向 勇，李慶缽，劉 鵬，黎麗珍，姜 增，陳小燕，曹偉勝,2

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510642； 2 嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部人獸共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省動(dòng)物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/人獸共患病防控制劑國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510642)

七彩山雞是一種野生禽類，又稱野雞、雉雞，在食用和藥用等多方面具有可觀的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，并已被列入《國家保護(hù)的有重要生態(tài)、科學(xué)、社會(huì)價(jià)值的陸生野生動(dòng)物名錄》?；谏鲜鰞?yōu)勢(shì)，廣東省內(nèi)七彩山雞的養(yǎng)殖規(guī)模逐步擴(kuò)大，每年向全國多個(gè)省份提供七彩山雞種苗。

銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa，又被稱為綠膿桿菌，可以在人、動(dòng)物和環(huán)境中循環(huán)傳播，不僅影響?zhàn)B殖業(yè)的發(fā)展而且嚴(yán)重危害人類健康[1-2]。隨著養(yǎng)禽業(yè)規(guī)模的逐漸擴(kuò)大，由銅綠假單胞菌導(dǎo)致的禽類疾病顯著增多[3-5]。銅綠假單胞菌嚴(yán)重的耐藥性一直是醫(yī)院臨床高度關(guān)注并愈發(fā)棘手的問題[6-8]，碳青霉烯類抗菌藥如亞胺培南、美羅培南等是目前醫(yī)院對(duì)抗銅綠假單胞菌的最后一道有效防線，銅綠假單胞菌也逐漸對(duì)這些藥物產(chǎn)生耐藥性[9-10]。近年來，有學(xué)者從雞、候鳥及其養(yǎng)殖環(huán)境中分離到嚴(yán)重耐藥的銅綠假單胞菌[11]，甚至有證據(jù)表明多重耐藥的銅綠假單胞菌菌株在人、動(dòng)物、環(huán)境中傳播，嚴(yán)重影響公共衛(wèi)生安全[12]。多位點(diǎn)序列分型(Multi-locus sequence typing，MLST)是通過對(duì)多個(gè)特定管家基因進(jìn)行測(cè)序來分型的分子分型方法。醫(yī)院內(nèi)廣泛流行的銅綠假單胞菌以ST-235和ST-244為主[13-14]；Martins等[11]對(duì)從候鳥菌群中分離得到的產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶的銅綠假單胞菌進(jìn)行MLST分型，發(fā)現(xiàn)均屬于ST-277型。目前銅綠假單胞菌在七彩山雞中的流行情況及耐藥性仍然不明，也缺乏相關(guān)的MLST分型數(shù)據(jù)。

本研究對(duì)廣東省規(guī)?；钠卟噬诫u養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行銅綠假單胞菌的分離鑒定，了解其流行情況，并對(duì)分離的銅綠假單胞菌進(jìn)行抗菌藥物敏感性分析，為臨床合理用藥提供參考；同時(shí)，采用MLST方法對(duì)分離到的耐藥譜較廣的銅綠假單胞菌菌株進(jìn)行分子流行病學(xué)分析，探討耐藥銅綠假單胞菌的遺傳進(jìn)化背景。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、MH液體培養(yǎng)基、MH固體培養(yǎng)基、銅綠假單胞菌ATCC27853以及大腸埃希菌Escherichia coliATCC25922 均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。NAC固體培養(yǎng)基、NAC液體培養(yǎng)基、無菌均質(zhì)袋均為青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。rTaq PCR Premix購自上海翌圣生物科技有限公司。藥敏紙片為OXOID公司產(chǎn)品。SQ組織DNA提取試劑盒為OMEGA公司產(chǎn)品。

