楊彬彬,崔寧,王世軍

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)健康學(xué)院,山東 濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,山東 濟(jì)南 250355)

黃芪入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,為蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根,列為上品,在我國已有兩千多年的藥用歷史。黃芪味甘、性溫，入肺、脾經(jīng),具補(bǔ)氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌等功效,適用于肺脾氣虛,輸布失常,脾失運(yùn)化,水濕內(nèi)停之水腫[1-3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,黃芪含有黃芪多糖、黃芪皂苷、黃芪黃酮等有效活性成分。其中,黃芪多糖的功效主要為增強(qiáng)免疫功能、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等[4-6]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)表明,脾虛濕困模型大鼠出現(xiàn)胃腸功能紊亂及小腸黏膜損傷等癥狀,黃芪多糖可通過調(diào)節(jié)血清胃泌素、淀粉酶、膽囊收縮素(CCK)、血管活性腸肽(VIP)及尿D木糖排泄率等改善胃腸功能,修復(fù)小腸黏膜損傷,但其分子機(jī)制尚不清楚[7-8]。因此,本實(shí)驗(yàn)通過建立脾虛濕困大鼠模型,進(jìn)一步觀察黃芪多糖通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)脾虛濕困大鼠的治療作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Wistar大鼠60只,體質(zhì)量(150±10)g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,SPF級(jí)環(huán)境喂養(yǎng),溫度23～25 ℃,相對(duì)濕度40%～50%,光照時(shí)間7:00—19:00。按照國家部屬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)制訂的標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)并經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào):SDUTCM20201029001)。

1.2 藥物

黃芪多糖(純度：90%，Solarbio公司,貨號(hào):IA0570),4 ℃保存?zhèn)溆?。參苓白術(shù)散(山西華康藥業(yè)股份有限公司,批號(hào):20181204,6 g×8袋)。

1.3 主要試劑、儀器及飼料

大鼠D-乳酸(D-LA)、二胺氧化酶(DAO) ELISA試劑盒(江蘇晶美生物科技有限公司,貨號(hào):200107KE6、200107KE7);Wnt1、C-MYC、CyclinD1、β-catenin抗體(Abcam公司,貨號(hào):ab15251、ab32072、ab40754、ab32572);β-actin抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):TA-09);辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):ZB-2301);qPCR試劑盒、RNA提取試劑盒(TaKaRa公司,貨號(hào):DRR420B、D9109);PVDF膜、ECL發(fā)光試劑盒(Millipore公司,貨號(hào):IPVH00010、WBKLS0500)。AIN-76A純化飼料、高脂低蛋白飼料購自小黍有泰(北京)生物科技有限公司。

TG16W型微量高速離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司);GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);AC8型洗板機(jī)(Thermo Labsystems公司);352型酶標(biāo)儀(Labsystems Multiskan MS公司)。

1.4 方法

1.4.1 造模 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d,按照隨機(jī)數(shù)字表法,分為對(duì)照組、模型組、黃芪多糖高劑量組、黃芪多糖中劑量組、黃芪多糖低劑量組、參苓白術(shù)散(陽性藥)組,每組10只。除對(duì)照組(不作任何處理,正常飼養(yǎng))外,其余各組大鼠按照前期課題組模型制備方法造模,具體造模方法為:大鼠每日飼以高脂低蛋白飼料加力竭游泳,連續(xù)8周,建立脾虛濕困大鼠模型[7-8],并根據(jù)一般狀況評(píng)分判定造模是否成功,見表1。對(duì)照組大鼠飼以AIN-76A純化飼料。各組大鼠均自由進(jìn)食、飲水。

表1 脾虛濕困一般狀況評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Scoring standard of general condition of dampness stagnancy due to spleen deficiency

1.4.2 給藥 造模成功后,于造模結(jié)束后次日黃芪多糖高劑量組按照900 mg·kg-1·d-1、黃芪多糖中劑量組按照600 mg·kg-1·d-1、黃芪多糖低劑量組按照300 mg·kg-1·d-1灌胃[9-10];參苓白術(shù)散根據(jù)人和大鼠等效劑量系數(shù)折算大鼠等效劑量為成人日服劑量的6倍,按照2.5 g·kg-1·d-1灌胃[6],每日1次;每100 g體質(zhì)量給予1 mL,連續(xù)2周,對(duì)照組和模型組給予同體積生理鹽水灌胃。觀察大鼠一般狀況并記錄大鼠體質(zhì)量變化情況。

