吳彩艷，廖申權(quán)，戚南山，廖曉萍，孫阮洋，方亮星，周宇峰，李林林，孫銘飛

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510642； 2 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物衛(wèi)生研究所/嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心/廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實(shí)驗(yàn)室/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站,廣東 廣州 510640)

中國(guó)是世界上水禽養(yǎng)殖第一大國(guó)，肉鴨產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的70%左右，養(yǎng)殖量平均每年以8%～10%的速度增加。目前水禽養(yǎng)殖業(yè)已經(jīng)成為我國(guó)解決“三農(nóng)”問(wèn)題的支柱產(chǎn)業(yè)，也是現(xiàn)代畜牧業(yè)的重要組成部分。雖然水禽業(yè)發(fā)展迅速，但也存在諸多制約因素，尤其是疫病多發(fā)、頻發(fā)嚴(yán)重阻礙水禽業(yè)的健康發(fā)展。其中，由鴨疫里默氏桿菌Riemerella anatipestifer引起的鴨疫里默氏桿菌病已經(jīng)成為影響水禽業(yè)經(jīng)濟(jì)最嚴(yán)重的細(xì)菌性傳染病，發(fā)病率可達(dá)100%，死亡率高于75%，耐過(guò)的病鴨生長(zhǎng)發(fā)育受阻，成為僵鴨，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。一直以來(lái)主要采用疫苗免疫與藥物治療相結(jié)合的方式防控該病，但是防控的效果并不理想。一方面，鴨疫里默氏桿菌有21個(gè)血清型且各血清型間缺乏交叉保護(hù)性，而目前市售的滅活疫苗尚未涵蓋所有流行的血清型，當(dāng)出現(xiàn)疫苗株血清型以外的鴨疫里默氏桿菌感染時(shí)，現(xiàn)有的滅活疫苗不能起到保護(hù)作用，導(dǎo)致疫苗應(yīng)用受限；另一方面，雖然鴨疫里默氏桿菌對(duì)大多數(shù)抗生素或化學(xué)合成藥物較敏感，但是由于長(zhǎng)期連續(xù)使用或不規(guī)范使用藥物導(dǎo)致耐藥性普遍存在[2]，并且已經(jīng)成為當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)面臨的最嚴(yán)峻問(wèn)題。因此，本研究擬對(duì)廣東地區(qū)鴨疫里默氏桿菌分離株進(jìn)行血清型和耐藥性調(diào)查及遺傳進(jìn)化關(guān)系研究，為開(kāi)展針對(duì)性疫苗免疫預(yù)防及選用敏感藥物治療提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料樣本 病料于 2015—2019 年采自廣東省清遠(yuǎn)、惠州、佛山等地區(qū)鴨場(chǎng)，采集疑似患鴨疫里默氏桿菌病病死鴨的腦、肝臟、心臟等組織，病料樣本及分離鴨疫里默氏桿菌信息見(jiàn)表1，相同養(yǎng)殖場(chǎng)采集的樣本分離的鴨疫里默氏桿菌記為1株。

表1 采集樣本與分離鴨疫里默氏桿菌信息Table 1 Collected samples and isolation information of Riemerella anatipestifer

1.1.2 試劑與藥品 改良胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基，含5%(φ)新生牛血清；胰酶大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基，含5%(φ)新生牛血清；麥康凱培養(yǎng)基按細(xì)菌學(xué)常規(guī)方法配制；革蘭染色試劑和微量生化發(fā)酵管為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；DNA marker DL 2000 和 Premix Taq 為 TaKaRa 公司產(chǎn)品；藥物標(biāo)準(zhǔn)品-氧氟沙星(Ofloxacin，OFX)、諾氟沙星 (Norfloxacin，NOR)、鹽酸四環(huán)素(Tetracycline hydrochloride，TCY)、頭孢噻肟(Cefotaxime，CTX)、阿莫西林 (Amoxicillin，AMX)、土霉素 (Oxytetracycline，OXY)、鹽酸金霉素 (Chlortetracycline hydrochloride，CTE)、氨芐西林 (Ampicillin，AMP)、慶大霉素 (Gentamicin，GEN)、鹽酸環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin hydrochloride，CIP)、卡那霉素(Kanamycin，KAN)、大觀霉素 (Spectinomycin，STP)、磺胺嘧啶 (Sulfadiazine，SDI)、磺胺二甲嘧啶(Sulfadimidine，SUL)和磺胺對(duì)甲氧嘧啶(Sulfametoxydiazine，SMD)為中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 1 日齡商品代櫻桃谷肉鴨，大約4 000只，購(gòu)自廣州郊區(qū)某鴨場(chǎng)，未接種任何疫苗和抗血清，飼養(yǎng)于潔凈環(huán)境中，至7～14日齡進(jìn)行動(dòng)物回歸試驗(yàn)。

