高波波，唐曉雅，李艷燕，蘇旋，郭艮艮

(空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，陜西 西安 710038)

肺癌在全球惡性腫瘤中患病率、死亡率位居首位，據(jù)報(bào)道，全球每年肺癌新增病例超過180萬，以男性患者居多，5年生存率約為16.1%，預(yù)后不理想[1-2]。目前，手術(shù)切除、靶向治療、放療、化療等在肺癌治療中均有應(yīng)用，具有一定效果，但腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)仍較高，對預(yù)后影響非常大[3-4]。因此，臨床必須進(jìn)一步掌握肺癌的發(fā)病、進(jìn)展機(jī)制，尋求新的抗癌思路，為改善預(yù)后提供依據(jù)。近年來，醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)在肺癌進(jìn)展過程中存在多種基因改變，其參與了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，分析這些基因作用機(jī)制可能對制定針對性治療方案有幫助[5-6]。研究表明，半乳糖凝集素1(galectin-1，Gal-1)是半乳凝素家族的一員，它能與β-半乳糖苷相結(jié)合，參與細(xì)胞增殖、凋亡、新生血管形成等過程[7]。Chetry等[8]發(fā)現(xiàn)，Gal-1參與了宮頸癌的進(jìn)展，與該病的惡性程度以及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。另有研究提示，Gal-1基因沉默會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的遷移、凋亡能力，在肝細(xì)胞癌進(jìn)展過程中發(fā)揮了重要作用[9]。現(xiàn)階段臨床尚未知曉Gal-1是否參與了肺癌的進(jìn)展，關(guān)于其在肺癌中的作用機(jī)制也尚不明確。基于上述背景，本研究納入130例肺癌患者為研究對象，分析Gal-1表達(dá)與肺癌病理特征、預(yù)后的關(guān)系，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2018年1月至2020年1月收治的130例肺癌患者進(jìn)行研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：行手術(shù)治療，經(jīng)病理診斷證實(shí)為肺癌，年齡≥18歲者；能獲取癌組織以及癌旁組織者；臨床病理資料完整者；術(shù)前未采用新輔助治療者；認(rèn)知功能正常者；對研究內(nèi)容知情同意者。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有其他部位的原發(fā)性腫瘤者；既往有肺部手術(shù)史者；患血液系統(tǒng)疾病、傳染性疾病者；患其他危及生命的疾病，如心、腦等重要臟器損害者。研究方案獲本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 Gal- 1表達(dá)水平檢測

采用免疫組化法檢測癌組織、癌旁組織中Gal-1表達(dá)水平。獲取組織后經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切片(厚4 μm)，在60 ℃下烤片30 min。將切片放置在松節(jié)油Ⅰ、Ⅱ內(nèi)分別浸泡10 min；分別置于95%、80%、75%乙醇內(nèi)浸泡5 min；放置在蒸餾水Ⅰ、Ⅱ內(nèi)分別浸泡5 min；室溫下反應(yīng)30 min，經(jīng)蒸餾水進(jìn)行2次清洗，5 min·次-1；取切片置于切片架，放置微波盒內(nèi)加熱至沸騰；將微波盒取出，冷卻至室溫，再次加熱到沸騰，將玻片取出；蒸餾水清洗2次，5 min·次-1；PBS液清洗2次，5 min·次-1；加入10%山羊血清封閉液50 μl，在37 ℃下反應(yīng)30 min；棄血清，加入一抗50 μl，37 ℃下反應(yīng)30 min，在4 ℃下過夜；PBS液清洗2次，5 min·次-1；加入辣根過氧化酶標(biāo)記鏈親和素50 μl，37 ℃下反應(yīng)30 min；PBS液清洗2次，5 min·次-1；經(jīng)DAB顯色3～5 min，觀察著色程度，自來水沖洗使染色終止；蒸餾水清洗5 min，行蘇木素復(fù)染，自來水清洗2 min；蒸餾水清洗5 min，利用1%鹽酸分化1～2 s，自來水清洗2 min；蒸餾水清洗5 min，封片。

1.3 免疫組化結(jié)果判定

判定標(biāo)準(zhǔn)[10]：Gal-1主要在細(xì)胞漿中表達(dá)，若胞漿中呈棕黃色染色，則提示為陽性，經(jīng)光鏡對切片進(jìn)行觀察，利用高倍鏡(×400)隨機(jī)選擇5個(gè)視野，分析染色強(qiáng)度、陽性細(xì)胞占比。以陽性細(xì)胞占比進(jìn)行評分：陽性細(xì)胞占比≤20%、21%～75%、76%～90%、>90%分別計(jì)0、1、2、3分；染色程度計(jì)分：無染色、淡黃色、中度黃色、棕黃色分別計(jì)0、1、2、3分。兩項(xiàng)分值乘積即為表達(dá)分值，分值≤4分為陰性，>4分為陽性。