1.4.3 標(biāo)本采集 各組動(dòng)物麻醉后,腹主動(dòng)脈采血,室溫靜置2 h后低溫離心(4 ℃,3 000 r·min-1,10 min,離心半徑10 cm),取血清放置于-20 ℃低溫冰箱中,備用。取空腸組織于-80 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 血清D-LA、DAO水平檢測(cè) 按照試劑盒說明,采用ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清D-LA、DAO水平。

1.4.5 小腸推進(jìn)率檢測(cè) 脫頸處死大鼠，迅速打開腹腔，摘出小腸，將小腸用生理鹽水潤濕后置于平板上,不加牽引力使其平鋪,分別量取幽門括約肌至色素最前端及幽門括約肌至盲腸距離,以二者之百分比為小腸推進(jìn)率。小腸推進(jìn)率=小腸內(nèi)色素推進(jìn)距離/全小腸長(zhǎng)度×100%。

1.4.6 Western blot法檢測(cè)小腸Wnt1、β-catenin、CyclinD1、C-MYC蛋白表達(dá) 取剪切成小塊的小腸組織,勻漿,充分裂解,12 000 r·min-1離心10 min,取上清。BCA法蛋白定量。將提取的蛋白上清加入5×蛋白質(zhì)凝膠電泳上樣緩沖液,混合,95 ℃變性10 min,80 V電壓電泳。60 V電壓轉(zhuǎn)膜,加入含5%脫脂奶粉的TBST封閉液,室溫?fù)u床封閉1 h;將一抗用封閉液稀釋;將封閉后的膜直接放入一抗工作液中,4 ℃反應(yīng)過夜;TBST充分洗滌3次,每次10 min;加入二抗工作液(1∶3 000)中,室溫、避光孵育60 min;TBST充分洗滌3次,每次10 min;采用ECL法進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)顯影,洗片;Image J軟件分析灰度值。

1.4.7 qPCR法檢測(cè)小腸Wnt1、β-catenin、CyclinD1、C-MYC的mRNA表達(dá)水平 取小腸組織,根據(jù)RNA試劑盒說明書提取總RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟合成cDNA,合成后測(cè)定cDNA濃度,備用。qPCR法檢測(cè)小腸Wnt1、β-catenin、CyclinD1、C-MYC的mRNA表達(dá)量,相對(duì)定量法計(jì)算各指標(biāo)mRNA的2-ΔΔCt值。引物序列見表2。

表2 qPCR引物序列Table 2 qPCR primer sequence

2 結(jié)果

2.1 一般狀況評(píng)分及體質(zhì)量變化

對(duì)照組大鼠一般狀況穩(wěn)定,進(jìn)食及飲水量正常,體質(zhì)量穩(wěn)定上升。模型組大鼠自第2周開始出現(xiàn)體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢,并逐漸出現(xiàn)食欲不振,神倦懶動(dòng)、瞇眼、被毛無光等狀況,一般狀況評(píng)分顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。黃芪多糖高劑量組及參苓白術(shù)散組一般狀況評(píng)分顯著低于模型組(P<0.01);黃芪多糖高、中劑量組及參苓白術(shù)散組第10周體質(zhì)量顯著高于模型組(P<0.05)。見圖1～2。

2.2 黃芪多糖對(duì)脾虛濕困大鼠小腸推進(jìn)率的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠小腸推進(jìn)率顯著降低(P<0.01);與模型組比較，黃芪多糖高、低劑量組和參苓白術(shù)散組小腸推進(jìn)率明顯升高(P<0.05，P<0.01)。見圖3。

注:與對(duì)照組比較,##P<0.01;與模型組比較,圖1 黃芪多糖對(duì)脾虛濕困大鼠一般狀況評(píng)分的影響Fig. 1 Effect of APS on general condition scores of rats with dampness stagnancy due to spleen deficiency