1.1.4 引物合成 引物參照文獻(xiàn) [3]合成，以 16S rRNA為擴(kuò)增基因。引物 ( RA-F：5′-ACGTCATCCCACC TTCCTC-3′，RA-R：5′-GTTCAGACTAA GCGAAAG-3′ )由Invitrogen公司合成。

1.1.5 參考菌株 血清1型鴨疫里默氏桿菌參考株由廣東省農(nóng)科院動(dòng)物衛(wèi)生研究所寄生生物學(xué)研究室保存。

1.1.6 定型血清 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 型鴨疫里默氏桿菌參考株定型血清，由廣東省農(nóng)科院動(dòng)物衛(wèi)生研究所寄生生物學(xué)研究室自制。

1.1.7 質(zhì)控菌 大腸埃希菌 ATCC25922 購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 方法

1.2.1 病原分離與鑒定 病原分離：將無(wú)菌采集的病死鴨的腦、肝臟、心臟組織，劃線接種于TSA培養(yǎng)基平板和麥康凱培養(yǎng)基平板，于37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，挑取單個(gè)可疑菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。

革蘭染色：挑取純培養(yǎng)的單菌落進(jìn)行革蘭染色、鏡檢，觀察細(xì)菌的形態(tài)和染色特性。

生化試驗(yàn)：將分離株的純培養(yǎng)物接種于微量生化發(fā)酵管中，于37 ℃溫箱中培養(yǎng)，觀察結(jié)果。

PCR鑒定：以分離株的菌液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)總體積為 20 μL：Premix Taq 10 μL、上下游引物各 1 μL、菌液 1 μL、ddH2O 7 μL；反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性 5 min，以 94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃1 min 進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 延伸 7 min；反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物以10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，目的條帶大小為 325 bp。

動(dòng)物致病性試驗(yàn)：將168株鴨疫里默氏桿菌分離株分別接種7～14日齡試驗(yàn)鴨，每株接種10只試驗(yàn)鴨，同時(shí)對(duì)照組設(shè)10只試驗(yàn)鴨，連續(xù)觀察14 d；接種組腿部肌肉注射鴨疫里默氏桿菌分離株活菌 1×108CFU/mL，每只注射 1 mL，對(duì)照組接種生理鹽水，每只注射1 mL。隔離飼養(yǎng)，觀察致病力，記錄試驗(yàn)鴨發(fā)病及死亡情況；同時(shí)根據(jù)試驗(yàn)鴨死亡和發(fā)病情況在接種后1～5 d采集3～4只試驗(yàn)鴨的心臟和肝臟，分離鴨疫里默氏桿菌，并進(jìn)行革蘭染色、生化試驗(yàn)和PCR鑒定。

血清型鑒定：取潔凈的載玻片分別滴加30 μL參考株陽(yáng)性血清，再滴加30 μL分離株菌液，充分混勻，觀察1～2 min，以出現(xiàn)清晰凝集者判為陽(yáng)性，否則判為陰性。

1.2.2 最低抑菌濃度的測(cè)定 從168株鴨疫里默氏桿菌分離株中選擇48株作為代表性菌株，進(jìn)行最低抑菌濃度 (Minimum inhibitory concentration，MIC)測(cè)定。代表性菌株選擇依據(jù)：所選菌株均來(lái)自不同的規(guī)?；唸?chǎng)，每個(gè)鴨場(chǎng)養(yǎng)殖時(shí)間均在5年以上，每批肉鴨養(yǎng)殖規(guī)模均在20 000只以上，從韶關(guān)、河源、清遠(yuǎn)、佛山、茂名、惠州、汕頭、湛江的規(guī)?；唸?chǎng)隨機(jī)各選5株，從云浮和肇慶的規(guī)?；唸?chǎng)隨機(jī)各選4株，總計(jì)48株。