1.4 隨訪分析

以患者術(shù)后第1天作為起始日，隨訪期為術(shù)后12個(gè)月。在患者出院后通過電話、微信等方式進(jìn)行隨訪，記錄生存情況，每3個(gè)月進(jìn)行1次隨訪，本次研究無失訪病例。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

經(jīng)SPSS 20.0軟件行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用百分比表示，組間比較行配對χ2檢驗(yàn)。利用Cox多元回歸模型分析肺癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，采用log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存率分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者基線資料分析

在130例患者中，男71例，女59例，年齡(40～74)歲，平均(60.39±12.45)歲；吸煙史：有38例，無92例；飲酒史：有34例，無96例；臨床分期：Ⅰ期32例，Ⅱ期51例，Ⅲ期47例；組織學(xué)分型：腺癌61例，鱗癌42例，大細(xì)胞癌27例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有49例，無81例；分化程度：低/中分化68例，高分化62例；腫瘤最大徑1～6 cm，平均(3.11±1.35)cm；胸膜浸潤：有31例，無99例；脈管侵犯：有35例，無95例。

2.2 肺癌組織、癌旁組織中Gal- 1表達(dá)比較

肺癌組織中Gal-1陽性表達(dá)率為48.46%(63/130)，高于癌旁組織的15.38%(20/130)(χ2=32.723，P<0.05)。Gal-1在肺癌組織中陽性表達(dá)較明顯，細(xì)胞著色以黃色、棕黃色為主，而癌旁組織中無明顯著色，或著色強(qiáng)度不深，見圖1。

圖1 肺癌組織、癌旁組織中Gal-1表達(dá)的免疫組化染色圖 ×400

2.3 肺癌組織中Gal- 1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

Gal-1陽性組臨床分期Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯占比高于Gal-1陰性組(P<0.05)，見表1。

2.4 影響肺癌患者預(yù)后的Cox多因素分析

以表1中相關(guān)變量為自變量X，以預(yù)后(總生存期、無瘤生存期)為因變量Y(生存=0，死亡=1；無瘤生存=0，帶瘤生存=1)進(jìn)行Cox回歸分析，結(jié)果顯示，年齡≥60歲、臨床分期Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胸膜浸潤、脈管侵犯、Gal-1陽性表達(dá)是影響患者總生存期、無瘤生存期的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表2、3。

表1 肺癌組織中Gal-1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 例

表2 Gal-1表達(dá)與總生存期的關(guān)系

2.5 肺癌組織中Gal- 1表達(dá)對患者術(shù)后預(yù)后的評估分析

Gal-1陽性組術(shù)后12個(gè)月的總生存率為66.67%(42/63)，無瘤生存率為63.49%(40/63)。Gal-1陰性組術(shù)后12個(gè)月的總生存率為88.06%(59/67)，無瘤生存率為83.58%(56/67)。Gal-1陽性組術(shù)后12個(gè)月的總生存率、無瘤生存率低于Gal-1陰性組(log-rankχ2=8.574、6.785，均P<0.05)。見圖2、3。

