郭彬彬 郭 滿 張子杰 張 浩
(河南省南陽(yáng)市中心醫(yī)院1 乳腺外科,2 甲狀腺外科,3 病理科,南陽(yáng)市 473000,電子郵箱:2550767113@qq.com)
乳腺癌是發(fā)展中國(guó)家女性發(fā)病率最高的癌癥,也是女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1],其發(fā)病率逐年增長(zhǎng)且發(fā)病人群趨于年輕化[2]。三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)約占所有乳腺癌的10.0%~17.0%。與非三陰性乳腺癌相比,TNBC的發(fā)病人群更趨于年輕化[3],且更具侵襲性,易發(fā)生內(nèi)臟轉(zhuǎn)移,因雌激素受體、孕激素受體及人表皮生長(zhǎng)因子受體-2的表達(dá)缺失,對(duì)內(nèi)分泌治療及特異性靶向治療不敏感[4],預(yù)后較差。波形蛋白是一種重要的細(xì)胞骨架蛋白,是中間纖維蛋白家族中最重要的一員[5],與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)[6]。骨橋蛋白是一種多功能分泌型磷酸糖蛋白,在轉(zhuǎn)移癌和具有高轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤中呈高表達(dá)[7-8]。截至目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)波形蛋白、骨橋蛋白的共同研究較少,兩者在TNBC的發(fā)生和發(fā)展中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究檢測(cè)波形蛋白、骨橋蛋白在TNBC中的表達(dá)情況,分析兩者與TNBC臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性,探討兩者在TNBC復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移中作用的可能機(jī)制。
1.1 臨床資料 選取2013年1月至2015年12月南陽(yáng)市中心醫(yī)院收治的120例TNBC患者為研究對(duì)象(TNBC組)。納入標(biāo)準(zhǔn):均經(jīng)病理確診為T(mén)NBC,既往未接受過(guò)抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn):雙側(cè)乳癌,合并臟器功能障礙,炎性乳腺癌,其他部位惡性腫瘤,生存資料不完善的病例。120例TNBC患者年齡 28~76(51.86±9.07)歲;腫瘤直徑:T0~T1期 49 例,T2期 70例,T3期1例;存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移72例;原發(fā)腫瘤-區(qū)域淋巴結(jié)-遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移分期:Ⅰ期31 例,Ⅱ期65例,Ⅲ期24例。另選取同期收治的30例乳腺良性疾病患者作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn):術(shù)后經(jīng)病理確診為乳腺良性疾病,包括乳腺纖維腺瘤及乳腺增生癥。排除標(biāo)準(zhǔn):合并乳腺癌或其他部位惡性腫瘤。30例乳腺良性疾病患者年齡 30~67(48.70±9.50)歲,其中乳腺增生癥11例,乳腺纖維腺瘤19例。兩組年齡比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)南陽(yáng)市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有受試者均簽署知情同意書(shū)。
1.2 免疫組化法檢測(cè)波形蛋白、骨橋蛋白的表達(dá)情況 采用免疫組化法檢測(cè)波形蛋白、骨橋蛋白在TNBC腫瘤組織及乳腺良性疾病組織中的表達(dá)情況。將石蠟包埋的TNBC組織及乳腺良性疾病組織連續(xù)切成3 μm切片,將切片放入60℃恒溫箱中烘烤2 h,然后使用二甲苯浸泡15 min,更換新鮮二甲苯后再浸泡15 min,遞減梯度乙醇(無(wú)水乙醇、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、體積分?jǐn)?shù)75%乙醇、三蒸水)脫去二甲苯并水化,枸櫞酸鈉緩沖液(pH=6.0)高壓抗原修復(fù),滴加體積分?jǐn)?shù)為3%的過(guò)氧化氫溶液室溫孵育20 min;磷酸鹽緩沖液 (phosphate buffered saline,PBS)沖洗,滴加即用型一抗(兔抗人骨橋蛋白單克隆抗體工作液100 μL、兔抗人波形蛋白多克隆抗體工作液100 μL),置于濕盒中室溫孵育2 h,PBS沖洗3次,3 s/次,室溫下滴加二抗(酶標(biāo)羊抗鼠/兔聚合物),二氨基聯(lián)苯胺顯色,蒸餾水沖洗3次,3 s/次,蘇木精復(fù)染,蒸餾水沖洗返藍(lán),遞減梯度乙醇(無(wú)水乙醇、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、體積分?jǐn)?shù)75%乙醇、三蒸水)脫水、二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片,顯微鏡觀察著色情況。以PBS代替一抗進(jìn)行上述步驟作為T(mén)NBC組與對(duì)照組的陰性對(duì)照。
