王麗芳，毛炯炳，彭 耀，董育德，郝艷佳，毛偉光，黨向利

(1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，安徽 合肥 230036； 2 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，安徽 合肥 230036；3 紹興市曙光科技開(kāi)發(fā)有限公司，浙江 紹興 312000)

痂狀炭角菌Xylaria escharoidea(Berk.) Sacc.在分類(lèi)學(xué)上隸屬于子囊菌門(mén)Ascomycota炭角菌目Xylariales炭角菌科Xylariaceae炭角菌屬Xylaria。炭角菌屬是炭角菌科中最大的一個(gè)屬，是該科的模式屬，也是最早被描述的屬[1-2]。據(jù)Daranagama等[3]估計(jì)，炭角菌屬的種類(lèi)超過(guò)500種。全世界共發(fā)現(xiàn)300多個(gè)炭角菌屬物種，我國(guó)已知的炭角菌屬真菌有61種[2]。炭角菌屬真菌廣泛分布于世界各地，特別是熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，在我國(guó)海南、貴州、廣西、四川、浙江等地均發(fā)現(xiàn)多種炭角菌屬真菌[4-5]。

炭角菌屬是藥食同源的兼用真菌，該屬很多真菌種類(lèi)都具有一定的藥用價(jià)值[5-7]，比如增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗衰老、抗氧化、抗腫瘤、延長(zhǎng)壽命等功效[8]；而且生物活性高、成分多樣，越來(lái)越受到人們的青睞[9]。由于炭角菌生長(zhǎng)環(huán)境特殊、對(duì)生長(zhǎng)條件要求較高、自然資源稀缺，在世界藥用真菌研究、應(yīng)用領(lǐng)域均被視為珍稀資源，是一類(lèi)亟待開(kāi)發(fā)的新真菌資源。

鑒于炭角菌珍貴的藥用價(jià)值和較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，人們對(duì)炭角菌進(jìn)行了大量探索和研究。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外關(guān)于炭角菌屬的研究主要集中在培養(yǎng)條件優(yōu)化、化學(xué)成分分析、藥理作用和安全性評(píng)估等方面[8,10-13]。本研究在浙江省諸暨市大唐鎮(zhèn)楊板橋山塘的白蟻死亡巢穴上采集到一個(gè)野生的大型炭角菌標(biāo)本，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)鑒定，為痂狀炭角菌。國(guó)內(nèi)外對(duì)痂狀炭角菌的研究報(bào)道較少，邵雪蓮[13]對(duì)液體培養(yǎng)及粗多糖提取條件、體外抗氧化活性進(jìn)行了研究；聞紹峰等[14]以菌絲體生長(zhǎng)狀況為指標(biāo)，對(duì)母種培養(yǎng)基及栽培菌核培養(yǎng)料進(jìn)行了優(yōu)化；Yue等[15]發(fā)現(xiàn)痂狀炭角菌胞內(nèi)多糖和胞外多糖具有抗氧化活性；Nagam等[16]從痂狀炭角菌中鑒定出具有抗菌活性的化合物4,8-dihydroxy-3,4-dihydronaphthalen-1(2H)。目前有關(guān)痂狀炭角菌人工培養(yǎng)子座的報(bào)道較少。本研究將采集的痂狀炭角菌菌株分離后進(jìn)行了形態(tài)和分子鑒定，對(duì)液體發(fā)酵條件和固體培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)痂狀炭角菌液體發(fā)酵產(chǎn)物的抗菌、抗氧化活性進(jìn)行了測(cè)定，以期為今后痂狀炭角菌的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

野生痂狀炭角菌菌株(編號(hào)：ZJ1811，采集人：毛偉光)采集于浙江省諸暨市大唐鎮(zhèn)楊板橋山塘白蟻死亡巢穴上，經(jīng)鑒定，該菌株現(xiàn)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(保藏號(hào)為CGMCC NO.17000)。

1.2 培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g/L、葡萄糖 20 g/L、瓊脂 15 g/L、氯霉素 0.1 g/L，pH 自然；液體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g/L、葡萄糖 20 g/L、酵母粉10 g/L、KH2PO41 g/L，pH 自然；木屑基礎(chǔ)培養(yǎng)基：木屑、石膏、蔗糖和玉米粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為78%、1%、1%和20%，加入質(zhì)量為固體基料質(zhì)量80%的水，混合均勻，pH自然；優(yōu)化的液體發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g/L、可溶性淀粉 40 g/L、蠶蛹粉 6 g/L、MgSO40.6 g/L，pH 自然；LB 固體培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g/L、酵母粉 5 g/L、NaCl 10 g/L，pH 自然。所有培養(yǎng)基均在120 ℃高溫高壓條件下滅菌40 min。

