陳孝衛(wèi)，黃武強，蔡道修

(海南省第二人民醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，海南 五指山 572299)

肝癌在50～60歲人群中較常見，以男性居多，轉(zhuǎn)移風(fēng)險高，預(yù)后較差，從病理類型上看，肝細胞癌占比超過80%。肝癌早期缺乏特異性癥狀，當(dāng)出現(xiàn)明顯癥狀就診時，大多已進入中、晚期，錯過最佳治療時機，導(dǎo)致預(yù)后差，盡早診療是改善預(yù)后的關(guān)鍵[1]。既往臨床通過病理活檢對肝癌進行診斷，檢出效果較好，但該方式屬于有創(chuàng)操作，可能造成肝癌結(jié)節(jié)破裂，或誘發(fā)大出血，嚴重時危及生命[2]。B超、CT等雖然有一定診斷價值，但也存在缺陷，例如B超受操作者水平影響較大，CT對彌散性病灶的檢出效果欠佳[3]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)與腫瘤發(fā)生有關(guān)，它具有促癌或抑癌作用，部分miRNAs能對靶基因表達進行抑制，促進細胞增殖，而部分miRNAs則能下調(diào)癌基因表達，阻止細胞惡變[4]。臨床可考慮從這方面入手，尋求可靠指標(biāo)提高肝癌診療水平，改善預(yù)后。有學(xué)者指出miR-1246在腫瘤中發(fā)揮了重要作用，它能促進食管癌轉(zhuǎn)移[5]。另有研究認為miR-1246參與了宮頸鱗癌進展，對該病早期診斷有一定價值[6]。這表明miR-1246可能對腫瘤評估有一定作用，但現(xiàn)階段關(guān)于其對肝癌預(yù)后的影響尚未明確。還有研究發(fā)現(xiàn)核因子I/B(nuclear factor I/B，NFIB)轉(zhuǎn)錄因子家族在腫瘤細胞增殖、凋亡過程中具有調(diào)節(jié)作用[7]。而目前關(guān)于NFIB與肝癌的關(guān)系也并未明確，基于上述背景，本研究納入160例肝癌患者進行分析，觀察miR-1246、NFIB在肝癌組織中的表達及其與肝癌預(yù)后的關(guān)系，為改善預(yù)后提供思路，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入我院2017年3月至2019年3月收治的肝癌患者160例，均獲得癌組織及癌旁組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)手術(shù)病理證實為肝癌，年齡≥18歲；首次診斷者，肝癌病理類型明確；入院后完善相關(guān)肝功能、實驗室檢查；遵循自愿原則，知曉研究內(nèi)容，簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：患其他原發(fā)性腫瘤者；術(shù)前有新輔助治療史者；患其他危及生命的疾病如嚴重心血管、腦血管疾病者；既往有肝部手術(shù)史者；患自身免疫性疾病者；凝血功能異常者。其中男89例，女71例，年齡43～72歲，平均(55.92±12.65)歲。臨床分期：Ⅰ期32例，Ⅱ期57例，Ⅲ期71例；飲酒史：有43例，無117例；肝硬化：有36例，無124例；Child-Pugh分級：A級74例，B級86例；腫瘤直徑：<5 cm 97例，≥5 cm 63例；腫瘤數(shù)目：多發(fā)28例，單發(fā)132例；慢性肝炎病史：有128例，無32例。研究方案獲本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 檢測方法

1.2.1 肝功能指標(biāo)檢測 采集3 ml空腹肘靜脈血，以3 000 r·min-1離心10 min，離心半徑10 cm，取血清-80 ℃保存待測。采用山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司生產(chǎn)的BK-400型全自動生化分析儀測定血清白蛋白(albumin，ALB)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)及天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)水平。

1.2.2 NFIB檢測 采用免疫組化法檢測，主要試劑為NFIB檢測試劑、抗原修復(fù)液、DAB顯色試劑，購于賽默飛世爾科技有限公司。主要儀器為FPMIC-volcano石蠟包埋機(輔光精密儀器有限公司)、XSP-63A熒光顯微鏡(上海光學(xué)儀器一廠)、HHQ組織切片機(杭州艾普儀器設(shè)備有限公司)、賽默飛F3系列微量移液器(賽默飛世爾科技有限公司)，免疫組化方法參考說明書。結(jié)果判定[8]：所有患者均由相同病理專家切片，若胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色、棕黃色或棕褐色，則提示為陽性，每個切片經(jīng)高倍鏡(×400)取10個視野進行觀察。染色程度分值評估：無著色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別計0、1、2、3分；陽性細胞占比分值評估：<5%、5%～25%、26%～50%、51%～74%、≥75%分別計0、1、2、3、4分。兩種評分乘積為最后分值，<1分為陰性，1～2分弱陽性，3～4分中度陽性，>4分強陽性，陰性、弱陽性即低表達，中度陽性、強陽性即高表達。