1.3 結(jié)果判定 以胞質(zhì)中出現(xiàn)棕色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。按半定量積分法判斷波形蛋白、骨橋蛋白表達(dá)情況,根據(jù)染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞所占比例計(jì)分:無(wú)著色計(jì)0分,淺黃色計(jì)1分,棕黃色計(jì)2分,棕褐色計(jì)3分;陽(yáng)性細(xì)胞所占比例<15%計(jì)0分,陽(yáng)性細(xì)胞所占比例為15%~25%計(jì)1分,陽(yáng)性細(xì)胞所占比例為 26%~50%計(jì)2分,陽(yáng)性細(xì)胞所占比例為51%~75%計(jì)3分,陽(yáng)性細(xì)胞所占比例>75%計(jì)4分。將染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分相加,總分<4分為陰性表達(dá),≥4分為陽(yáng)性表達(dá)。
1.4 隨訪方法 隨訪方式采用電話隨訪和門(mén)診復(fù)診,隨訪截至2019年3月,或患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及死亡則隨訪終止,平均隨訪時(shí)間55個(gè)月,無(wú)失訪病例。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示,組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn);相關(guān)性分析采用 Spearman秩相關(guān)分析;采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線;生存情況的比較采用log-rank檢驗(yàn);以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 TNBC組患者與對(duì)照組患者波形蛋白、骨橋蛋白表達(dá)情況的比較 鏡下觀察可見(jiàn)波形蛋白在TNBC組織中大量表達(dá),而在乳腺良性疾病組織中少量表達(dá),見(jiàn)圖1。TNBC組波形蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為25.00%(30/120),高于對(duì)照組的陽(yáng)性表達(dá)率6.67%(2/30)(χ2=4.807,P=0.028)。鏡下觀察可見(jiàn)骨橋蛋白在TNBC組織中大量表達(dá),而在乳腺良性疾病組織中少量表達(dá),見(jiàn)圖2。TNBC組骨橋蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為26.67%(32/120),高于對(duì)照組的陽(yáng)性表達(dá)率3.33%(1/30)(χ2=7.615,P=0.006)。
圖1 波形蛋白的表達(dá)情況(免疫組化,×200)
圖2 骨橋蛋白的表達(dá)情況(免疫組化,×200)
(A:TNBC組;B:對(duì)照組)
2.2 波形蛋白、骨橋蛋白表達(dá)陽(yáng)性和表達(dá)陰性的TNBC患者臨床病理特征的比較 波形蛋白陽(yáng)性表達(dá)患者腫瘤直徑為T(mén)2或T3期,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為N2或N3,臨床分期為Ⅲ期的比例均高于波形蛋白陰性表達(dá)患者(均P<0.05);不同年齡、絕經(jīng)狀態(tài)在波形蛋白陽(yáng)性表達(dá)患者與陰性表達(dá)患者之間的分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。骨橋蛋白陽(yáng)性表達(dá)患者腫瘤直徑為T(mén)2期,臨床分期為Ⅱ期或Ⅲ期的比例均高于骨橋蛋白陰性表達(dá)患者(均P<0.05);不同年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、絕經(jīng)狀態(tài)在骨橋蛋白陽(yáng)性表達(dá)患者與陰性表達(dá)患者之間的分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表1。
表1 波形蛋白、骨橋蛋白表達(dá)陽(yáng)性和表達(dá)陰性的TNBC患者臨床病理特征的比較[n(%)]
2.3 TNBC患者波形蛋白、骨橋蛋白表達(dá)情況的相關(guān)性分析 Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示,TNBC患者波形蛋白與骨橋蛋白的表達(dá)情況呈正相關(guān)性(rs=0.392,P<0.001)。
2.4 TNBC患者波形蛋白、骨橋蛋白表達(dá)情況與預(yù)后的關(guān)系 120例TNBC患者隨訪11~74個(gè)月,中位隨訪時(shí)間為62.8個(gè)月,復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移10例,死亡25例。截至隨訪終止時(shí)間,波形蛋白陽(yáng)性表達(dá)TNBC患者的無(wú)病生存率為 40.0%,低于波形蛋白陰性表達(dá)TNBC患者的81.1%(χ2=18.407,P<0.001),見(jiàn)圖3。骨橋蛋白陽(yáng)性表達(dá)TNBC患者的無(wú)病生存率為 59.4%,低于骨橋蛋白陰性表達(dá)TNBC患者的 75.0%(χ2=4.492,P=0.042),見(jiàn)圖4。
