張浩東，趙清梅，薛佳祺，于 鯤，崔省委，余永濤

（1.寧夏大學 農(nóng)學院，寧夏 銀川 750021；2.北方民族大學 生物科學與工程學院，寧夏 銀川 750021；3.國家民委發(fā)酵釀造工程生物技術重點實驗室，寧夏 銀川 750021）

絲狀真菌統(tǒng)稱為霉菌，多為真菌界子囊菌門子囊菌亞門真菌[1]，是以腐生或寄生的形式普遍存在于自然環(huán)境中的低等真核生物，廣泛分布在空氣、土壤、水和動植物中。絲狀真菌具有來源廣泛、易于工業(yè)化生產(chǎn)、種類豐富以及功能多樣等特點，因此被廣泛應用于科研和生產(chǎn)[2]。在醫(yī)療衛(wèi)生領域，利用產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum）合成青霉素[3]，利用土曲霉（Aspergillus terreus）合成降血脂藥物洛伐他汀等[4]。在食品加工行業(yè)，常利用絲狀真菌制作糕點、豆制品等[5]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，條形柄銹菌（Puccinia striiformis）、玉米大斑菌（Setosphaeria turcica）等絲狀真菌會引起小麥、玉米等農(nóng)作物發(fā)生病害[6-7]。部分植物的內(nèi)生真菌會對人體及動物產(chǎn)生嚴重危害[8-9]。綜上所述，絲狀真菌與人和動物健康、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、社會經(jīng)濟發(fā)展關系緊密，絲狀真菌的合理利用具有重要的社會經(jīng)濟價值。

絲狀真菌的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是絲狀真菌及其開發(fā)利用研究的熱點。在絲狀真菌的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中，作為順式作用元件的啟動子發(fā)揮著重要作用。啟動子參與基因轉(zhuǎn)錄的起始，通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合來調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄活性。深入了解啟動子不僅能夠拓展啟動子的應用，還有助于絲狀真菌基因表達調(diào)控機制及基因轉(zhuǎn)錄相關網(wǎng)絡調(diào)控研究[1]。岑由飛等[10]對Tri5和Ttri2啟動子功能進行研究，為Paramyrothecium roridum中單端孢霉烯毒素生物合成基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究奠定了基礎；王小龍等[11]對畢赤酵母AOX1啟動子進行研究，初步提出Paox1在葡萄糖、甘油和甲醇的調(diào)控模型，為畢赤酵母AOX1啟動子的開發(fā)利用提供了參考。絲狀真菌啟動子被廣泛應用于基因工程載體構建、轉(zhuǎn)基因以及目的基因表達等方面[12]。本文對絲狀真菌啟動子分類、預測、篩選方法及功能研究進行綜述，以期為絲狀真菌啟動子以及基因表達調(diào)控研究提供參考。

1 絲狀真菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控啟動子的分類

1.1 Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類啟動子

1.1.1 I類啟動子I類啟動子，又稱rRNA基因啟動子，可結(jié)合RNA聚合酶Ⅰ，參與rRNA前體基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，其產(chǎn)物會被加工成成熟的5.8S rRNA、18S rRNA、28S rRNA[13]。Ⅰ類啟動子的結(jié)構主要包括位于轉(zhuǎn)錄起始位點-45 bp至20 bp的核心啟動子元件和位于轉(zhuǎn)錄起始位點-156 bp至-107 bp的上游調(diào)控元件，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，但該類啟動子保守性相對較差[14]。I類啟動子具有種屬差異性和高轉(zhuǎn)錄活性，常被應于構建病毒表達載體[15]。

1.1.2 Ⅱ類啟動子Ⅱ類啟動子結(jié)合RNA聚合酶Ⅱ，主要參與sn RNA和編碼蛋白質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄起始。該類啟動子結(jié)構較為復雜，主要由基因近側(cè)啟動子和位于轉(zhuǎn)錄起始位點-200 bp內(nèi)的核心啟動子組成[16]。核心啟動子的結(jié)構與功能多種多樣，含有不同的序列基序組成的保守元件，如TFⅡB識別元件、TATA box、CAAT box、起始子（Inr）、下游啟動子元件（DPE）等（表1）[17-21]。Ⅱ類啟動子的核心啟動子是調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的核心元件，在基因表達調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[18]。