1.2 樣品采集

從廣東省3個(gè)規(guī)?；钠卟噬诫u養(yǎng)殖場(chǎng)收集死胚及周圍環(huán)境樣本。對(duì)于死胚，直接收集孵化房?jī)?nèi)21日齡仍未出殼且外殼完好的胚；對(duì)于環(huán)境樣本，用無菌的棉拭子采集飼料、孵化機(jī)內(nèi)灰塵、籠具器械灰塵、飲水等放入裝有適量滅菌NAC液體培養(yǎng)基的15 mL離心管中。從樣品采集至運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室不超過 8 h。

1.3 銅綠假單胞菌的分離鑒定

用75%(φ)乙醇溶液將死胚外殼充分消毒3次，無菌操作取出胚體并剪碎，放入無菌均質(zhì)袋；加入適量無菌的NAC液體培養(yǎng)基，37 ℃、120 r/min培養(yǎng)8 h；取上述菌液以1∶10的體積比接種到新的培養(yǎng)基內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)12～16 h；采用三線法劃板于NAC固體培養(yǎng)基，18～24 h之后，挑取綠色單菌落，參考文獻(xiàn)[15]進(jìn)行銅綠假單胞菌特異性基因oprI的PCR擴(kuò)增并送廣州擎科生物有限公司測(cè)序。

1.4 藥物敏感性試驗(yàn)

利用銅綠假單胞菌ATCC27853和大腸埃希菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株，按照K-B紙片擴(kuò)散法測(cè)試銅綠假單胞菌分離株對(duì)22種抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)，并參照標(biāo)準(zhǔn)[16]對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定。抗菌藥物如下：氨芐西林(Ampicillin)、復(fù)方新諾明(Complex sulfamethoxazole)、萘啶酸 (Nalidixic acid)、卡那霉素(Kanamycin)、四環(huán)素(Tetracycline)、氯霉素(Chloramphenicol)、哌拉西林(Piperacillin)、頭孢噻肟(Cefotaxime)、頭孢吡肟(Cefepime)、頭孢他啶(Ceftazidime)、頭孢哌酮 (Cefoperazone)、亞胺培南(Imipenem)、美羅培南 (Meropenem)、氨曲南(Aztreonam)、哌拉西林/他唑巴坦(Piperacillin/tazobactam)、頭孢哌酮/舒巴坦(Cefoperazone/sulbactam)、妥布霉素 (Tobramycin)、阿米卡星(Amikacin)、慶大霉素 (Gentamicin)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin)、左氧氟沙星(Levofloxacin)和多黏菌素 B(Polymyxin B)。

1.5 多位點(diǎn)序列分型

參照試劑盒說明書提取銅綠假單胞菌的總DNA，參考文獻(xiàn)[17]中的引物序列和PCR反應(yīng)體系、擴(kuò)增條件，對(duì)銅綠假單胞菌的7個(gè)管家基因(acsA、aroE、guaA、mutL、nuoD、ppsA、trpE)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增并測(cè)序。將測(cè)序得到的基因序列上傳至銅綠假單胞菌的MLST官網(wǎng)(https://pubmlst.org/paeruginosa/)，得到各個(gè)管家基因序列對(duì)應(yīng)的等位基因編號(hào)。7個(gè)等位基因編號(hào)按照順序依次排列形成7個(gè)數(shù)字組成的等位基因譜并得到相應(yīng)的ST型。若7個(gè)等位基因編號(hào)不能與數(shù)據(jù)庫中已有數(shù)據(jù)完全匹配，則認(rèn)為是新發(fā)現(xiàn)的ST型，將該菌株的相關(guān)資料上傳至數(shù)據(jù)庫，經(jīng)確認(rèn)后給出新的ST型編號(hào)。

1.6 遺傳進(jìn)化分析

將各ST型的7個(gè)管家基因序列按順序拼接得到多個(gè)長度相同的序列，用MEGA7軟件對(duì)這些拼接好的序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，得到各ST型的遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品采集數(shù)量

從廣東省的3個(gè)規(guī)?；卟噬诫u養(yǎng)殖場(chǎng)收集到死胚樣品共405份，采集飼料、孵化機(jī)內(nèi)污垢、籠具灰塵、器械灰塵、自來水等環(huán)境樣品共109份。