抗菌藥物貯存液的制備：將藥物制成2 560 mg/L的原液，抗菌藥物貯存液按照梯度稀釋。

抗菌藥物濃度范圍：根據(jù)抗菌藥物敏感性試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)，藥物濃度范圍應(yīng)包含耐藥、中介和敏感分界點(diǎn)值，特殊情況除外。

接種物的制備：采用直接菌落懸液配制法，將培養(yǎng)18～24 h的鴨疫里默氏桿菌菌落調(diào)配成0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的懸液，再以TSB培養(yǎng)基按體積比1∶100稀釋后備用；在15 min內(nèi)接種完配制好的接種物，并取1份接種物在TSA平板上培養(yǎng)，以檢查接種物的純度。

抗菌藥物稀釋及菌液接種：以改良的試管兩倍稀釋法[4]測(cè)定鴨疫里默氏桿菌分離株的MIC，取14支滅菌試管為一排，除第1管加入1.6 mL TSB培養(yǎng)基外，其余每支試管均加入1 mL TSB培養(yǎng)基，于第1管中添加0.4 mL待測(cè)藥物原液并混勻，吸取1 mL加入第2管，混勻后再吸取1 mL至第3管，如此連續(xù)倍比稀釋至第12管，混勻后吸取1 mL棄掉，第13管為不加藥物的陽(yáng)性對(duì)照，第14管為不加藥物和菌液、只加生理鹽水的陰性對(duì)照；向第1～13管中各加入1 mL稀釋菌液，此時(shí)第1～12 管藥物終質(zhì)量濃度分別為 256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 mg/L。

培養(yǎng)：將接種后的試管置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)22～24 h。

結(jié)果判斷：在陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照成立且質(zhì)控菌株的MIC處于質(zhì)控范圍的情況下，肉眼可見(jiàn)澄清的最低藥物濃度管即為測(cè)試菌株的MIC。

藥物敏感性判定：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)[4-5]判斷藥物耐藥、敏感和中介。

1.2.3 全基因組序列特征分析與核心基因組進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建 基因組DNA文庫(kù)的構(gòu)建與序列測(cè)定：使用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，按照操作說(shuō)明，提取鴨疫里默氏桿菌分離株的基因組DNA；通過(guò)濃度測(cè)定和瓊脂糖凝膠電泳，初步質(zhì)檢合格后，構(gòu)建Illumina(250 bp)文庫(kù)，利用Illumina Novaseq 6000 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控和去除接頭后運(yùn)用SPAdes v3.6.2對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接[6]，拼接后的數(shù)據(jù)使用Quast軟件進(jìn)行質(zhì)控[7]。

序列特征分析。耐藥基因分析：將拼接好的測(cè)序結(jié)果上傳至CGE的ResFinder4.1數(shù)據(jù)庫(kù)[8]以分析菌株所攜帶的耐藥基因(ARGs)(https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/)；ST分型：將拼接好的測(cè)序結(jié)果上傳至多位點(diǎn)序列分型(Multi-locus sequence typing,MLST)數(shù)據(jù)庫(kù)以分析菌株所屬的ST型(https://cge.cbs.dtu.dk/services/MLST/)。

構(gòu)建核心基因組進(jìn)化樹(shù)：從NCBI Genome下載數(shù)據(jù)庫(kù)中全部共計(jì)59株鴨疫里默氏桿菌的全基因組序列，以標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 11845(NCBI登錄號(hào)：GCA_000252855.1)作為參考菌株，利用Parsnp軟件比對(duì)全基因組序列并構(gòu)建核心基因組進(jìn)化樹(shù)[9]，使用hierBAPS軟件進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分簇[10]，再利用FigTree v1.4.2和iTOL v4軟件進(jìn)行美化注釋[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨疫里默氏桿菌分離與鑒定