表1 核心啟動子元件組成及功能

1.1.3 Ⅲ類啟動子Ⅲ類啟動子結(jié)合RNA聚合酶Ⅲ，主要參與tRNA、ssRNA、snRNA和某些小分子RNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[22]。Ⅲ類啟動子可分為基因內(nèi)啟動子和基因外啟動子，基因內(nèi)啟動子又分為Ⅰ型內(nèi)部啟動子和Ⅱ型內(nèi)部啟動子。Ⅰ型內(nèi)部啟動子含有分開的box A（序列為RGYNNRRYGG）和box C（序列為CGGTCGANNCC），Ⅰ型內(nèi)部啟動子僅存在于5S rRNA的基因中[23]。Ⅱ型內(nèi)部啟動子含有分開的box A和box B（序列為GA/TTCRANNC），tRNA啟動子為Ⅱ型內(nèi)部啟動子?；蛲鈫幼游挥谵D(zhuǎn)錄起始位點上游，含有3個上游元件，分別為TATA box、近次端序列元件（PSE）、八聚體OTC元件，目前僅在snRNA啟動子中發(fā)現(xiàn)了基因外啟動子[23]。

1.2 強啟動子和弱啟動子

根據(jù)啟動子的轉(zhuǎn)錄活性將其分為強啟動子和弱啟動子。有研究表明，里氏木霉能高效生產(chǎn)大量的纖維素酶[24]，是因為其啟動子與RNA聚合酶有較強的結(jié)合能力，能促進纖維素酶的高效表達。曲霉中也存在許多強啟動子，如磷酸丙糖異構酶PtpiA啟動子、乙醛脫氫酶PadhA啟動子以及淀粉糖化酶PglaA啟動子等[25]，上述啟動子常用于提高目的蛋白的表達效率。弱啟動子轉(zhuǎn)錄起始能力相對較低，與RNA聚合酶結(jié)合能力較弱[26]。

1.3 組成型啟動子和誘導型啟動子

能使基因持續(xù)表達的啟動子叫做組成型啟動子，在基因表達調(diào)控中該類啟動子可使目的產(chǎn)物穩(wěn)定表達，不易受外界環(huán)境因素影響[27]。在絲狀真菌中存在許多組成型啟動子，如構巢曲霉中的GpdA基因啟動子[28]、綠僵菌中PMagpd啟動子、木霉屬Pki1啟動子等均為組成型啟動子[1]。絲狀真菌組成型啟動子在基因工程中常用于異源基因的表達[29]。

能被誘導表達的啟動子叫做誘導型啟動子，該類啟動子在基因表達調(diào)控中會受到外界刺激或誘導因素的影響[27]。當特定刺激或誘導因素存在時，誘導型啟動子會使其對應基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生顯著變化，這些刺激或誘導因素包括碳源、環(huán)境因素、化學信號和其他因素[30]。研究者在絲狀真菌中也挖掘出許多誘導型啟動子，如曲霉屬的GlaA啟動子、里氏木霉中Cbh1啟動子、纖維二糖水解酶Cel7A啟動子、橡膠樹白粉病Wy195啟動子[31]、構巢曲霉中AlcA啟動子[1]等。目前，人們利用AlcA啟動子已成功表達了多種異源基因蛋白[29]。

2 啟動子的預測

啟動子的預測主要是利用啟動子數(shù)據(jù)庫對某段序列進行對比和分析，從而判斷該序列是否存在啟動子并分析啟動子的各種結(jié)構。啟動子因組成結(jié)構和功能復雜，需要利用數(shù)據(jù)庫或軟件對其進行生物學信息分析。

在研究啟動子的結(jié)構和功能前，首先要根據(jù)啟動子序列信息，利用生物學信息數(shù)據(jù)庫或者軟件對啟動子序列、啟動子核心區(qū)域、順式作用元件、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、CPG island等進行預測，為進一步明確絲狀真菌啟動子功能提供參考。啟動子結(jié)構分析和功能預測常用的主要數(shù)據(jù)庫如下。