1.3 菌株的分離和培養(yǎng)

將采集的子座樣品使用75%(φ)乙醇溶液表面滅菌20 s，然后用無(wú)菌水沖洗3次。在超凈臺(tái)上用滅菌的刀片切取小塊(1 cm×1 cm)子實(shí)體接種于PDA 培養(yǎng)基，置于 (28±1) ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 3 d。挑取單菌落進(jìn)行分離、純化，并重復(fù)純化1次，獲得純化的菌株。

1.4 子座切片六胺銀染色

子座組織石蠟切片染色由武漢賽維爾生物科技有限公司利用六胺銀染色法進(jìn)行，包括石蠟切片脫蠟脫水、六胺銀染色、組織酸化、孵育染色、顯色和脫水封片，最后在正置光學(xué)顯微鏡Eclipse E100(尼康，日本)下觀察拍照。

1.5 ITS序列測(cè)定

根據(jù)真菌基因組DNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)操作說(shuō)明提取野生子座及分離菌株培養(yǎng)的菌絲體的基因組DNA。以提取的基因組DNA作為模板進(jìn)行ITS序列擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：Taq 聚合酶 10 μL，上、下游引物各 0.5 μL，DNA 1 μL，ddH2O 8 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃ 預(yù)變性3 min，94 ℃ 變性 30 s、55 ℃ 退火 30 s、72 ℃ 延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 延伸 10 min。引物序列：ITS4 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′和 ITS5 5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)利用Blast程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行相似性搜索比對(duì)。

1.6 液體培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.6.1 碳源、氮源和金屬離子篩選 取 4 ℃ 保存的斜面菌種，室溫復(fù)蘇30 min后，接種到PDA培養(yǎng)基，(28±1)℃條件下培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)平板，得到活化菌種。將活化菌種分別接種(接種量為直徑0.5 cm菌碟)至含不同碳源(葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉)、不同氮源(酵母粉、蛋白胨、蠶蛹粉、氯化銨、尿素)和不同金屬離子(KH2PO4、MgSO4、ZnSO4、CaCl2、MnSO4)的液體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在溫度 (28±1)℃、裝液量 150 mL/250 mL 三角瓶、轉(zhuǎn)速160 r/min的條件下培養(yǎng)8 d。將濾紙烘干至恒質(zhì)量，稱(chēng)質(zhì)量并記錄；用烘干的濾紙過(guò)濾發(fā)酵液，將濾紙及過(guò)濾物烘干至恒質(zhì)量，稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算菌絲干質(zhì)量。據(jù)此篩選最優(yōu)三因素，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6.2 三因素濃度篩選 在“1.6.1”優(yōu)化確定最佳三因素(碳源、氮源及金屬離子)基礎(chǔ)上，設(shè)置單個(gè)因素的水平，篩選出每個(gè)因素最有利的3個(gè)水平。其中碳源(可溶性淀粉)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、2%、3%、4%、5%，氮源(蠶蛹粉)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2% 和金屬離子(MgSO4)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%。按照“1.6.1”培養(yǎng)條件及計(jì)質(zhì)量方法進(jìn)行液體發(fā)酵及水平篩選，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6.3 正交試驗(yàn) 以篩選出的最佳三因素的3個(gè)水平，即可溶性淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、4%和5%，蠶蛹粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%、0.4%和0.6%，MgSO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.04%、0.06%和0.08%，構(gòu)建三因素三水平表，并按照正交試驗(yàn)方案表進(jìn)行正交試驗(yàn)。按照“1.6.1”培養(yǎng)條件及計(jì)質(zhì)量方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)及條件優(yōu)化，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 固體培養(yǎng)條件優(yōu)化

在木屑基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加基料質(zhì)量1%的不同的氨基酸(纈氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸和異亮氨酸)。將50 g培養(yǎng)基裝入透明培養(yǎng)瓶(直徑80 mm、高120 mm)中，用玻璃棒在培養(yǎng)基上打孔，滅菌、冷卻后備用。每瓶接種1 mL液體發(fā)酵3 d的菌液，在(28±1)℃條件下培養(yǎng)15 d。木屑基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對(duì)照，統(tǒng)計(jì)子實(shí)體數(shù)量、粗細(xì)及高度。