1.2.3 miR-1246檢測 采用實時逆轉(zhuǎn)錄熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)測定miR-1246。主要試劑為蒸餾水、異丙醇、miR-1246檢測試劑、氯仿、總RNA提取試劑，購自賽默飛世爾科技有限公司，主要儀器為Lepgen型PCR儀(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)、DDL-8R型高速離心機(愛來寶醫(yī)療科技有限公司)、Research plus型微量移液器(德國艾本德股份公司)。根據(jù)Trizol法對總RNA進行提取，并測定其純度、濃度，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，行PCR檢測，引物序列如下：(1)miR-1246上游、下游序列分別為5′-TCCCAATGGTTTTTGGAGCAGGTCAAGAGCCTGCTCCAAAAACCATTTTT-3′、5′-CAAAAAAAATGGTTTTTGGAGCAGGCTCTTGACCTGCTCCAAAAACCATTT-3′；(2)內(nèi)參引物U6上游、下游序列分別為5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′、5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性60 s，95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，70 ℃延伸10 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCT表示miR-1246表達量。

1.3 亞分組方法

以肝癌患者癌組織中miR-1246表達量均值為界，將其分成高表達組(miR-1246≥均值)和低表達組(miR-1246<均值)；根據(jù)NFIB表達強度分成高表達組與低表達組，分析二者與病理特征的關(guān)系。

1.4 隨訪分析

以患者術(shù)后隨訪24個月為隨訪截止時間，在患者出院后通過電話、微信等方式隨訪，記錄累積生存率，將生存者納入生存組，死亡者納入死亡組。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS20.0軟件行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料用百分比(%)表示，行χ2檢驗；計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較行獨立樣本t檢驗。采用Cox多元回歸模型分析預(yù)后的危險因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肝癌組織、癌旁組織中miR- 1246、NFIB表達比較

肝癌組織中miR-1246表達量為(61.24±9.96)，高于癌旁組織的(12.53±3.36)(t=58.616，P<0.05)。肝癌組織中NFIB高表達率為40.00%(64/160)，高于癌旁組織的8.13%(13/160)(χ2=44.483，P<0.05)。免疫組化結(jié)果見圖1。

A.肝癌組織；B.癌旁組織

2.2 肝癌患者miR- 1246表達與臨床病理特征的關(guān)系

miR-1246高表達組83例，低表達組77例。miR-1246高表達組臨床分期Ⅲ期、腫瘤直徑≥5 cm、多發(fā)性腫瘤占比分別為49.40%(41/83)、49.40%(41/83)、26.51%(22/83)，高于低表達組的38.96%(30/77)、28.57%(22/77)、7.79%(6/77)(P<0.05)，見表1。

表1 肝癌患者miR-1246表達與臨床病理特征的關(guān)系 例

2.3 肝癌患者NFIB表達與臨床病理特征的關(guān)系

NFIB高表達組臨床分期Ⅲ期、腫瘤直徑≥5 cm、多發(fā)性腫瘤、ALT>40 U·L-1占比分別為57.81%(37/64)、54.69%(35/64)、28.13%(18/64)、78.13%(50/64)，高于低表達組的35.42%(34/96)、29.17%(28/96)、10.42%(10/96)、56.25%(54/96)(P<0.05)，見表2。

表2 肝癌患者NFIB表達與臨床病理特征的關(guān)系 例

2.4 不同預(yù)后肝癌患者的miR- 1246、NFIB表達比較

生存組miR-1246、NFIB高表達率均低于死亡組(P<0.05)，見表3。

表3 不同預(yù)后肝癌患者的mi 1246、NFIB表達比較

2.5 肝癌患者預(yù)后的Cox單因素與多因素分析

以年齡(<60歲=0，≥60歲=1)、臨床分期(Ⅰ期=0，Ⅱ期=1，Ⅲ期=2)、肝硬化(無=0，有=1)、腫瘤直徑(<5 cm=0，≥5 cm=1)、腫瘤數(shù)目(單發(fā)=0，多發(fā)=1)、miR-1246表達(低表達=0，高表達=1)、NFIB表達(低表達=0，高表達=1)為自變量X，以預(yù)后為因變量Y(生存=0，死亡=1)，經(jīng)Cox多因素分析提示，臨床分期Ⅲ期、腫瘤直徑≥5 cm、多發(fā)性腫瘤以及miR-1246、NFIB高表達是預(yù)后危險因素(P<0.05)，見表4。