2.2 銅綠假單胞菌的分離與鑒定

銅綠假單胞菌在選擇性培養(yǎng)基(NAC固體培養(yǎng)基)中呈現(xiàn)出圓形、表面光滑且濕潤的綠色菌落(圖1)，并散發(fā)出芳香氣味。對(duì)特異性基因oprI進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出214 bp左右的條帶(圖2)。結(jié)合測(cè)序結(jié)果確認(rèn)為銅綠假單胞菌。本研究共分離鑒定出銅綠假單胞菌145株(分離率28.2%,145/514)，其中環(huán)境樣本分離出24株(分離率22.0%，24/109)，死胚分離出121株(分離率29.9%，121/405)(表1)。

圖1 NAC固體培養(yǎng)基上銅綠假單胞菌的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of Pseudomonas aeruginosa on NAC solid medium

圖2 oprI基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR product for oprI gene

表1 不同七彩山雞養(yǎng)殖場(chǎng)中銅綠假單胞菌臨床分離株的數(shù)量及分離率Table 1 Quantity and isolation rate of clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa from different breeding poultry farms

2.3 抗菌藥物敏感性

共22種抗菌藥物被用來測(cè)試分離鑒定出的145株銅綠假單胞菌菌株的藥物敏感性，結(jié)果(表2)顯示，除對(duì)氨芐西林、卡那霉素和萘啶酸天然耐藥外，銅綠假單胞菌對(duì)復(fù)方新諾明、氯霉素、四環(huán)素的耐藥性較強(qiáng)；其次為頭孢噻肟；銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南、哌拉西林、頭孢他啶、頭孢哌酮和哌拉西林/他唑巴坦表現(xiàn)出較低的耐藥率；未檢測(cè)到對(duì)美羅培南、阿米卡星、頭孢哌酮/舒巴坦和多黏菌素B耐藥的銅綠假單胞菌菌株。死胚和環(huán)境來源的銅綠假單胞菌總體耐藥情況相似，但環(huán)境樣品分離株的耐藥性要強(qiáng)于死胚分離株。耐藥譜分析(表3)顯示，所有分離菌株均表現(xiàn)出耐4種及以上抗菌藥，最廣耐15種抗菌藥，其中6耐菌株最多。除天然耐藥外，耐3類及以上抗菌藥的銅綠假單胞菌菌株占比為73.1%(106/145)，表現(xiàn)出多重耐藥性。其中，耐3類抗菌藥的菌株數(shù)量最多，占44.8%(65/145)；其次為耐 4類，占 11.0%(16/145)；耐 5類占 4.8%(7/145)；耐7類占4.1%(6/145)。

表2 死胚和環(huán)境樣品中耐藥銅綠假單胞菌菌株數(shù)量及占比1)Table 2 Number and proportion of drug-resistant Pseudomonas aeruginosa strain in dead embryo and environment samples

表3 銅綠假單胞菌的耐藥譜及對(duì)應(yīng)菌株數(shù)量Table 3 Drug resistance spectrum and strain quantity of Pseudomonas aeruginosa

2.4 多位點(diǎn)序列分型

從145株銅綠假單胞菌菌株中選取耐藥譜較廣的89株進(jìn)行MLST分析，結(jié)果(表4)顯示，89株菌株可分為18個(gè)ST型，呈現(xiàn)高度多樣性，其中，72株屬于原有數(shù)據(jù)庫已包含的12種ST型。另外17株的ST型不包含在原數(shù)據(jù)庫中，經(jīng)提交相關(guān)資料至數(shù)據(jù)庫并由管理員確認(rèn)后得到6個(gè)新的ST型，分別為 ST-3199、ST-3200、ST-3201、ST-3202、ST-3203和ST-3204。死胚中分離到的銅綠假單胞菌以ST-260為優(yōu)勢(shì)ST型，環(huán)境中分離到的銅綠假單胞菌菌株ST型以ST-2100和ST-3202為主。