1.8 液體發(fā)酵產(chǎn)物的制備

選用優(yōu)化的液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行痂狀炭角菌菌株的液體發(fā)酵。接種量為直徑0.5 cm打孔器菌碟 1 塊，按照溫度 (28±1)℃、裝液量 150 mL/250 mL、轉(zhuǎn)速160 r/min的培養(yǎng)條件培養(yǎng)8 d。收集發(fā)酵液，經(jīng)100目孔徑雙層紗布過(guò)濾除菌絲后，在4 ℃、12 000 r/min 條件下離心 30 min 除去發(fā)酵液中較大顆粒物質(zhì)。收集上清液，于64 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸干備用。

1.9 抗菌活性測(cè)定

利用平板打孔抑菌法進(jìn)行抗菌活性測(cè)定。將LB固體培養(yǎng)基融化后，取20 mL冷卻至45 ℃左右，加入30 μL革蘭陰性菌-大腸埃希菌Escherichia coli或革蘭陽(yáng)性菌-金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus(D600nm=0.3)，搖勻，倒入一次性培養(yǎng)皿。待培養(yǎng)基凝固后，平板上打孔(直徑7 mm)，每孔加入液體發(fā)酵產(chǎn)物 100 μL(質(zhì)量濃度為10 mg/mL)，以同體積水和山梨酸鉀溶液(質(zhì)量濃度為 10 mg/mL)分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照，(37±1)℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜，觀察并測(cè)量抑菌圈直徑。

1.10 抗氧化活性測(cè)定

將液體發(fā)酵產(chǎn)物用乙醇重溶(質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL)，以維生素 E(VE)和維生素 C(Vc)作為陽(yáng)性對(duì)照，不加樣品作為空白對(duì)照(CK)。用乙醇將1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)配成濃度為0.5 mmol/L 的溶液。依次加入 0.1 mL 樣品、1.0 mL DPPH、1.9 mL 乙醇和 2 mL 0.1 mol/L 醋酸鹽緩沖液后混勻，25 ℃條件下避光反應(yīng)30 min，然后利用分光光度計(jì)(SOPTOP)測(cè)定517 nm處光密度。試驗(yàn)重復(fù)3次，按照下式計(jì)算樣品抗氧化活性：

式中， 為空白對(duì)照在517 nm處光密度，為樣品在517 nm處光密度。D517 nm(空白)D517 nm (樣品)

1.11 數(shù)據(jù)分析

使用數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)DPS v7.05的單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。顯著性差異分析采用 Duncan’s新復(fù)極差法 (P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 采集的炭角菌菌株子座形態(tài)特征

對(duì)從浙江省諸暨市白蟻死亡巢穴上生長(zhǎng)的子座進(jìn)行形態(tài)鑒定。該子座單生直立，子座大、圓柱型，質(zhì)地堅(jiān)硬，底部有柄，細(xì)小黑色，中上部分粗大，顏色為黃色至黑灰色，表面有黑色凸起，頂部呈細(xì)長(zhǎng)狀(圖1A)。子囊殼多個(gè)、橢圓形，埋生于子座內(nèi)側(cè)(圖1B)，孔口乳狀凸起(圖1C)。子囊圓柱形，具長(zhǎng)柄(圖1 D)，內(nèi)含8個(gè)子囊孢子，單列排列，子囊孢子橢圓形，不等邊，6.0～6.5 μm×2.0～2.5 μm，較光滑(圖1E)。上述形態(tài)特征與痂狀炭角菌[4]相符。

圖1 采集的炭角菌子座外觀形態(tài)及子囊橫切面Fig.1 Appearance and ascus cross-section of collectedXylaria stromata

2.2 采集菌株ITS序列測(cè)序及鑒定

通過(guò)擴(kuò)增和DNA測(cè)序，將子座ITS序列(Accession No.：MZ326827)和分離培養(yǎng)菌絲體ITS 序列 (Accession No.：MZ326828)上傳到NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)。將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)利用網(wǎng)上在線Blast程序進(jìn)行相似性比對(duì)。比對(duì)結(jié)果顯示子座ITS序列及培養(yǎng)的菌絲體ITS序列完全一致，與痂狀炭角菌 (Accession No.：MN622766)只有1個(gè)位點(diǎn)的核苷酸序列不同，相似性達(dá)到99%以上。經(jīng)過(guò)形態(tài)鑒定和分子鑒定，將該子實(shí)體及其分離菌株最終命名為痂狀炭角菌 ZJ1811。