圖2 肺癌患者術(shù)后12個(gè)月的累積生存曲線

3 討 論

肺癌是發(fā)病率、死亡率最高的一種惡性腫瘤，既往常通過TNM分期對患者預(yù)后進(jìn)行預(yù)判，但存在較多局限，無法精準(zhǔn)反映預(yù)后情況，即便是臨床分期為Ⅰ期的患者，經(jīng)手術(shù)以及輔助治療后，仍存在復(fù)發(fā)、病灶轉(zhuǎn)移的可能性，導(dǎo)致預(yù)后欠佳[11-12]。腫瘤侵襲、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移機(jī)制非常復(fù)雜，涉及一系列多因素、多步驟的作用過程，該過程涉及較多的蛋白分子參與[13]。臨床可以考慮從關(guān)鍵蛋白分子入手，進(jìn)一步了解肺癌的進(jìn)展機(jī)制。研究表明半乳凝素家族由親和力較高的動(dòng)物凝集素蛋白組成，生物功能多樣，在細(xì)胞分化、生長、黏附以及RNA轉(zhuǎn)運(yùn)過程中有重要作用，在癌癥組織中存在表達(dá)[14]。Gal-1是半乳凝素家族的成員之一，它參與了細(xì)胞之間的相互作用，將細(xì)胞凋亡途徑阻斷[15-16]。褚靜等[17]發(fā)現(xiàn)，Gal-1蛋白與神經(jīng)母細(xì)胞瘤的惡化過程密切相關(guān)，Gal-1沉默基因能對腫瘤細(xì)胞遷移、增殖進(jìn)行抑制。本研究分析Gal-1是否參與了肺癌進(jìn)展，以便尋求新的治療靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示肺癌組織中Gal-1陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織。Gal-1具有調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)炎癥、抗黏附或促進(jìn)黏附等作用，其在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，例如乳腺癌、甲狀腺癌等[18-19]。Gal-1促進(jìn)腫瘤發(fā)生、進(jìn)展的機(jī)制比較復(fù)雜，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Gal-1可與癌基因H-Ras產(chǎn)生作用，使其信號介導(dǎo)過程增強(qiáng)，促使細(xì)胞轉(zhuǎn)化成腫瘤細(xì)胞表型，它還能促進(jìn)ERK、RAF1信號通路持續(xù)活化，將轉(zhuǎn)錄因子激活，誘導(dǎo)基因出現(xiàn)異常表達(dá)，致細(xì)胞轉(zhuǎn)化成腫瘤細(xì)胞[20-21]。另有研究指出Gal-1對新生血管生成有重要作用，當(dāng)其表達(dá)水平降低時(shí)能抑制腫瘤生長[22]。這提示Gal-1在腫瘤疾病中發(fā)揮了促癌作用，可致病情惡化。本研究提示Gal-1陽性表達(dá)可能與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯有關(guān)。張凱戀等[23]認(rèn)為腫瘤新生血管生成是促進(jìn)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移與進(jìn)展的基礎(chǔ)條件。腫瘤分期越高以及伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者新生血管生成越明顯，Gal-1則具有促進(jìn)新生血管生成的作用，可通過該機(jī)制增加腫瘤進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)，此外，Gal-1還可將T細(xì)胞應(yīng)答作用削弱，使腫瘤細(xì)胞逃逸，促進(jìn)腫瘤侵襲、復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。伴有脈管侵犯表明腫瘤已生長到一定程度，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移征兆，這類患者通常臨床分期較高，有新生血管生成。Gal-1對β半乳糖存在高度親合性，能對細(xì)胞信號傳導(dǎo)、細(xì)胞生存進(jìn)行調(diào)節(jié)，在細(xì)胞與基質(zhì)、細(xì)胞與細(xì)胞之間發(fā)揮黏附作用，參與腫瘤細(xì)胞的黏附、浸潤、侵襲，增加脈管侵犯風(fēng)險(xiǎn)[24]。本研究證實(shí)Gal-1陽性表達(dá)是肺癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素，且肺癌組織中Gal-1表達(dá)對患者的總生存率、無瘤生存率具有一定評估價(jià)值。一方面，Gal-1可能通過與癌基因H-Ras產(chǎn)生協(xié)同作用，誘導(dǎo)Gal-1基因表達(dá)異常，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲，另一方面，Gal-1可能通過促進(jìn)新生血管生成，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。這兩者可能是Gal-1作用于肺癌的重要機(jī)制，也是影響預(yù)后的關(guān)鍵因素。吳銀霞等[25]以膀胱癌患者為研究對象，發(fā)現(xiàn)Gal-1在癌組織中呈高表達(dá)，且能促進(jìn)癌癥浸潤轉(zhuǎn)移與進(jìn)展。鑒于Gal-1在肺癌進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用，臨床可考慮將下調(diào)Gal-1表達(dá)作為日后肺癌治療的新靶點(diǎn)。

表3 Gal-1表達(dá)與無瘤生存期的關(guān)系

圖3 肺癌患者術(shù)后12個(gè)月的無瘤生存曲線

綜上所述，Gal-1在肺癌患者癌組織中陽性表達(dá)率較高，其陽性表達(dá)可能與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯存在關(guān)聯(lián)，且是肺癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，臨床需引起重視。本研究局限性為受研究時(shí)間限制隨訪時(shí)間較短，且關(guān)于Gal-1在肺癌中作用機(jī)制的探討還處于初步探索階段，未來還需延長隨訪時(shí)間進(jìn)行更深入分析。