分離株在TSA平板上長(zhǎng)成光滑、濕潤(rùn)、半透明的奶油狀菌落，在麥康凱平板上不生長(zhǎng)；革蘭染色呈陰性的單個(gè)或成雙排列的短小桿菌；生化試驗(yàn)顯示分離株均不發(fā)酵蔗糖、乳糖、木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇，不產(chǎn)生硫化氫，不利用檸檬酸鹽，甲基紅試驗(yàn)、靛基質(zhì)試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)陰性，氧化酶、過(guò)氧化物酶試驗(yàn)陽(yáng)性；通過(guò)特異性PCR擴(kuò)增，分離株均可擴(kuò)增到約300 bp的條帶，與目的條帶大小一致(圖1)。

圖1 鴨疫里默氏桿菌分離株P(guān)CR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR identification results of Riemerella anatipestifer isolates

2.2 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

所有鴨疫里默氏桿菌分離株對(duì)試驗(yàn)鴨均有不同程度的致病力，發(fā)病率達(dá)100%，致死率介于70%～100%，其中70.24%(118/168)的分離株的毒力較強(qiáng)，在接種后48 h內(nèi)試驗(yàn)鴨全部死亡，剖檢未見(jiàn)典型的鴨疫里默氏桿菌病病理變化，其余分離株接種試驗(yàn)鴨后病程較長(zhǎng)，剖檢可見(jiàn)典型的鴨疫里默氏桿菌病病理變化。所有試驗(yàn)鴨接種分離株后均表現(xiàn)鴨疫里默氏桿菌病臨床癥狀，主要表現(xiàn)精神沉郁，采食、飲水減少或廢絕，排綠色或黃綠色糞便，共濟(jì)失調(diào)，頭頸震顫，角弓反張及轉(zhuǎn)圈運(yùn)動(dòng)等，嚴(yán)重者導(dǎo)致死亡。從接種鴨疫里默氏桿菌分離株試驗(yàn)鴨的肝臟或心臟中均可分離到接種菌，革蘭染色均為陰性的短小桿菌，生化試驗(yàn)結(jié)果符合鴨疫里默氏桿菌特性，PCR鑒定結(jié)果與分離株初次分離鑒定結(jié)果一致。因此，根據(jù)細(xì)菌分離鑒定結(jié)果和動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果確定從廣東地區(qū)的鴨場(chǎng)共分離到168株鴨疫里默氏桿菌菌株。

2.3 血清型鑒定

鴨疫里默氏桿菌分離株血清型鑒定結(jié)果見(jiàn)表2，血清 1、2、3、5、6、7、8、10 型和未定型均有流行，其中高達(dá)54.17%(91/168)的分離株為1型，其次為2型，占27.97%(47/168)。因此，廣東地區(qū)鴨疫里默氏桿菌分離株以1型為優(yōu)勢(shì)血清型。

表2 各地區(qū)各血清型鴨疫里默氏桿菌分離株數(shù)量Table 2 Isolate number of each serotype for Riemerella anatipestifer isolates from different districts

2.4 藥物敏感性試驗(yàn)

藥物對(duì)鴨疫里默氏桿菌代表性菌株的MIC測(cè)定結(jié)果及敏感性統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。根據(jù)MIC分析各藥物抑制50%和90%鴨疫里默氏桿菌菌株生長(zhǎng)的MIC，即 MIC50和 MIC90，MIC50介于 0.25～＞256 mg/L，其中，頭孢噻肟最低，僅 0.25 mg/L，阿莫西林為 1 mg/L，氨芐西林、土霉素、鹽酸四環(huán)素、鹽酸金霉素、氧氟沙星均為 8 mg/L，鹽酸環(huán)丙沙星為 16 mg/L，諾氟沙星、大觀霉素、慶大霉素分別為 32、64、128 mg/L，磺胺嘧啶為256 mg/L，卡那霉素、磺胺二甲嘧啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶均為＞256 mg/L；MIC90值介于 8～＞256 mg/L，其中，頭孢噻肟最低，僅8 mg/L；土霉素和鹽酸金霉素為16 mg/L；鹽酸四環(huán)素、氧氟沙星、鹽酸環(huán)丙沙星均為 32 mg/L；諾氟沙星為 64 mg/L；阿莫西林、氨芐西林、大觀霉素均為128 mg/L；卡那霉素、慶大霉素、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶較高，均為＞256 mg/L。

表3 48株鴨疫里默氏桿菌代表性分離株最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定結(jié)果1)Table 3 The minimum inhibitory concentration (MIC) of 48 representative isolates of Riemerella anatipestifer

