徐 婧，王 丹，陳慶欣，張艷青，王 俊，趙明磊，2，李建國(guó)，2

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣州，510642；2 廣東省荔枝工程技術(shù)研究中心，廣州，510642)

植物內(nèi)源激素是植物自身代謝產(chǎn)生的、能夠從產(chǎn)生部位移動(dòng)到作用部位，并調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的具有生理活性的有機(jī)物質(zhì)[1]，其在植物體中的含量極低，一般為組織鮮重的10-9～10-7[2]，性質(zhì)不穩(wěn)定[3]；但在植物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，它幾乎參與了植物從種子休眠、萌發(fā)到植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、生殖生長(zhǎng)，以及成熟和衰老的整個(gè)生命過程[4]。植物細(xì)胞的生理活動(dòng)由多種激素共同參與，存在著錯(cuò)綜復(fù)雜的交互作用[5]，一般研究植物激素與植物生長(zhǎng)發(fā)育之間關(guān)系最直接的方法是確定植物內(nèi)源激素含量變化與表型變化的關(guān)系，因此，開發(fā)建立快速有效精確定量植物內(nèi)源激素的方法一直是該研究領(lǐng)域熱點(diǎn)。

荔枝LitchichinensisSonn.是我國(guó)亞熱帶地區(qū)大宗果樹，經(jīng)濟(jì)價(jià)值頗高，產(chǎn)量低而不穩(wěn)定是限制其產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的瓶頸問題?；ㄑ糠只凸麑?shí)發(fā)育均與其內(nèi)源激素含量和變化動(dòng)態(tài)有密切關(guān)系[6-8]。

目前，荔枝內(nèi)源激素定量方法主要有酶聯(lián)免疫法和高效液相色譜法[9-10]，其定量結(jié)果往往差異大、重復(fù)性差。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)是將色譜的高分離能力與質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度[11]相結(jié)合定量微量物質(zhì)的一種技術(shù)，該技術(shù)能夠直接得到待測(cè)物質(zhì)結(jié)構(gòu)與相對(duì)分子量，克服了傳統(tǒng)色譜技術(shù)在植物激素定性和定量分析方面的不足，是目前公認(rèn)的高效快速高精確測(cè)定植物內(nèi)源激素的方法[12]。目前，鮮見采用LC-MS技術(shù)測(cè)定荔枝器官或組織內(nèi)源激素的報(bào)道。本研究以荔枝果實(shí)為材料，首次建立了超高效液相色譜—三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-MS/MS)同時(shí)測(cè)定果實(shí)中吲哚-3-乙酸(IAA)和脫落酸(ABA)的檢測(cè)方法，為相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

對(duì)廣東省深圳市西麗果場(chǎng)果園“懷枝”荔枝，選取長(zhǎng)勢(shì)相似、掛果量相當(dāng)?shù)?株供試，每株為1個(gè)重復(fù)。各時(shí)期分別在每株?yáng)|南西北等方位結(jié)果母枝取果實(shí)5個(gè)，花后25 d幼果用于方法研究，采前1個(gè)月果實(shí)分為果皮、果肉、種子(見圖1)，用于方法驗(yàn)證；用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，液氮速凍并放于-80 ℃冰箱備用。

圖1 “懷枝”荔枝果實(shí)樣品

1.2 儀器與試劑

超高效液相色譜—三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(Waters Acquity UPLC XEVO TQD-MS/MS)，沃特世公司產(chǎn)；Thermo Scientific Sorvall LYNX高速落地離心機(jī)，賽默飛公司產(chǎn)；振蕩器，Eppendorf公司產(chǎn)；超聲儀，Scientz公司產(chǎn)。

標(biāo)準(zhǔn)品：IAA、ABA，上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)；13C6-IAA，Cambridge Isotope Laboratories(劍橋標(biāo)準(zhǔn)品生產(chǎn)商產(chǎn))；D6-ABA，Toronto Research Chemicals(多倫多化學(xué)研究公司產(chǎn))。0.22 μm微孔濾膜，津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)；甲酸、乙腈、甲醇、質(zhì)譜純，F(xiàn)ISHER公司產(chǎn)；丙酮、乙酸乙酯、異丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚、石油醚，分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司產(chǎn)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

