范佳英，朱雪萍

(蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 新生兒科，江蘇 蘇州 215025)

骨硬化癥(osteopetrosis)是一種極為罕見的、破骨細(xì)胞缺乏或功能缺陷導(dǎo)致骨吸收障礙的遺傳代謝性骨病，其特征是骨質(zhì)礦物質(zhì)密度增加，但由于破骨細(xì)胞功能缺陷，易發(fā)生骨裂[1-3]。根據(jù)遺傳類型可分為常染色體顯性遺傳骨硬化癥(autosomal dominant osteopetrosis，ADO)、常染色體隱性遺傳骨硬化癥(autosomal recessive osteopetrosis,ARO)和X連鎖骨硬化癥3種亞型。其中嬰兒ARO的平均發(fā)病率在1/200 000至1/300 000之間[4]，主要表現(xiàn)為幼年起病，伴有嚴(yán)重且惡性的臨床癥狀，臨床具體表現(xiàn)為貧血、血小板減少、巨腦畸形、喂養(yǎng)困難、骨密度增高，一旦出現(xiàn)嚴(yán)重感染病死率極高。由于該病發(fā)病的不典型性，目前對(duì)該病的確診主要依靠基因檢測(cè)，治療的主要手段為造血干細(xì)胞移植，但此方法仍需進(jìn)一步探索。現(xiàn)將2018年蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院新生兒科診治的1例ARO患兒的臨床資料報(bào)道如下。

1 病例資料

患兒男性，22日齡，因“發(fā)熱2 d伴發(fā)現(xiàn)皮膚出血點(diǎn)1 d”入院。患兒入我院3 d前納奶量減少，伴有哭鬧不安，測(cè)體溫(腋溫)37.6 ℃，至當(dāng)?shù)蒯t(yī)院住院治療，查血常規(guī)示白細(xì)胞28.6×109L-1、C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)66 mg·dl-1，明顯高于正常，血小板23×109L-1，診斷為“膿毒血癥、新生兒肺炎、血小板減少性紫癜、尿路感染、心肌損害”，予“美羅培南40 mg·kg-14次·d-1抗感染、丙種球蛋白2.5 g 2次”提升血小板。入我院1 d前患兒顏面部出現(xiàn)散在出血點(diǎn)，體溫仍有反復(fù)，陣發(fā)性哭鬧，遂轉(zhuǎn)診至我院NICU。

既往史：無(wú)特殊。喂養(yǎng)史：患兒生后24 h內(nèi)開奶，予母乳、普通足月配方奶混合喂養(yǎng)，奶量50～60 ml·次-1，8～10次·d-1，入我院3 d前患兒納奶量減少，30～40 ml·次-1，6次·d-1。

出生史：患兒系G2P2，孕39周，2018年10月22日03時(shí)30分自然分娩娩出，出生體重3 750 g，生后Apgar評(píng)分不詳，羊水性質(zhì)、量不詳，否認(rèn)臍帶繞頸，否認(rèn)胎膜早破及羊水、胎糞吸入史。

家族史：父母親均體健。本次妊娠為自然受孕，定期產(chǎn)檢，母孕期曾有貧血(80 g·L-1)，未予補(bǔ)充鐵劑，孕母無(wú)血小板減少病史；G1為2017年9月出生的哥哥，3月齡時(shí)因“血小板減少、肺炎、腦發(fā)育異常(具體不詳)”去世。

入院查體：體溫37.3 ℃，脈搏140次·min-1，呼吸46次·min-1，體重 4.09 kg，血氧飽和度 96%(未吸氧下)，身長(zhǎng)52 cm，頭圍37.9 cm，胸圍38 cm。神清，精神一般，刺激足底反應(yīng)可，顏面部可及散在瘀點(diǎn)，按壓不褪色，皮膚彈性可，稍干燥，前囟飽滿，張力不高，心肺無(wú)特殊，腹軟，肝脾肋下未及腫大，腸鳴音正常，四肢肌張力可，生理反射存在。