分析鴨疫里默氏桿菌代表性菌株對(duì)受試藥物的敏感性，對(duì)慶大霉素的耐藥率高達(dá)91.67%(44/48)；對(duì)卡那霉素和鹽酸環(huán)丙沙星的耐藥率分別為89.58%(43/48)和81.25%(39/48)；對(duì)土霉素、鹽酸四環(huán)素、鹽酸金霉素、氧氟沙星、諾氟沙星、磺胺二甲嘧啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶的耐藥率介于60%～80%；對(duì)磺胺嘧啶和氨芐西林的耐藥率介于30%～60%；對(duì)阿莫西林、頭孢噻肟和大觀霉素的耐藥水平較低(30%以下)。

根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，分析鴨疫里默氏桿菌代表性菌株的多重耐藥性，結(jié)果如圖2所示。48株鴨疫里默氏桿菌對(duì)5～12種藥物耐藥，其中9耐和10耐的菌株總數(shù)最多，占54.17%(26/48)，6耐和11耐、7耐與8耐的菌株數(shù)相同，分別為4株和5株，而5耐和12耐菌株數(shù)最少，各有2株。

圖2 48株鴨疫里默氏桿菌代表性分離株多重耐藥性分布Fig.2 Results of multi-drug resistance of 48 Riemerellaanatipestifer representative isolates

統(tǒng)計(jì)并分析鴨疫里默氏桿菌分離株的耐藥譜，48株鴨疫里默氏桿菌具有44種耐藥譜型，其中40株為單一譜型，構(gòu)成比為2.08%(1/48)，其余4種耐藥譜型分別為2株所共有，構(gòu)成比為4.16%(2/48) (表4)。

表4 48株鴨疫里默氏桿菌代表性分離株耐藥譜統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 4 Drug resistance spectrum of 48 representative isolates of Riemerella anatipestifer

2.5 全基因組測(cè)序分析

由北京諾禾致源科技股份有限公司對(duì)48株鴨疫里默氏桿菌代表性菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序，經(jīng)過(guò)Quast軟件質(zhì)檢后，其中2株拼接質(zhì)量不高，故僅有46株進(jìn)行后續(xù)分析。共檢出6種耐藥基因，其中攜帶四環(huán)素類(lèi)耐藥基因tet(X)的菌株最多，陽(yáng)性率高達(dá)82.60%(38/46)；大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥基因erm(F)陽(yáng)性率為73.91%(34/46)，而大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)另一耐藥基因ere(D)的陽(yáng)性率僅有19.57%(9/46)；β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因blaOXA-209的陽(yáng)性率為 54.35%(25/46)；氨基糖苷類(lèi)耐藥基因aadS和氟苯尼考耐藥基因floR的陽(yáng)性率相對(duì)較低，分別為34.78%(16/46)和30.43%(14/46)。耐藥基因結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 46株鴨疫里默氏桿菌代表性分離株耐藥基因攜帶情況Table 5 The resistance genes carried by 46 Riemerellaanatipestifer representative isolates

基于獲得的46株鴨疫里默氏桿菌全基因組序列，進(jìn)一步分析其MLST，其中18株ST分型成功，分別為 ST38(4 株)、ST13(2 株)、ST24(2 株)、ST35(2株)、ST44(2株)，其他ST型分別為ST2、ST16、ST21、ST34、ST42 和 ST43，均只有 1 株，其余28株為未知ST型；說(shuō)明本研究測(cè)序菌株的ST型呈多樣性，未出現(xiàn)優(yōu)勢(shì)ST型。