2.1 EPD數(shù)據(jù)庫

EPD數(shù)據(jù)庫（eukaryotic promoter database）（http://epd.vital-it.ch）由瑞士生物信息研究所建立，其中包含動物、植物、真菌、無脊椎動物等的RNA聚合酶Ⅱ型啟動子的序列注釋資源，還有經(jīng)實驗驗證的轉(zhuǎn)錄起始位點。近年，EPD數(shù)據(jù)庫被合并到了EPDnew數(shù)據(jù)庫中，涵蓋范圍更廣，真菌數(shù)據(jù)庫中收集到5 117個釀酒酵母類啟動子和4 802個粟酒裂殖酵母類啟動子，具有更高的精確度和覆蓋率。EPDnew數(shù)據(jù)庫與信號搜索分析（SSA）和ChIP-Seq數(shù)據(jù)庫關聯(lián)，可以作為DNA基序?qū)蚍治?、探索和下載與啟動子有關的功能基因組學數(shù)據(jù)的工具[32]。該數(shù)據(jù)庫操作簡單，輸入相關基因ID即可搜索到啟動子的有關信息。

2.2 TRRD數(shù)據(jù)庫

TRRD數(shù)據(jù)庫（transcription regulatory regions database）（http://wwwmgs.bionet.nsc.ru/mgs/gnw/trrd/）是一個獨特的并經(jīng)過實驗驗證的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)數(shù)據(jù)庫，收集了真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的結(jié)構和功能組織信息。通過該數(shù)據(jù)庫，可以查詢?nèi)?、動物、真菌等基因的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、啟動子、增強子和沉默子的位置及基因表達調(diào)控模式等信息。TRRD數(shù)據(jù)庫主要由TRRDGENES、TRRDLCR、TRRDUNITS、TRRSSITES、TRRDFACTORS、TRRDEXP和TRRDBIB 7個子數(shù)據(jù)庫構成[33]。該數(shù)據(jù)庫操作簡單，不需注冊，用戶可根據(jù)自身需求選擇其中一個數(shù)據(jù)庫，填寫好相關信息后即可進行瀏覽或搜索。

2.3 TRANSFAC數(shù)據(jù)庫

TRANSFAC數(shù)據(jù)庫（http://www.gene-regulation.com/pub/databases.html）是真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控數(shù)據(jù)庫，包括人、酵母菌、植物、鼠等真核生物轉(zhuǎn)錄因子及經(jīng)實驗驗證的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，由site、factor、cell、matrix、gene等多個數(shù)據(jù)表構成。利用該數(shù)據(jù)庫能夠預測和分析啟動子和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。該數(shù)據(jù)庫分公開版和專業(yè)版，目前專業(yè)版包含48 098個真核生物轉(zhuǎn)錄因子、68 917個真核生物轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點以及453 601個真核生物啟動子等，數(shù)量比公開版更加充足[34-35]，但使用專業(yè)版需要支付昂貴的費用。由于公開版長時間未更新，使用公開版數(shù)據(jù)庫分析絲狀真菌啟動子可能會造成較大誤差。

2.4 JASPAR數(shù)據(jù)庫

JASPAR數(shù)據(jù)庫（http://jaspar.genereg.net/）包括整理的轉(zhuǎn)錄因子及結(jié)合位點，目前已更新到第8版，分為脊椎動物、線蟲、昆蟲、植物、真菌5類數(shù)據(jù)庫，包含184個真菌類轉(zhuǎn)錄因子的位置頻率矩陣[36]。該數(shù)據(jù)庫公開、免費使用，可用于真菌轉(zhuǎn)錄因子及結(jié)合位點的預測。

2.5 Plant CARE數(shù)據(jù)庫

Plant CARE數(shù)據(jù)庫（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）常用的功能是預測植物順式作用元件。輸入目的基因序列，需等待一段時間才能獲得預測結(jié)果。使用該數(shù)據(jù)庫預測絲狀真菌啟動子順式作用元件時可將其結(jié)果作為參考，并聯(lián)合多個數(shù)據(jù)庫共同分析。

2.6 Promoter 2.0 Prediction Server數(shù)據(jù)庫

Promoter 2.0 Prediction Server數(shù)據(jù)庫（http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/）可用于預測啟動子所在的位置以及轉(zhuǎn)錄起始位點，預測分值越高，預測結(jié)果可信度越大。用戶只需提交或者輸入fasta格式的DNA序列，即可獲得預測結(jié)果，操作簡單、快捷。