表4 89株銅綠假單胞菌菌株各ST型菌株數(shù)量及來源Table 4 Quantity and source of each ST type in 89 Pseudomonas aeruginosa strains

2.5 遺傳進(jìn)化分析

由圖3可見，銅綠假單胞菌環(huán)境樣品分離株與死胚分離株之間的親緣關(guān)系比較緊密，如環(huán)境樣品(飲水)分離株ST-3201與死胚分離株ST-3199屬于同一分支，ST-3202與ST-1971、ST-2640屬于同一大分支。

圖3 死胚和環(huán)境樣品中不同銅綠假單胞菌ST型的遺傳進(jìn)化分析Fig.3 Genetic evolution analysis of different Pseudomonas aeruginosa ST types isolated from dead embryo and environment samples

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

銅綠假單胞菌是一種常見的、能引起人類和動(dòng)物機(jī)會(huì)性感染的病原體。銅綠假單胞菌具有強(qiáng)大的代謝可塑性和多功能性，能夠感染或定殖廣泛的生態(tài)位，包括水生和土壤生境、動(dòng)植物等[18-19]，尤其危害免疫功能低下的患者[20-21]。目前關(guān)于七彩山雞中銅綠假單胞菌流行情況的報(bào)道較少，缺乏該方面的流行病學(xué)數(shù)據(jù)。本研究從3個(gè)規(guī)?；卟噬诫u養(yǎng)殖場(chǎng)共分離到145株銅綠假單胞菌，分離率為28.2%，七彩山雞死胚中有比較嚴(yán)重的銅綠假單胞菌感染，周圍環(huán)境樣本也被銅綠假單胞菌污染。其中，A場(chǎng)的死胚中銅綠假單胞菌的感染情況最為嚴(yán)重，這可能是導(dǎo)致該養(yǎng)殖場(chǎng)種蛋出雛率較低的原因之一，而環(huán)境樣本如孵化機(jī)污垢中分離出的銅綠假單胞菌菌株與死胚分離株具有較近的親緣關(guān)系也證明了該推斷的合理性，胚胎被孵化機(jī)內(nèi)的銅綠假單胞菌污染，并侵入蛋殼，致其死亡。因此在家禽養(yǎng)殖過程中，要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，采取嚴(yán)格的生物安全措施，防止銅綠假單胞菌污染種蛋，避免損失。

銅綠假單胞菌外膜的低滲透性和主動(dòng)外排系統(tǒng)的外排作用使其對(duì)很多抗生素產(chǎn)生固有耐藥，同時(shí)該菌還能通過產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶、外排泵表達(dá)和生物被膜等多種機(jī)制產(chǎn)生獲得性耐藥[22-23]。加之近年來臨床上各種插管、導(dǎo)管、機(jī)械通氣等侵襲性診療手段的應(yīng)用，免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用和抗生素的不合理使用導(dǎo)致銅綠假單胞菌的耐藥形勢(shì)嚴(yán)峻，出現(xiàn)了多重耐藥銅綠假單胞菌，且數(shù)量日益增加，為臨床的治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)，并在全球范圍內(nèi)危害人類健康[24-25]。無論銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制如何，多重耐藥銅綠假單胞菌菌株引起的感染日益增多，嚴(yán)重影響臨床上的抗感染治療，因此常導(dǎo)致較高的死亡率[1,18]。