分別準(zhǔn)確稱取IAA、ABA、13C6-IAA、D6-ABA標(biāo)準(zhǔn)品1 mg于5 mL玻璃瓶中，用純甲醇定容，配制成1 ng/mL儲(chǔ)備液，密封儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱中，用時(shí)稀釋成一系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 色譜和質(zhì)譜條件

色譜條件：Waters公司BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相A為0.1%(V∶V)甲酸水溶液，流動(dòng)相B為0.1%(V∶V)甲酸乙腈溶液，梯度洗脫程序：0 min，85%A+15%B；2.5 min，10%A+90%B；0.25～3 min，10%A+90%B；3～5 min，85%A+15%B；流速0.4 mL/min。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，毛細(xì)管電壓為2.80 kV，源溫110 ℃，脫溶劑氣溫度400 ℃，脫溶劑氣流速800 L/h，錐孔氣流50 L/h，掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式，質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 吲哚-3-乙酸(IAA)和脫落酸(ABA)及其內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)

1.5 待測(cè)樣品前處理方法

待測(cè)樣品前處理為內(nèi)源激素定量過程中最重要的步驟，耗時(shí)最長(zhǎng)，占整個(gè)檢測(cè)定量時(shí)間的80%[13]。主要參考鄧文紅等[14-15]和李金克等[16]方法，以花后25 d幼果為材料，分別測(cè)定不同抗氧化劑，即2，6-二叔丁基對(duì)甲酚BHT、維生素C；提取劑，即異丙醇∶水∶濃鹽酸(體積比2∶1∶0.002)、80%甲醇、80%丙酮；除色劑，即石油醚、三氯甲烷；萃取劑，即二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯；pH值，即在加除色劑石油醚前調(diào)節(jié)pH值至8、在加萃取劑乙酸乙酯前調(diào)節(jié)pH值至3；及不同提取方式，即Eppendorf振蕩器4 ℃ 850 r/min常規(guī)振蕩30 min、低溫Scientz超聲儀功率30 W頻率40 kHz超聲提取10 min對(duì)目標(biāo)物IAA和ABA保留行為及富集效果的影響，篩選出適合荔枝果實(shí)樣品前處理流程。

即取荔枝果實(shí)鮮樣液氮研磨至粉狀，稱取0.5 g至離心管，加入提取液3 mL，100 ng內(nèi)標(biāo)，低溫震蕩30 min；4 ℃，10 000 r/min，離心10 min；取上清液，棄下層，氮吹儀濃縮至水相，加入1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至8～9，加入石油醚2 mL，低溫震蕩10 min；4 ℃，6 000 r/min，離心5 min；棄醚相，留水相，加入石油醚2 mL，低溫震蕩10 min；4 ℃，6 000 r/min，離心5 min；棄醚相，留水相，加入甲酸調(diào)節(jié)pH值至2～3，再加入乙酸乙酯2 mL；4 ℃，6 000 r/min，離心5 min；將上層乙酸乙酯移至新離心管，加入乙酸乙酯2 mL，低溫震蕩10 min；4 ℃，6 000 r/min，離心5 min；合并兩次乙酸乙酯，氮吹儀吹干，80%甲醇溶解，過0.22 μm微孔濾膜，上機(jī)測(cè)樣。

1.6 方法的準(zhǔn)確度及精密度實(shí)驗(yàn)

配置0～500 ng/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入等量的相應(yīng)內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其內(nèi)標(biāo)濃度為100 ng/mL，按照上述色質(zhì)譜條件依次分析各標(biāo)準(zhǔn)溶液，以標(biāo)準(zhǔn)品峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度和內(nèi)標(biāo)濃度比為橫坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各內(nèi)源激素的回歸方程。對(duì)5 ng/mL IAA、ABA混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，按S/N=3和S/N=10來確定方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)；以懷枝荔枝果皮做方法準(zhǔn)確度試驗(yàn)，重復(fù)3次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 IAA和ABA的UPLC-MS/MS的總離子色譜圖