圖3 波形蛋白陽(yáng)性表達(dá)TNBC患者和波形蛋白陰性表達(dá)TNBC患者的生存曲線
圖4 骨橋蛋白陽(yáng)性表達(dá)TNBC患者和骨橋蛋白陰性表達(dá)TNBC患者的生存曲線
乳腺癌已經(jīng)躍居女性惡性腫瘤發(fā)病率第一位[9]。相比較于其他類型乳腺癌,TNBC的組織學(xué)分級(jí)和侵襲性更高,TNBC內(nèi)臟轉(zhuǎn)移的發(fā)生率多于骨轉(zhuǎn)移,易發(fā)生脊髄、腦膜、腦、肝和肺轉(zhuǎn)移,5年生存率遠(yuǎn)低于其他類型乳腺癌[10]。因不表達(dá)雌激素受體、孕激素受體、人表皮生長(zhǎng)因子受體-2,TNBC缺乏有效的內(nèi)分泌治療及精準(zhǔn)的靶向治療,僅僅依賴細(xì)胞毒性化療藥物來(lái)延緩復(fù)發(fā)與進(jìn)展[11],TNBC是目前治療最棘手的乳腺癌亞型之一,尋找更有效的靶向治療位點(diǎn)及預(yù)后預(yù)測(cè)分子也是亟須攻克的難題。
波形蛋白是中間纖維蛋白,作為間葉分化的標(biāo)志物,是細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)的重要標(biāo)志物,EMT與腫瘤細(xì)胞侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)[5]。波形蛋白在宮頸癌、肺癌,結(jié)直腸癌等多種上皮源性腫瘤組織中的表達(dá)明顯增高[12]。本研究結(jié)果顯示,TNBC組波形蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率高于對(duì)照組(P<0.05),與趙俊軍[13]等的研究結(jié)果一致。波形蛋白陽(yáng)性表達(dá)患者腫瘤直徑為T(mén)2或T3期,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為N2或N3,臨床分期為Ⅲ期的比例均高于波形蛋白陰性表達(dá)患者(均P<0.05),表明波形蛋白的表達(dá)可能與TNBC腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、臨床分期有關(guān),波形蛋白可能在TNBC發(fā)生和發(fā)展發(fā)揮重要作用,參與TNBC的增殖、轉(zhuǎn)移,與TNBC的不良生物學(xué)行為密切相關(guān)。長(zhǎng)期隨訪發(fā)現(xiàn),波形蛋白陽(yáng)性表達(dá)TNBC患者的無(wú)病生存率遠(yuǎn)低于波形蛋白陰性表達(dá)患者(P<0.05),這提示波形蛋白陽(yáng)性表達(dá)TNBC患者的預(yù)后較差,在臨床工作中可通過(guò)檢測(cè)波形蛋白的表達(dá),對(duì)患者預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè),為輔助化療方案的選擇及其他臨床決策提供參考。
目前發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白對(duì)腫瘤的增殖、侵襲、自噬、凋亡及血管新生等都具有重要的調(diào)節(jié)作用[14-15]。郭滿等[16]分別觀察不同乳腺組織中骨橋蛋白表達(dá)的差異,結(jié)果表明在TNBC組織中骨橋蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率遠(yuǎn)高于乳腺增生組織和正常乳腺組織。抑制骨橋蛋白表達(dá)可促進(jìn)TNBC細(xì)胞自噬和凋亡,從而抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[16-17]。本研究結(jié)果顯示,骨橋蛋白在TNBC組織中高表達(dá)且骨橋蛋白陽(yáng)性表達(dá)患者腫瘤直徑為T(mén)2期,臨床分期為Ⅱ期或Ⅲ期的比例均高于骨橋蛋白陰性表達(dá)患者(均P<0.05),這表明骨橋蛋白可能與TNBC腫瘤直徑和臨床分期有關(guān)(均P<0.05),提示骨橋蛋白可能參與TNBC的發(fā)生發(fā)展。波形蛋白與骨橋蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05),這表明波形蛋白與骨橋蛋白或許在TNBC的發(fā)生和發(fā)展中存在調(diào)控關(guān)系,或許可通過(guò)調(diào)控例如p38蛋白激酶信號(hào)通路表達(dá)[17],進(jìn)而調(diào)控波形蛋白與骨橋蛋白的表達(dá),來(lái)實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移。經(jīng)長(zhǎng)期隨訪發(fā)現(xiàn),骨橋蛋白與TNBC預(yù)后密切相關(guān),骨橋蛋白陽(yáng)性表達(dá)TNBC患者無(wú)病生存率低于骨橋蛋白陰性表達(dá)患者(P<0.05)。在臨床工作中可檢測(cè)TNBC患者的骨橋蛋白表達(dá)情況,對(duì)于骨橋蛋白表達(dá)較高的患者,應(yīng)給予相應(yīng)的臨床重視。
綜上所述,波形蛋白與骨橋蛋白在TNBC組織中陽(yáng)性表達(dá)率高,且兩者表達(dá)情況呈正相關(guān),其在TNBC的發(fā)生、發(fā)展中可能起協(xié)同作用,二者的高表達(dá)提示TNBC患者預(yù)后不良,在臨床上檢測(cè)二者的表達(dá)水平或可評(píng)估患者預(yù)后,為T(mén)NBC的治療提供臨床指導(dǎo)。