注:與對(duì)照組比較,##P<0.01;與模型組比較,圖2 黃芪多糖對(duì)脾虛濕困大鼠體質(zhì)量的影響Fig. 2 Effects of APS on body weight of rats with dampness stagnancy due to spleen deficiency

注:與對(duì)照組比較,##P<0.01;與模型組比較,圖3 黃芪多糖對(duì)脾虛濕困大鼠小腸推進(jìn)率的影響Fig. 3 Effects of APS on the propulsion rate of the small intes-tine in rats with dampness stagnancy due to spleen deficiency

2.3 黃芪多糖對(duì)脾虛濕困大鼠血清D-LA、DAO水平的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清D-LA、DAO水平顯著升高(P<0.01);與模型組比較，黃芪多糖高、中、低劑量組，參苓白術(shù)散組D-LA、DAO水平顯著降低(P<0.05，P<0.01)。見圖4。

注:與對(duì)照組比較,##P<0.01;與模型組比較,圖4 黃芪多糖對(duì)脾虛濕困大鼠血清D-LA、DAO水平的影響Fig. 4 Effects of APS on serum D-LA, DAO levels in rats with dampness stagnancy due to spleen deficiency

2.4 黃芪多糖對(duì)脾虛濕困大鼠Wnt1、β-catenin、CyclinD1、C-MYC蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組Wnt1、β-catenin、CyclinD1、C-MYC蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,黃芪多糖高、中、低劑量組及參苓白術(shù)散組Wnt1、β-catenin、C-MYC蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.01),黃芪多糖高、中劑量組CyclinD1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05，P<0.01)。見圖5。

2.5 黃芪多糖對(duì)脾虛濕困大鼠Wnt1、β-catenin、CyclinD1、C-MYC mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組Wnt1、β-catenin、CyclinD1、C-MYC mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，黃芪多糖高、中劑量組及參苓白術(shù)散組Wnt1、β-catenin、CyclinD1、C-MYC mRNA表達(dá)均顯著降低(P<0.01)。見圖6。

注:與對(duì)照組比較,##P<0.01;與模型組比較,圖5 各組大鼠Wnt1、β-catenin、CyclinD1、C-MYC蛋白表達(dá)的比較Fig. 5 Comparison of protein expressions of Wnt1, β-catenin, CyclinD1 and C-MYC of rats in each group

注:與對(duì)照組比較,##P<0.01;與模型組比較,圖6 各組大鼠Wnt1、β-catenin、CyclinD1、C-MYC mRNA表達(dá)的比較Fig. 6 Comparison of mRNA expressions of Wnt1, β-catenin, CyclinD1 and C-MYC of rats in each group

3 討論

在中醫(yī)理論中,脾主運(yùn)化的功能包括“化”和“運(yùn)”兩個(gè)方面?！盎敝傅氖瞧阉鹊染⒅镛D(zhuǎn)化成水液,再把水液轉(zhuǎn)化為汗、尿等;“運(yùn)”指的是脾把津液輸布全身。脾虛運(yùn)化不及,不僅可引起營養(yǎng)物質(zhì)的吸收輸布受阻,導(dǎo)致臟腑組織失養(yǎng),也可引起水液的生成轉(zhuǎn)輸障礙,導(dǎo)致水濕內(nèi)停。脾虛時(shí)常表現(xiàn)為食欲不振、脘腹脹悶、大便稀薄等胃腸疾病的癥狀以及腸黏膜屏障損傷,脾胃功能的正常是腸道黏膜屏障功能正常的基礎(chǔ)[11]。