實(shí)驗(yàn)室檢查：入院時(shí)血常規(guī)：白細(xì)胞18.05×109L-1，嗜酸粒細(xì)胞6.8%，網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比1.93%，血紅蛋白115 g·L-1，血小板總數(shù)20×109L-1，中性粒細(xì)胞55.3%；超敏C反應(yīng)蛋白87.32 mg· L-1；凝血常規(guī)：D二聚體>20 000 μg· L-1，活化部分凝血活酶時(shí)間49.8 s；降鈣素原14.3 ng·ml-1；血清堿性磷酸酶518 U·L-1；自身抗體初篩：抗AMA-M2弱陽(yáng)性(+)、抗Ro-52陽(yáng)性(++)、抗SSA可疑(±)；其余檢查如肝腎功能、心肌三項(xiàng)等均未見異常。

影像學(xué)檢查：胸片、頭顱CT、MRI提示胸骨、顱骨骨質(zhì)密度增高(圖1)；頭顱CT示大腦半球腦白質(zhì)密度減低；頭顱MRI平掃示雙側(cè)顳葉及頂枕葉側(cè)腦室邊緣斑片狀T1高信號(hào)影，胼胝體菲薄，透明隔間隙稍寬；心臟彩超示卵圓孔未閉。

A、B分別為患兒胸片正側(cè)位，提示胸骨骨質(zhì)密度增高；C、D分別為頭顱CT、MRI，均提示顱骨骨質(zhì)密度增高

住院治療經(jīng)過(guò)及隨訪：患兒入院完善相關(guān)檢查，予心電監(jiān)護(hù)，美羅培南抗感染，卡絡(luò)磺鈉預(yù)防出血，入院查血小板總數(shù)20×109L-1，予濾白單采血小板1 U輸注1次后血小板總數(shù)上升至128×109L-1，隨后血小板波動(dòng)在(54～88)×109L-1。入院第2天呼吸較費(fèi)力，呼吸約60次·min-1，唇周稍有發(fā)紺，無(wú)發(fā)熱，脈氧及血?dú)夥治鑫匆娒黠@異常，予頭罩吸氧，并加用氟康唑預(yù)防真菌感染，3 d后氣急好轉(zhuǎn)，予停氧。結(jié)合病史及家族史，考慮基因病可能性大，完善基因檢查。住院第18天改用頭孢他啶抗感染。定期監(jiān)測(cè)血常規(guī)，期間血紅蛋白降至87 g·L-1，輸注懸浮少白紅細(xì)胞2次，血紅蛋白上升至140 g·L-1。住院治療第28天患兒出現(xiàn)腹瀉，并有發(fā)熱(熱峰39.2 ℃)，查輪狀病毒陽(yáng)性，予蒙脫石散口服，考慮感染反復(fù)，改用阿莫西林舒巴坦聯(lián)合氟康唑抗感染，3 d后體溫正常。住院第35天病情好轉(zhuǎn)，予出院，出院時(shí)血小板總數(shù)74×109L-1。出院第2天基因結(jié)果回報(bào)，并告知家長(zhǎng)。出院后電話隨訪，家屬訴患兒未定期至門診復(fù)查，出院半個(gè)月后精神一般，食納欠佳，無(wú)發(fā)熱，體重未見增長(zhǎng)，未積極就醫(yī)，于1個(gè)月后在家中去世。

分子遺傳學(xué)：患兒父母簽署知情同意書后，抽取患兒及其父母外周EDTA抗凝全血5 ml并提取基因組DNA，送至北京金準(zhǔn)基因科技有限責(zé)任公司進(jìn)行基因分析。經(jīng)全基因組外顯子測(cè)序(參考序列NM_001287.5)，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Sanger一代測(cè)序家系驗(yàn)證和qPCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)患兒CLCN7基因chr16:1506200存在c.824_830delTCTTCGA的雜合突變，同時(shí)該基因等位基因7-17 號(hào)外顯子存在重復(fù)變異(圖2)。

A．患兒以及患兒之父檢測(cè)到chr16:1506200存在c.824_830delTCTTCGA的雜合突變，患兒之母不攜帶該雜合突變；B.患兒檢測(cè)到CLCN7基因7-17外顯子區(qū)域重復(fù)雜合突變；C.患 兒及其母親均攜帶CLCN7基因大片段重復(fù)，患兒父親不攜帶該重復(fù)突變