2.3 痂狀炭角菌液體發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

在添加不同碳源試驗(yàn)中，痂狀炭角菌對(duì)供試碳源有不同程度的利用率。添加葡萄糖、果糖、可溶性淀粉發(fā)酵的菌絲干質(zhì)量較大，可溶性淀粉發(fā)酵的菌絲干質(zhì)量達(dá)1.905 g(圖2A)。在添加不同氮源試驗(yàn)中，添加蠶蛹粉發(fā)酵的菌絲與添加蛋白胨、酵母粉、氯化銨和尿素發(fā)酵的菌絲差異顯著。蠶蛹粉是最佳氮源，菌絲干質(zhì)量達(dá)3.083 g；而痂狀炭角菌對(duì)氯化銨、尿素的吸收較差，不適于菌絲生長(zhǎng)(圖2B)。在添加不同無(wú)機(jī)金屬鹽離子試驗(yàn)中，添加MgSO4產(chǎn)生的菌絲干質(zhì)量最大，達(dá)1.932 g(圖2C)。綜合菌絲產(chǎn)量及試驗(yàn)成本，篩選出適合痂狀炭角菌菌絲體生長(zhǎng)的最佳碳源、氮源、金屬離子分別為可溶性淀粉、蠶蛹粉、MgSO4。

圖2 添加不同碳源、氮源、金屬離子的菌絲體干質(zhì)量Fig.2 Dry weight of mycelia with different carbon and nitrogen sources,and metal ions

液體發(fā)酵最佳三因素三水平篩選結(jié)果如圖3所示，不同處理間的菌絲體干質(zhì)量差異顯著。同時(shí)可以看到，隨著可溶性淀粉、蠶蛹粉和MgSO4的添加量增加，菌絲體產(chǎn)量也在增加，但是達(dá)到最大量之后，菌絲體產(chǎn)量就會(huì)隨著添加量的增加而減少。這也說(shuō)明，菌絲體發(fā)酵的碳源、氮源和金屬離子不是越多越好，添加多了反而抑制菌絲生長(zhǎng)。篩選菌絲體干質(zhì)量最大的3個(gè)添加量分別是可溶性淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、4%、5%；蠶蛹粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%、0.4%、0.6%；MgSO4質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.04%、0.06%、0.08%。

圖3 添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)可溶性淀粉、蠶蛹粉和MgSO4的菌絲體干質(zhì)量變化Fig.3 Dry weight of mycelia with different mass fractions of soluble starch,silkworm pupa powder and MgSO4

通過(guò)上述結(jié)果確定痂狀炭角菌培養(yǎng)條件最佳三因素三水平，按照正交試驗(yàn)表進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。從表1可以看出痂狀炭角菌發(fā)酵菌絲干質(zhì)量最大為3.335 g，而從K值可以看出，痂狀炭角菌各因素最大菌絲干質(zhì)量水平為可溶性淀粉4%、蠶蛹粉0.6%、MgSO40.06%；從極差R可以看出不同因素影響?zhàn)锠钐拷蔷L(zhǎng)的順序?yàn)榭扇苄缘矸郏拘Q蛹粉＞MgSO4。綜上所述痂狀炭角菌菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)最佳為可溶性淀粉4%、蠶蛹粉0.6%、MgSO40.06%。

表1 痂狀炭角菌液體培養(yǎng)優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of Xylaria escharoidea liquid culture optimization using orthogonal experiment