本課題組前期通過模擬飲食失節(jié)加力竭運(yùn)動(dòng)建立脾虛濕困大鼠模型,發(fā)現(xiàn)模型大鼠出現(xiàn)明顯胃腸功能和病理形態(tài)的異常,主要表現(xiàn)為：胃動(dòng)素、胃泌素等水平下降，胃腸動(dòng)力、吸收障礙；十二指腸黏膜缺損、固有層、黏膜下層血管擴(kuò)張充血、出血，黏膜下層漿細(xì)胞浸潤[9]。說明脾虛濕困狀態(tài)下,腸黏膜結(jié)構(gòu)完整性被破壞,影響腸黏膜屏障功能?？梢娪赡c黏膜損傷導(dǎo)致腸道通透性增高,引起腸道細(xì)菌和毒素移位,使得消化吸收功能下降,可能是導(dǎo)致脾虛濕困的機(jī)制之一,研究顯示益氣健脾對(duì)于修復(fù)胃腸黏膜損傷具有重要意義[11-12]。

本課題組對(duì)黃芪及其各一級(jí)拆分組分健脾祛濕機(jī)制的研究結(jié)果顯示：黃芪能改善脾虛濕困大鼠的一般狀況,調(diào)節(jié)蛋白和脂類代謝,促進(jìn)水液運(yùn)化,糾正胃腸及肝臟形態(tài)和功能的異常;黃芪多糖組分調(diào)節(jié)效果最為明顯,是黃芪健脾祛濕的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[13]。黃芪多糖通過升高模型大鼠血清胃動(dòng)素(MTL)、胃泌素(Gas)等水平,改善脾虛濕困大鼠胃腸功能，幫助胃排空[14]。而MTL作為腦腸肽激素能夠誘發(fā)小腸分節(jié)運(yùn)動(dòng)與胃收縮,還能刺激胃液與胃蛋白酶分泌,幫助食物消化。本實(shí)驗(yàn)中脾虛濕困大鼠小腸推進(jìn)率降低,提示出現(xiàn)胃腸功能下降;黃芪多糖能提高模型大鼠小腸推進(jìn)率,提示黃芪多糖具有促進(jìn)胃腸功能的作用,這可能與其升高M(jìn)TL水平有關(guān)。有研究顯示黃芪多糖可加速胃腸黏膜損傷早期修復(fù)過程[15]。

脾虛濕困大鼠十二指腸全基因表達(dá)譜分析結(jié)果顯示[16-17],黃芪多糖能顯著降低脾虛濕困大鼠Wnt1水平。Wnt1是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的始動(dòng)因子及控制細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的關(guān)鍵分泌信號(hào)分子。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是Wnt經(jīng)典途徑,已經(jīng)被證明與很多疾病的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活可通過一系列過程使胞質(zhì)內(nèi)大量游離的β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，并與細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子TCF4結(jié)合激活下游的c-myc、Cyclin D1等靶基因,從而影響細(xì)胞的增殖、凋亡過程,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生增生性、炎癥性或者腫瘤性病變[18-24]。

有研究發(fā)現(xiàn)黃芪可下調(diào)糖尿病腎病大鼠腎間質(zhì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的表達(dá),延緩大鼠腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程,發(fā)揮腎臟的保護(hù)作用[25]。關(guān)于黃芪多糖是否通過Wnt/β-catenin改善脾虛濕困大鼠胃腸功能，修復(fù)小腸黏膜上皮損傷尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)基于前期黃芪多糖對(duì)于脾虛濕困大鼠胃腸功能紊亂及小腸黏膜損傷修復(fù)研究,進(jìn)一步探討Wnt通路在這一修復(fù)過程中的作用。結(jié)果顯示,脾虛濕困大鼠血清DAO水平升高,提示出現(xiàn)腸黏膜損傷;Wnt通路蛋白Wnt1、β-catenin、CyclinD1、C-MYC蛋白表達(dá)異常升高,提示W(wǎng)nt/β-catenin通路異常激活,誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生增生性、炎性病變從而導(dǎo)致了腸黏膜上皮細(xì)胞損傷,因此推測(cè)腸黏膜損傷可能與Wnt通路異常激活有關(guān)。而黃芪多糖干預(yù)后,以上Wnt通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平降低,提示黃芪多糖能夠下調(diào)Wnt信號(hào)通路,修復(fù)腸黏膜上皮細(xì)胞損傷,降低血清DAO水平,從而改善胃腸功能,提高小腸推進(jìn)率,發(fā)揮其益氣健脾祛濕的功效。