將本研究46株鴨疫里默氏桿菌菌株的全基因組測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中59株鴨疫里默氏桿菌菌株的全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建核心基因組進(jìn)化樹(shù)(圖3)，數(shù)據(jù)庫(kù)59株鴨疫里默氏桿菌菌株中，39株來(lái)源于中國(guó)，9株來(lái)源于英國(guó)，2株來(lái)源于印度，德國(guó)、俄羅斯和美國(guó)各有1株，另有6株未標(biāo)注來(lái)源?？傆?jì)105株鴨疫里默氏桿菌菌株分布在6個(gè)分簇群系中，本研究所有測(cè)序菌株與數(shù)據(jù)庫(kù)中來(lái)自中國(guó)的菌株相似度較高，且集中分布在3個(gè)簇群中，其中Clade 1群系最大，包含67株，我國(guó)菌株占50.75%(34/67)，其次為 Clade 3 群系，包含 17 株，我國(guó)菌株占 47.06%(8/17)，Clade 2 群系包含 5 株鴨疫里默氏桿菌，我國(guó)菌株數(shù)占60.00%(3/5)。數(shù)據(jù)庫(kù)中大部分鴨疫里默氏桿菌菌株來(lái)自于中國(guó)，而歐洲來(lái)源的菌株占比較低，并且觀察到來(lái)自世界各地的鴨疫里默氏桿菌菌株間存在地理分布差異。另外，數(shù)據(jù)庫(kù)中我國(guó)菌株從1990年到2017年間均有收集，持續(xù)時(shí)間接近30年，時(shí)間跨度較大，但仍能與本研究測(cè)序菌株在進(jìn)化樹(shù)中聚集在一起，說(shuō)明在我國(guó)鴨疫里默氏桿菌存在區(qū)域內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)傳播的特點(diǎn)。

圖3 105株鴨疫里默氏桿菌菌株核心基因組系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of core genomes for 105 isolates of Riemerella anatipestifer

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

鴨疫里默氏桿菌病血清型復(fù)雜，在世界范圍內(nèi)流行，目前在國(guó)內(nèi)多個(gè)地區(qū)均有鴨疫里默氏桿菌血清型流行情況的報(bào)道，廣西百色分離株血清型比較單一，全部為1型[12]；山東分離株至少存在1、2、6、10和11型5種血清型，其中以1型和2型為優(yōu)勢(shì)血清型[13-14]；超過(guò)半數(shù)的江蘇分離株為1型[15]；安徽分離株則多達(dá)7種血清型，但以1型和2型發(fā)生最廣泛[16]；河南分離株以1型和2型多發(fā)，此外還流行 10 型和未定型[17]；血清 1、2、3、4、8、10、15 型在廣東地區(qū)均有流行，以1型最多發(fā)[18-20]。與國(guó)內(nèi)情況類(lèi)似，國(guó)外也流行多種血清型，美國(guó)以1型為主，此外還流行 1、2、5、11、13、15、19、21 型[21]；1型和2型為英國(guó)多發(fā)血清型，同時(shí)5、9、13和15 型也有流行[22]；泰國(guó)主要流行 1、5、6、7、10 和21型[23]；新加坡以1、5和10型這3種血清型為主[24]；1型和3型為丹麥的優(yōu)勢(shì)血清型[25]；韓國(guó)只有1、4和7型這3種血清型[26]；澳大利亞則流行1、6、8、9、13和14型[27]。本研究高達(dá)54.17%的分離株為血清1型，也是優(yōu)勢(shì)血清型。分析國(guó)內(nèi)外鴨疫里默氏桿菌血清型流行情況發(fā)現(xiàn)多血清型流行已呈基本態(tài)勢(shì)，其中1型為最普遍發(fā)生的血清型，也是重點(diǎn)防控的血清型。

在養(yǎng)殖過(guò)程中，由于長(zhǎng)期應(yīng)用抗菌藥物治療鴨疫里默氏桿菌病，導(dǎo)致廣泛而嚴(yán)重的耐藥性。調(diào)查顯示山東分離株對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物高度耐藥，并且具有多重耐藥性[28]；安徽分離株對(duì)恩諾沙星、新霉素、安普霉素表現(xiàn)不同程度的耐藥性[29]；貴州分離株則對(duì)氨基糖苷類(lèi)和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)等藥物表現(xiàn)高度耐藥，多重耐藥高達(dá)17耐[30]；同樣，廣東地區(qū)分離株耐藥狀況也比較嚴(yán)峻，朱元軍等[31]報(bào)道分離株對(duì)丁胺卡那、卡那霉素、慶大霉素和鏈霉素高度耐藥，多數(shù)分離株表現(xiàn)七重以上耐藥。另外，耐藥性還具有隨藥物使用時(shí)間延長(zhǎng)進(jìn)一步加劇的現(xiàn)象，從同一地區(qū)采集的分離株對(duì)紅霉素和多黏菌素B的耐藥率呈逐年升高的趨勢(shì)[32-33]。本研究采樣養(yǎng)殖場(chǎng)經(jīng)常采用慶大霉素、卡那霉素、磺胺嘧啶、頭孢類(lèi)藥物、喹諾酮類(lèi)藥物、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、四環(huán)素、土霉素、多黏菌素B、林可霉素等藥物進(jìn)行治療，從養(yǎng)殖場(chǎng)樣本中分離的鴨疫里默氏桿菌對(duì)頭孢噻肟、阿莫西林、大觀霉素的耐藥率低于30%，對(duì)土霉素、鹽酸四環(huán)素、鹽酸金霉素、慶大霉素、卡那霉素等藥物均表現(xiàn)高度耐藥。因此，總體上養(yǎng)殖場(chǎng)用藥與耐藥表型具有一定的對(duì)應(yīng)性，在臨床選擇藥物時(shí)，最好先進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選用抗菌效果較好的藥物，同時(shí)也要結(jié)合本養(yǎng)殖場(chǎng)的用藥史合理用藥。