患兒chr16:1506200處7個(gè)堿基缺失c.824_830delTCTTCGA導(dǎo)致移碼突變p.I275Sfs*47，屬于惡性截?cái)嘈屯蛔儯瑯O有可能影響蛋白功能(PVS1)；該突變?cè)谡Ｈ巳褐形匆姅y帶，也未曾被報(bào)道為致病突變(PM2)。根據(jù)ACMG評(píng)級(jí)規(guī)則，該突變被歸為疑似致病突變(likely pathogenic=PVS1+PM2)。同時(shí)，患兒7-17號(hào)外顯子存在重復(fù)變異，極有可能影響蛋白的空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響蛋白的功能。一代家系驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)患兒父親CLCN7基因存在雜合移碼突變c.824_830delTCTTCGA，即患兒的移碼突變遺傳自其父；患兒母親CLCN7基因存在雜合重復(fù)變異，即患兒片段重復(fù)變異源于其母。CLCN7基因報(bào)道為常染色體隱性遺傳或顯性遺傳，疾病遺傳方式與突變位點(diǎn)類型相關(guān)，表型略有不同且常染色體隱性遺傳患兒癥狀明顯嚴(yán)重?；純和瑫r(shí)遺傳了父母CLCN7基因的突變，且父母均未見疾病表型，符合常染色體隱性遺傳，結(jié)合患兒膿毒血癥、新生兒肺炎、血小板減少性紫癜、尿路感染、心肌損害、胸骨及顱骨骨質(zhì)密度增高且嬰兒期死亡等表型，確診患兒為惡性常染色體隱形遺傳骨硬化癥(ARO)。

2 討 論

ARO是嬰兒期常染色體隱性骨骼疾病。TCIRG1、CLCN7和OSTM1基因是ARO的3個(gè)主要致病基因[5-8]。ARO預(yù)后差，大部分患兒在10歲之前因嚴(yán)重的貧血、出血或感染而死亡[9-11]。

我們對(duì)1例表現(xiàn)為發(fā)熱、皮膚出血點(diǎn)的新生兒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查及致病基因突變檢測(cè)，結(jié)果顯示患兒血小板低，胸部X線片具有骨質(zhì)密度增高改變，患兒CLCN7基因攜帶新移碼突變復(fù)合雜合大片段重復(fù)突變，兩個(gè)突變分別遺傳自患兒父母，且患兒父母均無(wú)疾病表征。

CLCN7基因位于第16條染色體，可編碼長(zhǎng)803個(gè)氨基酸的多肽鏈。該蛋白從127號(hào)位氨基酸開始直到597號(hào)位氨基酸的區(qū)間一共形成15個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，這些跨膜螺旋共同組成了跨膜通道蛋白的功能性空間結(jié)構(gòu)。加工成熟后的氯離子通道蛋白作為破骨細(xì)胞皺褶膜上的質(zhì)子泵可將氫離子主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)至破骨細(xì)胞內(nèi)，提高胞內(nèi)pH，進(jìn)而降解破骨細(xì)胞吞飲的無(wú)機(jī)質(zhì)，使得無(wú)機(jī)鈣以離子的形式排入血液中，實(shí)現(xiàn)對(duì)骨形成以及骨質(zhì)吸收的調(diào)控[3]。因此，CLCN7基因發(fā)生突變的患者會(huì)減少破骨細(xì)胞性骨吸收，從而引發(fā)骨硬化癥?；純?條等位基因存在移碼突變c.824_830delTCTTCGA，導(dǎo)致氨基酸改變p.I275Sfs*47，即突變蛋白的多肽鏈僅前275位為正確的氨基酸序列，并在繼續(xù)表達(dá)47位混亂序列后終止。突變蛋白缺失了10個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，極有可能導(dǎo)致離子通道無(wú)法正確形成。另1條等位基因7-17外顯子區(qū)域存在重復(fù)變異，導(dǎo)致199號(hào)氨基酸到539號(hào)氨基酸區(qū)間發(fā)生重復(fù)，即重復(fù)了10個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，極可能使通道結(jié)構(gòu)變形，影響氫離子的轉(zhuǎn)運(yùn)。兩個(gè)突變均極有可能影響蛋白結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而影響破骨細(xì)胞對(duì)骨形成和吸收的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致骨硬化癥的發(fā)生。

