFL-CS[C/S(1∶12)、C/S(1∶6)、C/S(1∶3)]混懸液。同法不加神經(jīng)酰胺3制成FD-GLFL-CL混懸液。冰水浴條件下探頭超聲4次(功率60 W，工作2 s，暫停2 s)，即得分散均勻的脂質(zhì)體，置于4 ℃保存。

表1 FD-GLFL脂質(zhì)體的處方

2.1.2 體外經(jīng)皮遞送實(shí)驗(yàn) 取2.1.1項(xiàng)下制備的各處方FD-GLFL脂質(zhì)體，高速離心(4 ℃，20 000 r·min-1，45 min)分離脂質(zhì)體與游離FD，沉淀用GLFL復(fù)溶，得到除去游離FD的各組FD-GLFL脂質(zhì)體樣品。取雄性SD大鼠，麻醉后除去腹部毛發(fā)，脫頸處死，剪下無(wú)損傷的腹部皮膚，剔除皮下脂肪組織，浸于生理鹽水中洗凈。將大鼠皮膚角質(zhì)層朝上固定于透皮擴(kuò)散池(有效擴(kuò)散面積3.14 cm2)，接收池內(nèi)加入8.3 mL PBS(pH 7.4)作為接收液，供給室內(nèi)加入1 mL各組FD-GLFL脂質(zhì)體樣品(FD濃度為25 μg·mL-1)，于37 ℃，以400 r·min-1的速度磁力攪拌，避光作用12 h。結(jié)束后，取下皮膚，溫水清洗、除凈表面殘留制劑，剪下有效給藥部位并剪碎，用甲醇/水(體積比1∶1)提取皮內(nèi)藥物12 h，4 500 r·min-1離心10 min，取上清液過(guò)0.45 μm濾膜，以熒光分光光度法(激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)520 nm)測(cè)定皮內(nèi)藥物濃度[F=0.73C+50.16，r2=0.999 4，標(biāo)準(zhǔn)曲線以甲醇/水(體積比1∶1)配制]，計(jì)算12 h的皮內(nèi)滯留量。

2.1.3 熒光顯微鏡法觀察皮內(nèi)藥物分布 將大鼠皮膚固定于透皮擴(kuò)散池,于供給室內(nèi)分別加入1 mL的FD-GLFL,FD-GLFL-CL和C/S(1∶6)(FD濃度均為25 μg·mL-1),按2.1.2項(xiàng)下方法進(jìn)行體外經(jīng)皮遞送實(shí)驗(yàn)。給藥12 h后,從皮膚表面吸除多余的制劑,并用溫水洗凈皮膚,將有效給藥部位的皮膚剪下,固定于冷凍包埋劑中,制備冷凍切片,在熒光顯微鏡下觀察皮膚內(nèi)藥物分布。

2.2 GLFL-CS的制備

根據(jù)體外遞送實(shí)驗(yàn)優(yōu)選處方，采用薄膜分散法制備GLFL-CS。精密稱取大豆磷脂120 mg,膽固醇15 mg和神經(jīng)酰胺3 20 mg,用適量乙醇超聲溶解,并轉(zhuǎn)移至250 mL茄形瓶中,40 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑至瓶壁上形成一層薄膜,放入真空干燥箱過(guò)夜除去痕量溶劑,加入5 mL GLFL(含0.5%吐溫80)水合1 h,于冰浴條件下探頭超聲4次(功率60 W,工作2 s,暫停2 s),即得GLFL-CS,置于4 ℃保存。以PBS緩沖液代替GLFL,處方中其他輔料的用量不變,同上法制備空白CS。

2.3 GLFL-CS的理化性質(zhì)考察

2.3.1 GLFL-CS的形態(tài)觀察與粒徑測(cè)定 吸取GLFL-CS加水適當(dāng)稀釋后,均勻黏附于硅片上,置于樣品池中,表面減壓噴金處理,于掃描電子顯微鏡(SEM)下觀察其形態(tài)。吸取GLFL-CS 100 μL,加水稀釋到1 mL,混合均勻,采用激光散射粒徑測(cè)定儀測(cè)定其粒徑和粒徑分布(PDI)。

2.3.2 GLFL-CS的包封率測(cè)定 采用離心沉淀-離心超濾法測(cè)定GLFL-CS的蛋白多肽類成分的包封率。吸取GLFL-CS和空白CS適量,4 ℃,20 000 r·min-1離心30 min,取上清液加入超濾管中(截留分子量為100 kDa),配平,4 ℃,14 000 r·min-1離心10 min,分離得到游離的蛋白多肽。BCA法測(cè)定GLFL-CS中游離的多肽濃度Cf,空白CS的游離濃度Ck以及GLFL中總多肽濃度Ct,計(jì)算包封率,包封率=1-(Cf-Ck)/Ct×100%。