通過(guò)分析本研究測(cè)序菌株耐藥表型與耐藥基因的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)攜帶tet(X)基因的菌株對(duì)四環(huán)素類(lèi)藥物全部表現(xiàn)耐藥，因此，tet(X)基因是介導(dǎo)四環(huán)素耐藥的最重要基因[34]；氨基糖苷類(lèi)耐藥率高于耐藥基因aadS的攜帶率，說(shuō)明除耐藥基因外還存在其他因素導(dǎo)致氨基糖苷類(lèi)耐藥，這一結(jié)果與蔡秀磊[35]研究結(jié)論一致，即氨基糖苷類(lèi)耐藥還與基因盒-整合子系統(tǒng)有關(guān)；blaOXA-209的陽(yáng)性率與耐藥率基本一致。由于本研究未對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)和氟苯尼考進(jìn)行藥物敏感性測(cè)試，因此，尚不清楚這2類(lèi)藥物耐藥基因攜帶率與耐藥表型的相關(guān)性?？傮w上，耐藥表型與耐藥基因具有一定的相關(guān)性，但是也要明確鴨疫里默氏桿菌分離株產(chǎn)生耐藥性的原因比較復(fù)雜，除與耐藥基因有關(guān)外，還與環(huán)境、藥物等諸多因素有關(guān)。

通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，來(lái)自世界各地的鴨疫里默氏桿菌菌株間存在地理分布差異，本研究的測(cè)序菌株主要分布在Clade 1簇群，且血清型全部為1型，由于數(shù)據(jù)庫(kù)中其他菌株沒(méi)有相關(guān)血清型信息，因此，具體血清型不明確，但可以推測(cè)，該簇群的分離株與血清1型密切相關(guān)。

鑒于本研究鴨疫里默氏桿菌血清型復(fù)雜及耐藥性嚴(yán)重的現(xiàn)狀，應(yīng)首先針對(duì)當(dāng)?shù)鼗虮攫B(yǎng)殖場(chǎng)主要流行的血清型選取相應(yīng)的滅活疫苗進(jìn)行免疫，當(dāng)出現(xiàn)疫苗株以外的血清型感染時(shí)，則以當(dāng)?shù)鼗虮攫B(yǎng)殖場(chǎng)的分離株制備滅活疫苗，同時(shí)選擇敏感藥物并合理用藥輔助治療，可以達(dá)到更有效的防治效果。

3.2 結(jié)論

本研究在對(duì)廣東地區(qū)鴨疫里默氏桿菌分離株的血清型和耐藥性初步了解的基礎(chǔ)上，又結(jié)合全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)耐藥基因、ST分型、遺傳進(jìn)化樹(shù)做進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)分離株的優(yōu)勢(shì)血清型為1型，耐藥性嚴(yán)重，所攜帶的耐藥基因與耐藥表型具有一定的相關(guān)性，ST型呈多樣性，與MLST 數(shù)據(jù)庫(kù)中來(lái)自我國(guó)的菌株遺傳背景相近，研究結(jié)果為鴨疫里默氏桿菌病疫苗免疫預(yù)防與藥物治療及掌握鴨疫里默氏桿菌遺傳進(jìn)化特征提供了依據(jù)。