測(cè)定4種混合標(biāo)樣(500 ng/mL)在設(shè)定的色譜—質(zhì)譜條件(1.4)下的保留情況，其中橫座標(biāo)是出峰時(shí)間，縱座標(biāo)是峰高，4種標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰幾乎均為寶塔狀，峰型尖銳、平滑。IAA及其同位素內(nèi)標(biāo)物出峰時(shí)間為1.64 min，ABA及其同位素內(nèi)標(biāo)物出峰時(shí)間為1.82 min(見圖2)。說明4種標(biāo)準(zhǔn)品在本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的色譜和質(zhì)譜條件下能有穩(wěn)定出峰時(shí)間及峰型。

2.2 前處理萃取方法選擇

目前的萃取方法一般有液液萃取、有機(jī)溶劑萃取、固相萃取、液固萃取等，我們選取液液萃取外標(biāo)法、分散液液微萃取外標(biāo)法、液液萃取內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行比較試驗(yàn)。

試驗(yàn)結(jié)果可以看出，液液萃取外標(biāo)法雖然操作簡(jiǎn)單、用時(shí)短，但是裂峰雜峰多，無法檢測(cè)到目標(biāo)物。分散液液微萃取外標(biāo)法雖然有機(jī)試劑使用少，比較環(huán)保，但是操作復(fù)雜繁瑣且只能檢測(cè)到ABA(見表2)。液液萃取內(nèi)標(biāo)法操作簡(jiǎn)單，分別在1.64 min和1.82 min有IAA和ABA特征峰出現(xiàn)(見圖3)，且峰型平滑尖銳、無雜峰，響應(yīng)值分別為5.68 e4和8.60 e4，較其他兩個(gè)方法高；且該方法無需做回收率試驗(yàn)，節(jié)省操作時(shí)間，唯一的缺點(diǎn)是有機(jī)試劑使用量大。由此可以確定液液萃取內(nèi)標(biāo)法對(duì)ABA和IAA的富集效果較好。

圖2 吲哚-3-乙酸(IAA)和脫落酸(ABA)標(biāo)準(zhǔn)品及其內(nèi)標(biāo)物總離子色譜

圖3 經(jīng)過液液萃取前處理的荔枝果實(shí)吲哚-3-乙酸(IAA)和脫落酸(ABA)總離子色譜

表2 荔枝果實(shí)吲哚-3-乙酸(IAA)和脫落酸(ABA)的3種萃取方法比較

2.3 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

為了篩選適合荔枝果實(shí)樣品前處理流程，比較了不同抗氧化劑、提取劑、除色劑、萃取劑、pH值調(diào)節(jié)和提取方式對(duì)IAA和ABA出峰面積的影響。添加抗氧化劑2，6-二叔丁基對(duì)甲酚BHT和維生素C處理的ABA出峰面積無顯著性差異，但添加抗氧化劑處理的IAA出峰面積顯著低于對(duì)照(無抗氧化劑)，故提取時(shí)無需添加抗氧化劑。使用80%丙酮作為提取劑，IAA和ABA均有較高提取率；使用石油醚作為除色劑，少量多次萃取能除去一定的色素，且IAA和ABA均有較高響應(yīng)，因此石油醚可以替代高毒、高污染的三氯甲烷。乙酸乙酯作為萃取劑對(duì)IAA的萃取率顯著高于二氯甲烷和乙醚；二氯甲烷對(duì)ABA的萃取率最高，綜合比較，選擇乙酸乙酯作為萃取劑為宜。通過控制pH值，兩種內(nèi)源激素的峰面積與不調(diào)節(jié)pH值處理時(shí)有顯著性差異，表明控制pH值能明顯減少兩種內(nèi)源激素的損失。常規(guī)振蕩提取IAA和ABA峰面積均顯著高于超聲振蕩提取(見圖4—圖6)。因此，前處理?xiàng)l件優(yōu)化為提取劑、除色劑和萃取劑分別使用80%丙酮、石油醚和乙酸乙酯，并且在加除色劑石油醚前調(diào)節(jié)pH值至8，在加萃取劑乙酸乙酯前調(diào)節(jié)pH值至3，常規(guī)Eppendorf振蕩器4 ℃ 850 r/min振蕩30 min提取。