本研究選取了常用的22種抗菌藥進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，其中亞胺培南、哌拉西林、頭孢吡肟、頭孢他啶等都是醫(yī)院臨床治療銅綠假單胞菌感染性疾病的一線藥物，但部分銅綠假單胞菌分離株也對(duì)其表現(xiàn)出了耐藥現(xiàn)象，即便其耐藥率較低，也應(yīng)當(dāng)引起重視，特別是醫(yī)院臨床使用頻率較高的抗感染藥物如亞胺培南。在本研究所調(diào)查的養(yǎng)殖場(chǎng)中，均未使用亞胺培南、哌拉西林、頭孢吡肟、頭孢他啶等醫(yī)院臨床使用的一線抗感染藥物，因此推測(cè)其耐藥性的出現(xiàn)與全球范圍內(nèi)醫(yī)院中多重耐藥銅綠假單胞菌菌株的暴發(fā)流行有關(guān)。氨芐西林、卡那霉素、萘啶酸是養(yǎng)殖場(chǎng)常用的抗菌藥，但銅綠假單胞菌對(duì)其100%耐藥，發(fā)生銅綠假單胞菌感染后往往治療效果不佳。銅綠假單胞菌對(duì)復(fù)方新諾明、四環(huán)素、氯霉素三者的耐藥率也很高。因此養(yǎng)殖場(chǎng)要開展藥物敏感試驗(yàn)，根據(jù)藥敏結(jié)果選擇敏感的藥物，且應(yīng)注意交替用藥，以防產(chǎn)生耐藥性。值得注意的是，銅綠假單胞菌分離株對(duì)國家禁用的獸藥(四環(huán)素、氯霉素)表現(xiàn)出高耐藥率，一方面可能是早期使用所致；另一方面可能是醫(yī)院中銅綠假單胞菌泛耐藥株的全球流行傳播導(dǎo)致的，因?yàn)樗沫h(huán)素和氯霉素在醫(yī)院臨床抗感染治療中并沒有被禁用。另外，本研究耐藥譜分析顯示最廣耐15種抗菌藥，除天然耐藥外，耐3類或3類以上抗菌藥物的銅綠假單胞菌占比為73.1%（106/145），提示本研究采樣的七彩山雞養(yǎng)殖場(chǎng)中銅綠假單胞菌分離株的耐藥情況同樣不容樂觀；因此在使用抗菌藥時(shí)，除了要根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果合理運(yùn)用外，還應(yīng)盡量避免長期依賴使用同一種或幾種抗菌藥物，積極探討抗菌藥的組合應(yīng)用，并開展新的抗感染藥物的研發(fā)。

MLST分析是通過直接測(cè)定菌株的多個(gè)管家基因的核苷酸序列來分型的分子分型方法，常常用于細(xì)菌的群體遺傳演化分析，這種基于遺傳學(xué)功能的分型比傳統(tǒng)的免疫學(xué)試驗(yàn)更加準(zhǔn)確可靠。本研究對(duì)89株耐藥譜較廣的銅綠假單胞菌分離株進(jìn)行了MLST分析，這些菌株可分為18個(gè)ST型，以ST-260占比最多，這與全球范圍醫(yī)院流行的ST型有所差異[26-28]，但也在情理之中，可能是種屬差異導(dǎo)致流行特點(diǎn)有所區(qū)別。其中有6個(gè)ST型是本研究新發(fā)現(xiàn)的，提示銅綠假單胞菌的進(jìn)化速度較快。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)來自飲水(ST-3201)和死胚(ST-3199)、孵化機(jī)污垢(ST-3202)和死胚(ST-1971)的銅綠假單胞菌表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系。這進(jìn)一步證實(shí)了我們的推斷，即周邊環(huán)境尤其是孵化機(jī)被銅綠假單胞菌污染對(duì)孵化率降低有一定的威脅。

3.2 結(jié)論

本研究調(diào)查的3個(gè)七彩山雞養(yǎng)殖場(chǎng)中，不僅死胚中存在不同程度的銅綠假單胞菌感染，而且周圍環(huán)境也存在相當(dāng)比例的銅綠假單胞菌污染，且分離株具有較強(qiáng)的耐藥性。銅綠假單胞菌死胚分離株的優(yōu)勢(shì)ST型為ST-260，環(huán)境分離株以ST-2100和ST-3202為主，且兩者表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系。因此建議做好生物安全措施，及時(shí)對(duì)種蛋、孵化機(jī)及周邊環(huán)境進(jìn)行清潔和消毒，并根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇有效的抗菌藥并交替使用。