2.7 Laboratory of Molecular Medicine數(shù)據(jù)庫

Laboratory of Molecular Medicine數(shù)據(jù)庫（https://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi）由北京中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院維護，可以用于啟動子CPG island的預測及甲基化PCR引物的設計，操作方法簡單，輸入目的序列即可獲得結(jié)果。

由于目前專門用于絲狀真菌啟動子預測的數(shù)據(jù)庫較少，與啟動子有關的真核生物數(shù)據(jù)庫收錄的信息數(shù)量還不夠充足，部分數(shù)據(jù)庫存在長時間未更新等問題，在對絲狀真菌啟動子進行預測或者生物信息學分析時，為減少誤差，可以使用多個數(shù)據(jù)庫進行聯(lián)合分析，再結(jié)合實驗方法對啟動子進一步驗證。

3 啟動子的篩選技術

啟動子是位于基因非編碼區(qū)5’端上游的特定DNA序列，通常在轉(zhuǎn)錄起始位點上游-100 bp至-1 000 bp內(nèi)。為了確定啟動子所在位置及其序列，常應用啟動子捕獲技術、啟動子探針篩選技術、基因芯片技術、高通量測序等來挖掘、篩選啟動子[34,37]。

3.1 啟動子捕獲技術

啟動子捕獲技術又稱為啟動子陷阱技術。該技術不僅用于確定基因啟動子區(qū)域以及克隆啟動子，還可用于基因功能以及表達模式的研究。應用啟動子捕獲技術時，首先需要構建不含啟動子但是含有報告基因和標記基因的啟動子捕獲載體，然后將捕獲載體正確插入到不同基因序列的外顯子中[38]。若報告基因能夠表達，則表明該序列中含有啟動子序列，以此來確定啟動子。該技術可獲得大量單基因突變體庫，但被捕獲的基因較難分離，插入的DNA序列具有偏向性[39]。鄧晟等[40]構建雙向啟動子捕獲載體，成功確定了棉花黃萎病菌中6個基因的啟動子。劉小紅等[41]應用該技術，成功構建了稻瘟病菌突變體庫。

3.2 啟動子探針技術

啟動子探針技術由Rachael等[42]首次提出，他通過該技術構建了啟動子探針型質(zhì)粒載體，并獲得了一些真核生物的啟動子片段。該技術利用限制性核酸內(nèi)切酶將DNA序列隨機切割成大小不等的片段，在DNA連接酶的作用下，將DNA片段與不含啟動子的表達載體連接，然后將其轉(zhuǎn)化給宿主細胞，并構建報告基因文庫。通過檢測報告基因的表達活性，篩選出具有轉(zhuǎn)錄起始活性的啟動子片段。該方法適用于未知序列基因啟動子的篩選，不需設計引物，能快速篩選出啟動子；但其工作量較大，篩選到的啟動子數(shù)量多，特異性相對較差。李維等[43]利用該技術成功篩選出黃孢原毛平革菌基因的啟動子片段。徐良向等[44]應用該技術快速檢測到橡膠樹白粉病菌HO-73基因啟動子。

3.3 基因芯片技術

基因芯片技術又稱為DNA微陣列技術，具有全自動化、高精確與高精密、高靈敏、高度并行性、多樣性等特點[45]?；蛐酒饕獙⒍喾N特定的寡聚核苷酸或DNA探針固定在芯片的特定位置，將待測基因用熒光標記后與芯片進行雜交，通過檢測雜交信號來分析樣本基因序列信息及表達信息。使用聚類分析和主元分析等分析方法處理基因序列信息，根據(jù)基因的啟動子組成特性，通過多重序列比對，在基因序列的上游區(qū)域?qū)ふ页鰡幼覽46]。Yuko等[47]根據(jù)裂殖酵母的基因組分析結(jié)果，制備了幾種DNA微陣列，對裂殖酵母未知基因功能進行探索，并且尋找其可能用于異源蛋白表達的啟動子。

