蘇清君，李鵬，邊朝輝，宋廣明，馬文明

北京中醫(yī)藥大學(xué)房山醫(yī)院骨傷科，北京102400

骨折延遲愈合是骨折手術(shù)后常見并發(fā)癥，可導(dǎo)致患者嚴(yán)重殘疾、生活質(zhì)量下降和醫(yī)療負(fù)擔(dān)加重。評估與骨折延遲愈合相關(guān)指標(biāo)有助于預(yù)測骨折延遲愈合風(fēng)險，為臨床制定治療策略提供依據(jù)。研究顯示，細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子以及微小核糖核酸(miRNA)等參與了骨折愈合過程，其表達異常與骨折延遲愈合密切相關(guān)[1]。miR-133a具有調(diào)節(jié)骨代謝的作用，可通過成纖維細(xì)胞生長因子受體1-絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號通路誘導(dǎo)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨量丟失[2]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)是一種強有力的骨誘導(dǎo)生長因子，可募集成骨細(xì)胞，促使成骨細(xì)胞分化，促進骨形成[3]。鑒于此，本研究擬探討miR-133a、BMP-2與股骨頸骨折延遲愈合的關(guān)系，以期為臨床診斷和治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料來源 選擇2019年2月—2021年6月在我院接受手術(shù)治療的251例股骨頸骨折患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：①X線、CT檢查提示單側(cè)股骨頸骨折；②住院接受內(nèi)固定手術(shù)治療；③知情同意本研究，簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往骨折病史或骨科手術(shù)史；②退行性關(guān)節(jié)炎、滑囊炎、滑膜炎、股骨頭壞死、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨腫瘤；③急慢性感染、免疫和血液系統(tǒng)疾病。根據(jù)術(shù)后是否發(fā)生骨折延遲愈合(診斷標(biāo)準(zhǔn)：骨折后≥3個月X線檢查顯示無或極少骨痂生成，斷端骨質(zhì)可見硬化、間隙)，將患者分為延遲組(n=30)和正常組(n=221)。兩組臨床資料比較見表1，延遲組開放性骨折、骨質(zhì)疏松、糖尿病、目前吸煙、局部感染、筋膜室綜合征所占比例均高于正常組(P<0.05或<0.01)。本研究獲得我院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

表1 兩組臨床資料比較[例(%)]

1.2 血清miR-133a、BMP檢測 于術(shù)后4周復(fù)查時，采集患者外周靜脈血3 mL，4 ℃ 3 000 r/min離心15 min(離心半徑10 cm)，取上清液，-80 ℃保存。血清miR-133a檢測采用RT-PCR法。取血清樣本，使用miRNA分離試劑盒(PureLinkTM，美國賽默飛公司)提取miRNA，使用含miR-133a和U6的莖環(huán)RT引物的逆轉(zhuǎn)錄酶(SuperScriptTMⅡ，美國賽默飛公司)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR引物由上?；倒就瓿?，引物序列：miR-133a上游引物5′-GCGTTTGGTCCCCTTCAACCA-3′，下游引物5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；內(nèi)參U6上游引物5′-CTCGCTTCG GCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃變性10 s，65 ℃退火20 s；75 ℃延伸15 s，共40個循環(huán)，反應(yīng)體系(20 μL)：包含cDNA、Power SYBR Green Master Mix和擴增引物等。采用2-ΔΔCt法計算miR-133a的相對表達量。血清BMP-2檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法，室溫下復(fù)融血清標(biāo)本，使用SpectraMax iD5-多功能酶標(biāo)儀(上海美谷分子儀器有限公司)檢測BMP-2，試劑盒購自武漢博士德公司。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-133a、BMP-2水平比較及二者相關(guān)性分析 延遲組血清miR-133a水平高于正常組，BMP-2水平低于正常組(P均<0.05)。見表2。延遲組血清miR-133a與BMP-2呈負(fù)相關(guān)(r=-0.418，P=0.022)。