表4 肝癌患者預(yù)后的Cox單因素與多因素分析

3 討 論

肝癌多因慢性肝炎所致，主要為丙型肝炎、乙型肝炎，發(fā)病機制較復(fù)雜，還可能與過量飲酒、黃曲霉素等因素相關(guān)[9]。目前，臨床針對肝癌已有多種干預(yù)方式，例如根治性手術(shù)、靶向藥物、放療、化療等，然而5年生存率仍較低，即便患者早期行根治手術(shù)治療，5年生存率也不足80%，且部分患者術(shù)后甚至出現(xiàn)并發(fā)癥，影響手術(shù)療效[10]。因此，臨床須尋求一種有效的診療方法，為肝癌治療提供依據(jù)，使患者生存時間延長。舒耀等[11]發(fā)現(xiàn)miR-1246在乳腺癌中具有促癌基因作用，參與了乳腺癌發(fā)病、進展過程。Salah等[12]研究顯示，miR-1246參與了大腸癌的進展，對大腸癌診斷有一定價值。另有研究認為，NFIB與腫瘤發(fā)生也密切相關(guān)，它可能通過對乳腺癌患者雌激素反應(yīng)進行調(diào)節(jié)，促進乳腺癌進展[13]。上述研究提示，miRNA-1246、NFIB可能與腫瘤進展有關(guān)。本研究考慮從二者入手，進一步分析二者與肝癌之間的關(guān)系，為改善肝癌預(yù)后提供可靠依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，肝癌組織中miR-1246表達量、NFIB高表達率高于癌旁組織，提示二者可能與肝癌發(fā)生有關(guān)。miR-1246是微小分子RNA的一員，它在多種腫瘤中具有促癌作用，例如宮頸癌、乳腺癌等[14-15]。Bhagirath等[16]研究指出，miR-1246表達增高是侵襲性前列腺癌的標(biāo)志物，對前列腺癌進展有促進作用，且與患者臨床分級增高有關(guān)。由此可見，miR-1246在腫瘤疾病中存在異常表達。研究表明在細胞受損情況下，p53基因?qū)iR-1246表達存在誘導(dǎo)作用，能對細胞凋亡進行抑制，促進細胞增殖，導(dǎo)致腫瘤進展，這可能是miR-1246促癌作用的機制之一[17]。NFIB在細胞分化中有調(diào)節(jié)作用，它可通過基因融合參與惡性腫瘤發(fā)生，在肺癌中有致癌功能，機體的腫瘤環(huán)境可能導(dǎo)致NFIB所介導(dǎo)的癌癥侵襲性進展[18]。Becker-Santos等[19]對肺癌患者進行研究發(fā)現(xiàn)，NFIB參與了肺癌進展，能提高腫瘤侵襲性。研究表明沉默NFIB基因可抑制腫瘤細胞增殖，并激活細胞凋亡通路[20]。這提示NFIB表達降低可抑制腫瘤進展，進一步證實其參與了腫瘤發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，肝癌患者miR-1246、NFIB高表達均與臨床分期、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目存在關(guān)聯(lián)。臨床分期越高表明腫瘤惡性程度越高，腫瘤直徑越大則可能導(dǎo)致周圍組織受累程度更重，而多發(fā)性腫瘤也容易增加組織波及范圍，促進肝癌進展，在這過程中，miR-1246、NFIB高表達可能發(fā)揮了促癌基因作用，導(dǎo)致腫瘤惡性程度加重，或促進腫瘤細胞增殖，擴大受損范圍。本研究還發(fā)現(xiàn)NFIB高表達可能與ALT水平有關(guān)，這表明NFIB高表達可能加重肝癌患者的肝臟受損程度。

miR-1246、NFIB參與了肝癌進展，并且影響其預(yù)后。本研究結(jié)果顯示，生存組miR-1246、NFIB高表達率較死亡組降低，表明二者高表達會增加死亡風(fēng)險。miR-1246能通過與靶5′非翻譯區(qū)、3′非翻譯區(qū)結(jié)合，或者與編碼區(qū)結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因翻譯、轉(zhuǎn)錄水平，參與腫瘤細胞凋亡、分化等過程，從而參與腫瘤進展[21]。而NFIB則可能通過調(diào)節(jié)蛋白激酶B/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3軸參與腫瘤進展，對腫瘤預(yù)后也有較大影響[22]。二者在肝癌中均具有促癌作用，導(dǎo)致死亡風(fēng)險增高。本研究結(jié)果結(jié)果還顯示，miR-1246、NFIB高表達是預(yù)后危險因素，進一步證實二者與患者預(yù)后密切相關(guān)。既往有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-1246表達上調(diào)能增加腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)風(fēng)險[23]。這表明miR-1246可能通過促進腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)影響預(yù)后，本研究與之一致。NFIB也可通過發(fā)揮促癌作用導(dǎo)致肝癌進展，增加預(yù)后不良風(fēng)險。二者可能相互作用，共同影響肝癌患者病情與預(yù)后。本研究提示肝癌預(yù)后還與年齡、臨床分期、肝硬化、腫瘤直徑以及腫瘤數(shù)目有關(guān)，與既往結(jié)論[24-25]吻合。在日后的肝癌治療中，臨床可將miR-1246、NFIB作為新的治療靶點，通過下調(diào)二者水平改善肝癌預(yù)后。

綜上所述，肝癌組織中miR-1246表達量明顯增高，且NFIB高表達率高于癌旁組織，二者均為患者預(yù)后的影響因素。本研究局限性為隨訪時間較短，未分析miR-1246、NFIB對肝癌遠期預(yù)后的影響，未來還需延長隨訪時間予以探討。