3.4 高通量測序技術

在檢測啟動子前，可通過高通量測序技術對絲狀真菌進行全基因組重測序，利用Weka等數(shù)據(jù)挖掘軟件結(jié)合生物學信息技術對高通量測序數(shù)據(jù)進行分析，以篩選出啟動子[48]。近年來，研究人員利用高通量測序技術開發(fā)出RNA測序技術（RNA-seq），此技術可以檢測基因在全基因組內(nèi)的表達情況，具有高通量、高重復性、檢測范圍廣泛等特點[49]，但價格昂貴。亓飛等[50]使用RNA-seq技術，在畢赤酵母中發(fā)現(xiàn)了2個新型強啟動子。

4 啟動子功能的研究方法

4.1 啟動子的克隆方法

通過生物學信息的預測和對啟動子的篩選，能夠了解絲狀真菌啟動子的序列信息和結(jié)構特點，但還需進一步研究和驗證啟動子元件的功能，以便對啟動子進行開發(fā)與利用，這需要對啟動子進行克隆。

4.1.1 PCR方法對于已知序列的啟動子，可以根據(jù)其序列設計特異性引物，利用PCR方法對啟動子進行擴增與克隆。PCR克隆啟動子的方法包括巢式PCR、熱不對稱PCR、反向PCR等，詳見表2[34，51]。

表2 PCR克隆啟動子的方法及其特點

葉偉等[52]利用巢氏PCR技術獲得深海真菌埃德菌gliG、gliI、gliO基因的啟動子片段。胡建坤等[53]采用熱不對稱PCR技術得到稻曲病菌的一段含有啟動子的序列。王德培等[54]利用長引物嵌套式反向PCR技術克隆出隆雅致枝霉Δ6-脂肪酸脫氫酶基因上游1.3 kb序列。Fang等[55]利用YADE法，成功克隆出類球孢白僵菌類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1的啟動子?？寺〗z狀真菌啟動子的PCR方法多種多樣，研究者可結(jié)合實際狀況選擇合適的方法。

4.1.2 TA克隆通過PCR方法獲得啟動子片段后，可將其克隆到T載體上。TA克隆操作方法，首先將經(jīng)純化的啟動子片段與T載體連接，再將其轉(zhuǎn)入至感受態(tài)大腸桿菌中，經(jīng)藍白斑篩選、PCR及測序即可驗證啟動子片段是否成功連接在T載體上[56]。利用此方法可以克隆大量的同種啟動子。黎晨等[57]使用熱不對稱PCR方法獲得了玉米黑粉菌Cyp51基因啟動子片段后，成功將其連接在pMD-18-T載體上，為后續(xù)研究分析啟動子功能奠定了基礎。

4.2 功能研究方法

作為真核生物的絲狀真菌，周圍存在大量順式作用元件的啟動子，其序列的跨越范圍、結(jié)構與功能比原核啟動子復雜。在對啟動子進行克隆后，需要通過實驗的方法研究啟動子功能，啟動子功能的研究包括預測及確認啟動子周圍的順式作用元件、確定啟動子片段的轉(zhuǎn)錄起始活性、啟動子核心區(qū)域的位置、啟動子與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用等。目前常用的研究方法有定點突變分析、逐段缺失活性分析、轉(zhuǎn)錄因子-啟動子互作分析、啟動子甲基化和多態(tài)性分析等。

4.2.1 定點突變分析啟動子定點突變是指通過盒式突變、PCR介導等方法使啟動子片段發(fā)生單堿基替換或堿基的添加、刪除等。通過該方法可以分析啟動子的調(diào)節(jié)位點，還能研究啟動子功能，確定啟動子中的TATA box、CAT box、CAAT box等參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要的順式作用元件[58]。通過構建突變的啟動子重組載體，將重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細胞，分析細胞中報告基因的表達活性，可確定啟動子突變前后的轉(zhuǎn)錄起始活性。宮亞娟等[59]對瑞氏木霉Cbh1啟動子進行點突變分析，成功構建了5個啟動子定點突變載體，分析了Cbh1啟動子點突變前后對其轉(zhuǎn)錄活性的影響。Matsushita等[60]對米曲霉Hsp30啟動子進行定點突變，發(fā)現(xiàn)了位于Hsp30啟動子-342～-272的熱休克反應順式作用元件HSE1和HSE2。