注：不同小寫字母表示處理間在0.05水平差異顯著(LSD法多重比較，n=3)。圖5和圖6同。

圖5 不同除色劑和萃取劑對(duì)荔枝果實(shí)吲哚-3-乙酸(IAA)和脫落酸(ABA)出峰面積的影響

圖6 調(diào)節(jié)pH值和不同提取方式對(duì)荔枝果實(shí)吲哚-3-乙酸(IAA)和脫落酸(ABA)出峰面積的影響

2.4 方法準(zhǔn)確度及精密度考察

試驗(yàn)結(jié)果看出，IAA線性范圍0～500 ng/mL，線性回歸方程為y=2.065 8x-0.119 4，相關(guān)系數(shù)r為0.998 9，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.75%，檢出限為0.283 pg/μL(S/N=3)，定量限為0.339 pg/μL(S/N=10)；ABA線性范圍也是0～500 ng/mL，線性回歸方程為y= 0.667 1x-0.034，相關(guān)系數(shù)r為0.999 5，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.38%，檢出限為0.102 pg/μL(S/N=3)，定量限為0.943 pg/μL(S/N=10)。兩者相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=3)均小于4%(見圖7)，表明該方法有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

圖7 吲哚-3-乙酸(IAA)和脫落酸(ABA)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以荔枝花后25 d幼果為材料，進(jìn)行處理前加標(biāo)回收率試驗(yàn)，每組添加水平重復(fù)3次。低中高3種添加水平(IAA的添加水平為50、200、400 ng/g，ABA的添加水平為100、1 000、2 000)的加標(biāo)回收率結(jié)果顯示，IAA平均加標(biāo)回收率為84.1%，ABA平均加標(biāo)回收率為78.33%。

2.5 方法驗(yàn)證

采用建立的UPLC—MS/MS方法，分析測(cè)定了25 d幼果及果實(shí)快速膨大期間(采前約1個(gè)月)果皮、果肉和種子中的IAA和ABA含量，內(nèi)標(biāo)回收率達(dá)到52.82%～83.15%。發(fā)現(xiàn)幼果IAA含量為207.55 ng/g，ABA含量為1 173.83 ng/g，與周碧燕等[9]采用酶聯(lián)免疫方法測(cè)得的幼果數(shù)據(jù)差別較大(IAA為26 000～70 000 ng/g，ABA為1 600～5 500 ng/g)。果實(shí)快速膨大期果肉中IAA含量極低，只有6.31 ng/g，顯著低于果皮和種子中IAA含量；但ABA含量極高，為1 543.77 ng/g，顯著高于果皮和種子。果皮和種子IAA和ABA含量差異均不顯著(見表3)，而周碧燕等[9]測(cè)定的采前1個(gè)月果皮和種子IAA含量差異小，ABA含量差異大。