2.3.3 GLFL-CS的穩(wěn)定性考察 制備GLFL-CS,置4 ℃冰箱儲(chǔ)存,分別于0、3、7、10、14 d測(cè)定脂質(zhì)體粒徑與包封率的變化。

2.4 ATR-FTIR法研究GLFL-CS的經(jīng)皮遞送機(jī)制

將大鼠皮膚固定于透皮擴(kuò)散池,于供給室內(nèi)分別加入1 mL的GLFL、GLFL-CL和GLFL-CS,按“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行體外經(jīng)皮遞送實(shí)驗(yàn)。給藥12 h后取下皮膚,表面用純水洗滌干凈,并用濾紙吸干水分,采用衰減全反射傅里葉變換紅外光譜(ATR-FTIR)對(duì)皮膚樣品進(jìn)行掃描。ATR-FTIR實(shí)驗(yàn)條件:掃描次數(shù)為64次,分辨率為1 cm-1,掃描范圍為400～4 000 cm-1。

3 結(jié)果

3.1 FD-GLFL-CS的體外經(jīng)皮遞送效果

3.1.1 神經(jīng)酰胺對(duì)脂質(zhì)體經(jīng)皮遞送效果的影響 以FD-GLFL和FD-GLFL-CL作為對(duì)照,研究神經(jīng)酰胺加入量對(duì)脂質(zhì)體體外經(jīng)皮遞送效果的影響。如圖1所示,12 h后皮膚中藥物滯留量順序?yàn)? C/S(1∶6)>C/S(1∶12)>C/S(1∶3)>FD-GLFL-CL>FD-GLFL,FD-GLFL-CS[即C/S(1∶3)、C/S(1∶6)、C/S(1∶12)]組的皮內(nèi)滯留量均大于FD-GLFL組和FD-GLFL-CL組,且以C/S(1∶6)的皮內(nèi)滯留量最高,分別為FD-GLFL及FD-GLFL-CL的2.87倍和1.78倍。

注：與FD-GLFL比較,圖1 神經(jīng)酰胺對(duì)脂質(zhì)體體外經(jīng)皮遞送效果的影響Fig. 1 Effect of ceramide on transdermal delivery of liposomes in vitro

3.1.2 熒光顯微鏡法觀察皮內(nèi)藥物分布 不同F(xiàn)D-GLFL脂質(zhì)體給藥后的皮膚熒光顯微鏡圖結(jié)果見(jiàn)圖2,可見(jiàn)給藥12 h后,皮內(nèi)FD總熒光從弱到強(qiáng)依次為:FD-GLFL、FD-GLFL-CL、FD-GLFL-CS[C/S(1∶6)],與上述皮內(nèi)滯留量的定量結(jié)果一致。從皮內(nèi)分布可知,FD-GLFL和FD-GLFL-CL處理后的皮膚FD熒光主要分布在最外層的角質(zhì)層,少量分布在毛囊中,FD-GLFL-CL在皮膚深層也有少量分布;FD-GLFL-CS[C/S(1∶6)]處理后的皮膚FD熒光在角質(zhì)層和深層都有大量分布。由此可見(jiàn),CS可能與皮膚具有較強(qiáng)的親和力,降低了皮膚的屏障作用,促進(jìn)更多的藥物向皮膚深層滲透[9-10]。

圖2 FD-GLFL及其脂質(zhì)體給藥后的皮膚熒光顯微鏡圖Fig. 2 Fluorescence microscopy of skin after the administration of FD-GLFL and its lipidosomes

3.2 GLFL-CS的理化性質(zhì)

3.2.1 GLFL-CS的外觀形態(tài)、粒徑與包封率 采用掃描電鏡(SEM)觀察GLFL-CS形態(tài)結(jié)構(gòu),結(jié)果如圖3所示,GLFL-CS呈類球形,平均粒徑為(259.3±16.7)nm,PDI為(0.29±0.03)。前期研究顯示GLFL中蛋白多肽為主要成分,因此測(cè)定蛋白多肽類成分的包封率,為GLFL-CS的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù),測(cè)得包封率為(43.03±0.90)%。

圖3 GLFL-CS的掃描電鏡圖(×60 000)Fig. 3 Scanning electron microscope pictures of GLFL-CS (×60 000)

3.2.2 GLFL-CS的穩(wěn)定性 通過(guò)考察GLFL-CS在4 ℃下貯存14 d過(guò)程中,粒徑和包封率的變化來(lái)評(píng)價(jià)脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。粒徑和包封率的變化測(cè)定結(jié)果如圖4所示,在14 d內(nèi),粒徑及包封率幾乎均未發(fā)生明顯變化,表明GLFL-CS在4 ℃下貯存穩(wěn)定性較好。

圖4 GLFL-CS 14 d內(nèi)粒徑與包封率變化Fig. 4 Changes of particle size and encapsulation ratio of GLFL-CS during 14 d