4.2.2 逐段缺失活性分析當預測啟動子序列后，可采用啟動子逐段缺失的方法來研究不同啟動子片段的轉(zhuǎn)錄起始活性，以此來判定啟動子的核心區(qū)域。常用的研究方法有5’端逐段缺失、3’端逐段缺失、中間缺失及點突變等，其中5’端逐段缺失方法應用較為普遍。首先構建啟動子5’端逐段缺失的含有熒光素酶基因（Luc）、β-葡萄糖苷酸酶（GUS）、綠色熒光蛋白基因（GFP）等報告基因的表達載體[61]。然后將構建好的表達載體轉(zhuǎn)染至細胞中，通過分析報告基因的表達活性判斷目的基因啟動子轉(zhuǎn)錄起始活性最強的區(qū)域。殷金瑤等[62]構建了5個5’端逐段缺失的橡膠樹白粉菌（HO-73）啟動子片段載體，確定了不同啟動子片段的活性強弱。

4.2.3 轉(zhuǎn)錄因子-啟動子互作分析絲狀真菌基因的轉(zhuǎn)錄除了受到啟動子的影響外，與啟動子專一結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子也參與絲狀真菌基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，使目的基因以特定的強度在特定的時間參與空間表達[63]。研究啟動子與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用，將有助于了解啟動子對絲狀真菌基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。目前，常見的分析轉(zhuǎn)錄因子與啟動子相互作用的方法有酵母單雜交實驗（Y1H）、凝膠阻滯遷移率實驗（EMSA）、DNaseⅠ足跡實驗、染色質(zhì)免疫共沉淀法（CHIP）等。

酵母單雜交可研究蛋白質(zhì)和特定DNA的相互作用，通過構建蛋白與轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合表達的載體，并使其在酵母中表達，根據(jù)報告基因在酵母細胞內(nèi)表達活性的強弱，分析轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的情況[64]。劉兵等[65]利用酵母單雜交實驗驗證了WRKY40和WRKY75轉(zhuǎn)錄因子能與葡萄抗霜病VpPR4b基因啟動子結(jié)合。懷寶玉等[66]對小麥條銹菌Tastp3啟動子進行酵母單雜交，成功篩選出5個候選轉(zhuǎn)錄因子。

凝膠阻滯遷移率實驗是研究DNA或RNA與蛋白質(zhì)相互作用的常用技術。其主要原理是蛋白質(zhì)與探針復合物結(jié)合后分子質(zhì)量變大，在凝膠電泳過程中遷移率較慢。DNaseⅠ足跡實驗可用于鑒別RNA聚合酶等蛋白質(zhì)在DNA上的結(jié)合位點，能找到與DNA特異結(jié)合的目的蛋白，以此來確定轉(zhuǎn)錄因子。其原理是與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA不會被DNase破壞，在電泳凝膠的放射性自顯影圖片上，使其沒有放射性標記帶。凌敏等[67]通過EMSA技術確定了康氏木霉纖維素酶轉(zhuǎn)錄因子ACEI和Xyr。呂新星等[68]通過EMSA和酵母單雜交實驗分析出里氏木霉纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄因子Xyr1。

染色質(zhì)免疫共沉淀法是在活細胞內(nèi)固定DNA與蛋白質(zhì)的復合物，將其隨機切割成染色質(zhì)小片段，利用免疫學方法沉淀，特異性地富集與目的蛋白結(jié)合的DNA片段，經(jīng)純化、測序即可獲得蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列[64，69]。曹艷麗等[70]通過EMSA、DNaseⅠ足跡實驗鑒定了里氏木霉中的轉(zhuǎn)錄因子Rce1在Cbh1啟動子上的結(jié)合位點，通過染色質(zhì)免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Rce1在纖維素誘導表達過程中與轉(zhuǎn)錄因子Xyr1相競爭結(jié)合纖維素酶基因啟動子，進而實現(xiàn)對纖維素酶表達的抑制作用。