2.4 添加不同氨基酸對(duì)無(wú)性子座生長(zhǎng)的影響

痂狀炭角菌在添加不同氨基酸的條件下培養(yǎng)15 d后可見(jiàn)無(wú)性子座(圖4)，子座生長(zhǎng)情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。除了添加甲硫氨酸外，從無(wú)性子座數(shù)量、粗細(xì) (粗：直徑≥3 mm，細(xì)：直徑＜3 mm)和長(zhǎng)度 (較長(zhǎng)：＞8 cm，長(zhǎng)：5～8 cm，較短：2～5 cm，短：＜2 cm)來(lái)看，添加氨基酸培養(yǎng)的無(wú)性子座生長(zhǎng)都好于對(duì)照CK(未添加氨基酸)，說(shuō)明添加氨基酸能夠促進(jìn)子座的生長(zhǎng)。從子座數(shù)量來(lái)看，添加了苯丙氨酸、蘇氨酸、組氨酸、纈氨酸和異亮氨酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)的子實(shí)體數(shù)量較多，顯著高于CK；從子座粗細(xì)來(lái)看，添加了纈氨酸、精氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)的子實(shí)體較粗；從子座長(zhǎng)度來(lái)看，添加了纈氨酸、甘氨酸、蘇氨酸和異亮氨酸培養(yǎng)基培養(yǎng)的子座長(zhǎng)度較長(zhǎng)。綜合子座數(shù)量、粗細(xì)和長(zhǎng)度，添加纈氨酸、異亮氨酸或蘇氨酸的固體培養(yǎng)基是比較好的固體培養(yǎng)基，能夠有效促進(jìn)子座的生長(zhǎng)。

圖4 不同培養(yǎng)天數(shù)的無(wú)性子座Fig.4 Asexual stromata cultured for different days

表2 添加不同氨基酸對(duì)無(wú)性子座生長(zhǎng)的影響1)Table 2 Effects of different amino acid additions on the growth of asexual stromata

2.5 痂狀炭角菌液體發(fā)酵產(chǎn)物抗菌活性

痂狀炭角菌液體發(fā)酵產(chǎn)物大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌打孔法抑菌試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可以看出，發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌活性要高于對(duì)大腸埃希菌的。另外在相同濃度下，發(fā)酵產(chǎn)物抗菌效果優(yōu)于常用的化學(xué)抗菌劑山梨酸鉀，說(shuō)明痂狀炭角菌株發(fā)酵產(chǎn)物具有優(yōu)良的抗菌作用，將來(lái)可開(kāi)發(fā)為食品等防腐保鮮的抗菌劑。

圖5 平板抑菌法測(cè)定痂狀炭角菌液體發(fā)酵產(chǎn)物抗菌活性Fig.5 Antibacterial activity of liquid fermentation product of Xylaria escharoidea by plate bacteriostatic method

表3 痂狀炭角菌液體發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)細(xì)菌的抗菌活性1)Table 3 Antibacterial activity of liquid fermentation product of Xylaria escharoidea against bacteria

2.6 痂狀炭角菌液體發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性

痂狀炭角菌液體發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)DPPH的抗氧化活性為(75.19±2.08)% (圖6)，顯著高于陽(yáng)性對(duì)照維生素E的抗氧化活性(60.56±1.21)%，但顯著低于維生素C的抗氧化活性(79.07±1.65)%，說(shuō)明痂狀炭角菌液體發(fā)酵產(chǎn)物具有一定的抗氧化效果。

圖6 痂狀炭角菌液體發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性Fig.6 Antioxidant activity of liquid fermentation product of Xylaria escharoidea