CLCN7突變可以引起3種類型的骨硬化癥，包括常染色體隱性遺傳骨硬化癥ARO、中間型常染色體骨硬化癥(intermediate autosomal recessive osteopetrosis，IAO)和Ⅱ型常染色體顯性遺傳骨硬化癥(autosomal dominant osteopetrosis type Ⅱ，ADOⅡ)，其中ARO通常發(fā)病于嬰兒期，臨床表現(xiàn)包括貧血、血小板減少、巨腦畸形、喂養(yǎng)困難、骨密度增高，一旦出現(xiàn)嚴(yán)重感染病死率極高。本例患兒根據(jù)新生兒期血小板減少、X線表現(xiàn)為骨密度增高，且嬰兒期死亡，疾病癥狀嚴(yán)重等臨床特征亦判斷為ARO，進(jìn)一步證明了患兒所攜兩個(gè)新突變的致病性。

對(duì)本例患兒雙親CLCN7基因的檢測(cè)分析提示患兒父母均攜帶1個(gè)雜合的致病性突變，但兩人表型均完全正常，這一結(jié)果提示雖然一些CLCN7基因突變可導(dǎo)致常染色體顯性遺傳的疾病，然而本例患兒兩種新惡性致病突變均為常染色體隱性遺傳。CLCN7 基因突變可引起嬰兒惡性型、中間型、成人型骨硬化癥[12]。其中成人型是常染色體顯性遺傳，由雜合突變?cè)斐?，且通過(guò)對(duì)HGMD已記載致病突變的統(tǒng)計(jì)，我們發(fā)現(xiàn)惡行截?cái)嘈屯蛔冋紜雰盒猿Ｈ旧w隱性遺傳骨硬化癥的60%，占中間型常染色體隱性遺傳的20.6%，卻僅占導(dǎo)致成人型常染色體顯性遺傳骨硬化癥突變的12.5%。這可能是由于截?cái)嘈蛺盒型蛔儗?duì)突變蛋白功能影響較大，導(dǎo)致純合或復(fù)合雜合的患兒癥狀嚴(yán)重，而雜合攜帶者由于突變的等位基因無(wú)法表達(dá)功能性蛋白，突變蛋白在生成后大多被降解，刺激了正常等位基因的表達(dá)，使得體內(nèi)正常的功能性蛋白維持在相當(dāng)?shù)乃?；相反，普通錯(cuò)義突變雖然也影響了蛋白的功能，但是由于其整體結(jié)構(gòu)改變不大，沒(méi)有迅速被細(xì)胞自檢機(jī)制清除，反而導(dǎo)致機(jī)體單倍體計(jì)量不足，表現(xiàn)部分骨硬化疾病表型。此外，某些修飾基因、表觀遺傳學(xué)修飾等因素也能使骨硬化癥的表現(xiàn)型加重或減輕。

目前造血干細(xì)胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)是治療骨硬化癥的唯一有效措施[13]。Driessen 等[14]對(duì)122例HSCT治療的ARO患兒進(jìn)行長(zhǎng)期跟蹤隨訪，發(fā)現(xiàn)HLA相合患兒5年生存率可達(dá)73%。Orchard等[15]總結(jié)了1990—2011年65個(gè)移植中心193例嬰幼兒骨硬化癥患兒HSCT治療情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HLA相合患兒相較于其他供體移植的長(zhǎng)期存活率更高，5年和10年生存率均為 62%。但并非所有骨硬化癥患兒接受HSCT治療后均能獲得較好的療效,大多數(shù)未經(jīng)治療ARO患兒將于10歲內(nèi)死亡[16]。本例患兒亦未積極治療，嬰兒期死亡。

作者報(bào)道了1例復(fù)合雜合性突變導(dǎo)致ARO的案例，這種類型的病例在國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道[17-20]，但患兒兩條等位基因所攜突變均為新致病突變。隨著基因診斷的深入發(fā)展，新生兒疾病的早期診斷可以比較容易實(shí)現(xiàn)。新生兒疾病的形成是一個(gè)復(fù)雜的病理變化，因此其預(yù)后也會(huì)由這些變化的進(jìn)展而決定。應(yīng)綜合評(píng)估患兒的一般情況，必要時(shí)積極完善基因檢查，以早期明確診斷、早期治療。