表2 兩組血清miR-133a水平、BMP-2水平比較

2.2 血清miR-133a與BMP-2對股骨頸骨折術(shù)后骨折愈合延遲的影響 高齡≥60歲、骨質(zhì)疏松、血清miR-133a≥0.90、BMP-2<167.15 ng/L是骨折延遲愈合的危險因素(P<0.05)。見表3。

表3 影響骨折愈合延遲的Logistic回歸分析結(jié)果

2.3 血清miR-133a、BMP-2對股骨頸骨折術(shù)后骨折愈合延遲的預(yù)測效能 miR-133a、BMP-2預(yù)測股骨頸骨折術(shù)后骨折愈合延遲的截斷值為2.03、129.35 ng/L，曲線下面積分別為0.771、0.678，miR-133a聯(lián)合BMP-2預(yù)測股骨頸骨折術(shù)后骨折愈合延遲的AUC為0.915，高于單獨指標(biāo)(P均<0.01)，見表4。

表4 miR-133a、BMP-2對股骨頸骨折術(shù)后骨折愈合延遲的預(yù)測效能

3 討論

骨折愈合是一個復(fù)雜的修復(fù)過程，主要分為炎癥反應(yīng)、軟骨痂形成、硬骨痂形成和骨重塑4個階段，損傷誘導(dǎo)的血腫和炎癥反應(yīng)驅(qū)使骨膜、骨內(nèi)膜和骨髓的間充質(zhì)細(xì)胞向骨折部位凝聚并向軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化，同時成骨細(xì)胞分化增加，促使骨膜上膜內(nèi)骨在骨折間隙形成堅固的骨支架，骨支架擴張橋接骨折端，礦化形成堅硬的硬骨痂，硬骨痂在破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞相互作用下發(fā)生骨重塑，重建正常的骨幾何形狀，實現(xiàn)剛性固定[4]。然而5%～10%的患者術(shù)后骨折愈合延遲或難以愈合，年齡大、糖尿病、吸煙、局部感染、營養(yǎng)缺乏、軟組織損傷加重、筋膜室綜合征等是骨折延遲愈合的危險因素[5]。

miRNA是內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，通過與信使RNA結(jié)合來調(diào)節(jié)多種生物過程，其中包括骨形成過程[6]。miR-133a是一種高度保守miRNA，從與miR-1相同的染色體位點轉(zhuǎn)錄而來，在心肌組織中大量表達，參與心臟疾病以及心血管疾病的發(fā)生，同時還涉及結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌等多種癌癥過程[7-8]。miR-133a在骨骼肌間充質(zhì)干細(xì)胞中也有豐富表達，可調(diào)控骨骼肌發(fā)育以及骨代謝過程。已有研究表明，miR-133a是骨細(xì)胞分化的負(fù)向調(diào)節(jié)因子[9]。動物實驗顯示，miR-133a在雌激素缺乏誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏小鼠中表達上調(diào)[10]。ANASTASILAKIS等[11]研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者外周循環(huán)血中miR-133a表達上調(diào)，接受抗骨質(zhì)疏松治療后miR-133a表達下調(diào)。此外，MENCIA等[12]報道，局部使用含miR-133a抑制復(fù)合物的多孔膠原—納米羥基磷灰石支架可上調(diào)runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)表達，增強間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化。本研究結(jié)果顯示，延遲組術(shù)后血清miR-133a水平增高，回歸分析結(jié)果顯示miR-133a與股骨頸骨折延遲愈合有關(guān)，miR-133a升高是骨折延遲愈合的危險因素之一，表明miR-133a升高可能抑制骨折術(shù)后骨形成過程。分析其機制包括：首先，Runx2是間充質(zhì)干細(xì)胞成骨細(xì)胞分化的主要調(diào)節(jié)因子，參與成骨細(xì)胞分化過程[13]，Runx2是miR-133a的直接靶標(biāo)，miR-133a通過直接靶向Runx2抑制成骨分化。其次，維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合亞基1對骨鈣素γ-羧化和骨代謝具有重要作用，骨鈣素在骨礦化過程中由成骨細(xì)胞合成，骨鈣素γ-羧化可增強對鈣離子的親和力，γ-羧化失敗降低對鈣離子的親和力和骨質(zhì)量，而miR-133a可直接調(diào)控維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合亞基的表達，抑制骨鈣素γ-羧化和骨形成[14]，導(dǎo)致骨折愈合延遲。