3 討論與結(jié)論

炭角菌屬某些真菌具有多種應(yīng)用價(jià)值，但它們的天然資源非常稀少，而且生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，不能滿(mǎn)足需求。利用現(xiàn)代生物技術(shù)進(jìn)行液體深層發(fā)酵和固體培養(yǎng)，可以獲得用于研發(fā)或應(yīng)用的菌絲體、代謝產(chǎn)物及子座[17]。經(jīng)形態(tài)觀察、ITS序列測(cè)定及中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心鑒定，將從浙江省諸暨市白蟻死亡巢穴上采集的子座鑒定為痂狀炭角菌。痂狀炭角菌國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少，目前邵雪蓮[13]、聞紹峰等[14]的報(bào)道均為子座的人工栽培技術(shù)研究。本研究以菌絲體干質(zhì)量為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)不同碳源、氮源和金屬離子進(jìn)行篩選；結(jié)果顯示痂狀炭角菌菌絲體發(fā)酵最佳碳源為可溶性淀粉，最佳氮源為蠶蛹粉，最佳無(wú)機(jī)金屬鹽離子為MgSO4。痂狀炭角菌的菌絲體在不同碳源的培養(yǎng)基下均能生長(zhǎng)，但它們之間存在顯著差異，在可溶性淀粉培養(yǎng)基上發(fā)酵的菌絲干質(zhì)量最大，這與邵雪蓮等[13]研究痂狀炭角菌液體發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果一致。在添加不同氮源試驗(yàn)中，痂狀炭角菌對(duì)供試氮源有不同程度的利用率，不同氮源菌絲體干質(zhì)量排序?yàn)樾Q蛹粉＞蛋白胨＞酵母粉＞氯化銨＞尿素。天然氮源(蠶蛹粉)最適合痂狀炭角菌菌絲生長(zhǎng)，其次是有機(jī)氮源(蛋白胨和酵母粉)，無(wú)機(jī)氮源(氯化銨和尿素)效果較差。聞紹鋒等[14,18]也發(fā)現(xiàn)不同氮源炭角菌菌絲生長(zhǎng)效果不一致，天然氮源優(yōu)于有機(jī)氮源，有機(jī)氮源優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源，無(wú)機(jī)氮源中的銨態(tài)氮優(yōu)于硝態(tài)氮，銨態(tài)氮中的磷酸二氫銨優(yōu)于其他銨鹽。大型真菌生長(zhǎng)需要的礦物元素分為大量元素和微量元素，大量元素有P、S、Mg、K和Ca，微量元素有 Fe、Mn、Zn、Cu、B、Mo 等[19]。從本研究結(jié)果可知痂狀炭角菌菌絲對(duì)無(wú)機(jī)鹽的利用存在差異，菌絲體干質(zhì)量排序?yàn)?MgSO4＞KH2PO4＞CaCl2＞MnSO4＞ZnSO4，添加MgSO4的培養(yǎng)基菌絲生物量最大，前四者沒(méi)有顯著差異，表明Mg、K、Ca和Mn是痂狀炭角菌生長(zhǎng)必需的大量元素和微量元素。邵雪蓮[13]也發(fā)現(xiàn)添加KH2PO4和MgSO4的培養(yǎng)基中痂狀炭角菌菌絲生物量最大，而陳宛如等[20]研究發(fā)現(xiàn)Mg2+、Zn2+是黑柄炭角菌的生長(zhǎng)必需元素；這表明不同炭角菌種類(lèi)對(duì)無(wú)機(jī)鹽的利用率有所不同。經(jīng)正交試驗(yàn)篩選的液體發(fā)酵培養(yǎng)基成分最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為可溶性淀粉4%、蠶蛹粉0.6%、MgSO40.06%。

氨基酸是構(gòu)成生物體蛋白質(zhì)最基本的物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分之一。我們?cè)谀拘蓟A(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同的氨基酸，發(fā)現(xiàn)除了添加甲硫氨酸外，添加氨基酸培養(yǎng)的無(wú)性子座生長(zhǎng)(數(shù)量、粗細(xì)和長(zhǎng)度)均優(yōu)于未添加氨基酸的培養(yǎng)基。張文強(qiáng)等[21]研究蛋白添加劑對(duì)雙孢菇農(nóng)藝性狀及品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)豆粕、膨化大豆、玉米等蛋白均能有效提高蘑菇產(chǎn)量及蘑菇子實(shí)體蛋白質(zhì)含量。馬元偉等[22]也發(fā)現(xiàn)通過(guò)氨基酸的添加，絲狀真菌菌株產(chǎn)孢能力增加，可以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)地防止絲狀真菌退化。

炭角菌屬真菌大多數(shù)具抗氧化、抗菌、清除自由基、抗機(jī)體衰老等功能。龔慶芳等[23]對(duì)黑柄炭角菌發(fā)酵菌絲的化合物進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)1-(2,6-二羥基苯)-3-羥基-丁酮具有很強(qiáng)的抗氧化活性。翁榕安等[24]報(bào)道水溶性黑柄炭角菌肽對(duì)DPPH自由基的清除能力與維生素C接近。劉霞[25]從縱條紋炭角菌次生代謝產(chǎn)物中分離出2個(gè)抗菌活性強(qiáng)的化合物-麥角甾醇和過(guò)氧麥角甾醇，對(duì)多種病菌都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性。本研究也發(fā)現(xiàn)痂狀炭角菌液體發(fā)酵產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗菌和抗氧化活性，因此，需要對(duì)痂狀炭角菌液體發(fā)酵液的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行深入的研究，為今后將痂狀炭角菌液體發(fā)酵產(chǎn)物開(kāi)發(fā)為抗菌劑、抗氧化劑等提供科學(xué)依據(jù)。