3.2.3 GLFL-CS的經(jīng)皮遞送機(jī)制 應(yīng)用ATR-FTIR技術(shù)檢測(cè)GLFL-CS作用于大鼠皮膚后角質(zhì)層脂質(zhì)和角蛋白的主要特征峰位移及峰面積的變化[11],以判斷角質(zhì)層結(jié)構(gòu)的變化,闡明CS促進(jìn)GLFL中水溶性大分子成分經(jīng)皮滲透的機(jī)制。皮膚ATR-FTIR圖譜如圖5所示。

GLFL、GLFL-CL和GLFL-CS作用于皮膚后,角質(zhì)層OH振動(dòng)峰分別為3 279.43、3 283.21、3 288.10 cm-1,與GLFL相比,GLFL-CL和GLFL-CS的OH振動(dòng)峰均向高峰位移動(dòng),且峰面積增大,說(shuō)明脂質(zhì)體可使角質(zhì)層水合作用加強(qiáng),且作用強(qiáng)度排序?yàn)镚LFL-CS>GLFL-CL>GLFL。

角質(zhì)層細(xì)胞間脂質(zhì)通路是藥物進(jìn)入皮膚的重要途徑,脂質(zhì)特征峰(CH2非對(duì)稱振動(dòng)峰和對(duì)稱振動(dòng)峰)的變化與其組成結(jié)構(gòu)直接相關(guān)。GLFL、GLFL-CL和GLFL-CS作用后,CH2非對(duì)稱振動(dòng)峰和對(duì)稱振動(dòng)峰分別為2 916.58 cm-1和2 849.64 cm-1,2 924.82 cm-1和2 852.73 cm-1,2 924.56 cm-1和2 851.19 cm-1,與GLFL相比,GLFL-CL和GLFL-CS的脂質(zhì)特征峰皆向高峰位移動(dòng),且峰面積皆減小,表明脂質(zhì)體使得角質(zhì)層脂質(zhì)的組成結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大的改變,更利于藥物的經(jīng)皮滲透。

此外,我們還發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體的干預(yù)使皮膚角蛋白的結(jié)構(gòu)或構(gòu)象也發(fā)生了變化,GLFL、GLFL-CL和GLFL-CS作用后,NH—C=O的振動(dòng)Ⅰ峰和振動(dòng)Ⅱ峰分別為1 641.61 cm-1和1 542.40 cm-1,1 633.03 cm-1和1 549.95 cm-1,1 630.03 cm-1和1 552.27 cm-1,與GLFL相比,GLFL-CL和GLFL-CS的振動(dòng)Ⅰ峰均向低峰位移動(dòng)以及振動(dòng)Ⅱ峰向高峰位移動(dòng),且峰面積均略有增大,2組峰作用強(qiáng)度順序均為GLFL-CS>GLFL-CL>GLFL。

CS可能是通過(guò)增強(qiáng)皮膚角質(zhì)層水合作用及改變角質(zhì)層脂質(zhì)和角蛋白的結(jié)構(gòu)或構(gòu)象,增加角質(zhì)層脂質(zhì)雙分子層的流動(dòng)性,降低皮膚屏障作用,從而促進(jìn)了藥物的經(jīng)皮滲透。

注：A.GLFL;B.GLFL-CL;C.GLFL-CS圖5 CS對(duì)大鼠皮膚角質(zhì)層ATR-FTIR圖譜的影響Fig. 5 Effects of CS on ATR-FTIR spectra on rat skin cuticle

4 討論

本文針對(duì)中藥水溶性大分子成分難以有效遞送入皮膚這一問(wèn)題,將GLFL載入CS中,并對(duì)該載體的體外經(jīng)皮遞送效果及機(jī)制進(jìn)行研究,以期為GLFL皮膚外用制劑與化妝品的開(kāi)發(fā)提供研究基礎(chǔ)。研究結(jié)果表明,與GLFL溶液和GLFL-CL相比,GLFL-CS可以顯著提高水溶性大分子物質(zhì)的皮內(nèi)滯留量和透皮深度,有望成為新型經(jīng)皮局部給藥載體。

藥物自身的理化性質(zhì)影響脂質(zhì)體的包封率,采用常用的脂質(zhì)體制備方法(薄膜分散法、逆相蒸發(fā)法、乙醇注入法)制備載親水性大分子成分的脂質(zhì)體,包封率一般較低[12]。本文采用薄膜分散法制備了GLFL-CS,主成分蛋白多肽的包封率為(43.03±0.90)%。后續(xù)研究表明,CS可以促進(jìn)游離水溶性大分子物質(zhì)的經(jīng)皮滲透,包封率可能不是增強(qiáng)藥物皮膚滲透性的重要因素。這可能在一定程度上避免了親水性大分子物質(zhì)脂質(zhì)體包封率普遍偏低以及制備工藝復(fù)雜等問(wèn)題,CS有望推動(dòng)水溶性成分在外用制劑及化妝品等領(lǐng)域的有效應(yīng)用。