BMP-2屬于轉(zhuǎn)化生長因子β超家族的成員，是一種骨源性骨誘導(dǎo)細(xì)胞因子，具有誘導(dǎo)成骨的能力。研究顯示，將BMP植入骨骼外軟組織后可促進間充質(zhì)干細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，刺激骨形成，增加硬骨痂的發(fā)育和骨痂強度。除誘導(dǎo)骨形成外，在骨祖細(xì)胞旁分泌信號傳導(dǎo)下，BMP-2還可促使新生血管形成，為骨再生提供血管供應(yīng)[15]。BMP-2在骨折愈合中起重要作用，軟骨細(xì)胞BMP-2的缺失可導(dǎo)致骨折愈合無法啟動，或軟骨愈傷組織的形成時間延長，從而影響骨折愈合過程[16]。動物實驗顯示，對去卵巢骨折小鼠給予重組人BMP-2后，可促使去卵巢小鼠骨折愈合[17]。GAO等[16]報道，骨折術(shù)后恢復(fù)良好患者的血清BMP-2水平顯著高于恢復(fù)較差患者，血清BMP-2水平可作為股骨頸骨折髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后恢復(fù)的標(biāo)志物。在骨間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化過程中，高水平的BMP-2可直接誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)器Smad-1/5/9的磷酸化，促進骨組織分化和骨折愈合[18]，BMP-2缺乏其骨誘導(dǎo)能力降低，因此骨折愈合延遲。本研究結(jié)果顯示，延遲組血清BMP-2水平低于正常組，回歸分析結(jié)果顯示BMP-2水平降低是股骨頸骨折患者術(shù)后骨折延遲愈合的危險因素，說明BMP-2缺失可能導(dǎo)致骨折術(shù)后骨愈合延遲。

研究顯示，miR-133a可通過靶向調(diào)控Runx2，抑制RUNX2/BMP2信號通路傳導(dǎo)，抑制骨形成，負(fù)向調(diào)節(jié)骨折愈合過程[8]。本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示miR-133a與BMP-2呈負(fù)相關(guān)，提示miR-133a、BMP-2在骨折術(shù)后骨折愈合過程中具有相互抑制作用，血清miR-133a升高可能抑制BMP-2活性，降低其骨誘導(dǎo)能力，導(dǎo)致骨折愈合延遲。ROC分析結(jié)果顯示，miR-133a聯(lián)合BMP-2可較好地預(yù)測股骨頸骨折術(shù)后骨折延遲愈合風(fēng)險，說明檢測血清miR-133a、BMP-2可為臨床骨折延遲愈合預(yù)防提供有效信息，指導(dǎo)臨床治療?；貧w分析結(jié)果顯示，高齡、骨質(zhì)疏松也與骨折延遲愈合有關(guān)，提示臨床應(yīng)針對高?；颊哌M行干預(yù)，促使骨折愈合。

綜上所述，股骨頸骨折延遲愈合患者術(shù)后血清miR-133a水平升高，BMP-2水平下降，miR-133a水平升高、BMP-2水平降低是骨折延遲愈合的危險因素，miR-133a可能通過負(fù)向調(diào)控BMP-2參與骨折愈合延遲的過程；聯(lián)合檢測miR-133a和BMP-2可為骨折延遲愈合評估提供可靠信息。