4.2.4 啟動子的甲基化和多態(tài)性分析DNA甲基化最早是由Hotchkiss等[71]發(fā)現(xiàn)的。真核生物主要以5-甲基胞嘧啶（5mC）的形式存在[72]。絲狀真菌啟動子DNA甲基化是一種重要的可遺傳的表觀遺傳修飾[73]。啟動子DNA甲基化能改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構、DNA構像的穩(wěn)定性以及DNA與蛋白質(zhì)的互作方式，從而調(diào)控基因表達[74]。檢測DNA甲基化的方法主要有限制性內(nèi)切酶法、重亞硫酸鹽法、芯片技術等[75]。限制性內(nèi)切酶法比較敏感，主要利用部分限制性核酸難以將甲基化DNA序列切開的原理。SmaI-XmaI能識別并切開序列CCCGGG（SmaI-XmaI識別序列較少而不常用），HpaⅡ-MspⅠ能識別CCGG序列進行酶切，當序列中的胞嘧啶產(chǎn)生甲基化時，CCGG序列便不能被HpaⅡ切開，通過southern、PCR等方法可以確定甲基化狀態(tài)[76-77]。HpaⅡ-MspⅠ可作為分析甲基化的工具，此法操作簡單、成本低，但有較大缺點。重亞硫酸鹽法將非甲基化的胞嘧啶C轉(zhuǎn)化為尿嘧啶U，經(jīng)PCR反應形成TA配對。重亞硫酸鹽不能將已甲基化的胞嘧啶U改變，DNA中的甲基化信息通過DNA序列的差異表現(xiàn)出來?；蛐酒椒ㄊ菍⒛茏R別甲基化和非甲基化CpG的探針固定在芯片上，經(jīng)過重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的DNA片段經(jīng)擴增后與探針結(jié)合，從而檢測甲基化位點[78]。

啟動子由于單個核苷酸的變化會出現(xiàn)多態(tài)性（SNPs）。啟動子序列的變化可能會引起轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點發(fā)生改變，從而影響基因表達。SNP與生物的性狀及某些疾病密切相關，SNP標記在遺傳學研究、致病基因定位、易感基因檢測、絲狀真菌致病機制研究中具有重要作用[79]。

5 結(jié)語與展望

在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中，啟動子作為順式作用元件的重要組成部分，控制著基因表達時間、表達部位、表達強度及表達方式[1]。在研究基因功能前，應先對啟動子的結(jié)構、功能等進行研究。近年來對啟動子的研究已經(jīng)形成了一套較為完整的體系。在獲取啟動子的序列后，利用各種在線數(shù)據(jù)庫對啟動子進行生物信息分析及預測，從而了解啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點、順式作用元件、核心啟動子區(qū)域、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點等信息。然而專門用于絲狀真菌啟動子研究的數(shù)據(jù)庫及分析工具還很少，研究者們往往需要借鑒一些真核生物數(shù)據(jù)庫，這往往使得預測結(jié)果的準確性不夠高，需要使用多個數(shù)據(jù)庫進行聯(lián)合分析，并通過各種實驗方法對預測結(jié)果加以驗證。

啟動子的篩選可以使人們準確了解啟動子的序列及位置信息，啟動子的PCR克隆為研究啟動子的功能提供了材料支撐。通過點突變分析、逐段缺失分析、啟動子與轉(zhuǎn)錄因子互作分析等各種方法對啟動子功能進行研究，從而判斷該啟動子轉(zhuǎn)錄活性的強弱，研究啟動子轉(zhuǎn)錄活性最強的區(qū)域，某個順式作用元件對基因是正向調(diào)節(jié)還是負向調(diào)節(jié)、某個轉(zhuǎn)錄因子能否與啟動子結(jié)合。這些研究為絲狀真菌啟動子的開發(fā)利用提供了參考依據(jù)，如利用誘導型強啟動子、構建雙向啟動子或改造啟動子構建過表達載體來高效表達目的產(chǎn)物[25]。近年在絲狀真菌中發(fā)現(xiàn)的U6啟動子能有效提高基因編輯效率[80]。隨著基因組學、計算機科學、分子生物學的不斷發(fā)展，進行絲狀真菌啟動子研究的方法會更加簡便、快捷，在未來將會有更多絲狀真菌啟動子被挖掘出來，不斷推動絲狀真菌啟動子的應用與發(fā)展。