表3 “懷枝”荔枝幼果及果皮、果肉和種子中吲哚-3-乙酸(IAA)和脫落酸(ABA)含量比較

3 結(jié)論與討論

定量測(cè)定荔枝果實(shí)內(nèi)源激素主要采用酶聯(lián)免疫、高壓液相色譜或氣相色譜等方法，測(cè)定結(jié)果存在很大差異。周碧燕等[9]采用酶聯(lián)免疫方法測(cè)得謝花后80 d內(nèi)正常發(fā)育的“無核荔”果實(shí)IAA約為4 400～70 000 ng/g，ABA約為2 600～16 000 ng/g;但李偉才等[10]采用高效液相方法測(cè)得謝花后70 d內(nèi)正常發(fā)育的“無核荔”果實(shí)IAA為 5～70 ng/g，ABA為2 000～9 000 ng/g。說明這兩種方法測(cè)定結(jié)果差異巨大，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性差。液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)因具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、速度快且無需復(fù)雜衍生前處理，以及能同時(shí)定量多種激素等優(yōu)勢(shì)，目前已成為植物內(nèi)源激素檢測(cè)主流方法[17]。在荔枝內(nèi)源激素的定量檢測(cè)中，檢測(cè)儀器、定量方法和前處理技術(shù)都是決定精確檢測(cè)荔枝樣品中IAA和ABA含量的重要因素。本研究中優(yōu)化采用內(nèi)標(biāo)法，可以校正基質(zhì)效應(yīng)，以及折算前處理的損失，定量的可靠性比外標(biāo)法高。內(nèi)標(biāo)法對(duì)內(nèi)標(biāo)物的選擇要求很高，一般會(huì)選擇其同位素做內(nèi)標(biāo)物。本研究IAA內(nèi)標(biāo)選擇13C6-IAA，其相比于其他氘標(biāo)記的同位素IAA更加穩(wěn)定，在經(jīng)過質(zhì)譜碎裂后不會(huì)出現(xiàn)同位素丟失現(xiàn)象[18]，Barkawi等[19]以13C6-IAA作為內(nèi)標(biāo)精確定量了擬南芥中IAA的含量。

材料前處理是最關(guān)鍵的一步，荔枝含有豐富的糖、酚類，在空氣中極易氧化褐變，其性質(zhì)就決定了荔枝內(nèi)源激素樣品提取的難度。在荔枝樣品前處理方法探索中，使用液液萃取作為純化和富集的主要技術(shù)，這不僅簡(jiǎn)化步驟，而且節(jié)約成本。采用鄧文紅等[16]提取定量分析油蒿葉片4種內(nèi)源激素的前處理方法，結(jié)果顯示兩種激素均出現(xiàn)峰形不完整、裂峰、雜峰等情況，無法定量。說明不同植物樣品通過相同提取液所得的初提取液基質(zhì)不一樣，經(jīng)過同樣的純化步驟可能無法保證樣品純度，再者不同植物樣品內(nèi)源激素含量差異大，因此，同樣的方法無法在不同植物樣品得到滿意結(jié)果。

IAA和ABA都是酸性內(nèi)源激素，其pKa值分別為4.75和4.8，除色純化步驟可以根據(jù)兩種內(nèi)源激素的pKa值，將提取液pH值調(diào)整到8～9，使兩者均以離子形態(tài)存于水中而減少被石油醚萃取損失；而當(dāng)用乙酸乙酯萃取時(shí)，又調(diào)pH值到2～3，使兩者以分子形式存在，盡可能被乙酸乙酯萃取，因此可以通過調(diào)節(jié)溶液的pH值來改變內(nèi)源激素IAA和ABA兩種物質(zhì)在提取液中的存在狀態(tài)，從而提高回收率且減少損失。吳耕西等[20]測(cè)定蘋果葉片中IAA和ABA也是采用這種方式，達(dá)到了純化和富集目的。

通過一系列的條件優(yōu)化，最后建立同時(shí)分析測(cè)定荔枝果實(shí)中IAA和ABA兩種內(nèi)源激素的方法。即樣品經(jīng)預(yù)冷的80%丙酮常規(guī)振蕩浸提，石油醚純化(純化前調(diào)pH值至8～9)，乙酸乙酯萃取(加萃取劑前調(diào)pH值至2～3)，氮吹儀濃縮，80%甲醇復(fù)溶，反相C18柱分離，流動(dòng)相為0.1% 甲酸水和0.1%甲酸乙腈，梯度洗脫，添加同位素13C6-IAA和D6-ABA做內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果顯示，兩種激素及其內(nèi)標(biāo)物峰形較好，保留時(shí)間穩(wěn)定。IAA檢出限為0.283 pg/μL，定量限為0.339 pg/μL，平均加標(biāo)回收率達(dá)到84.17%；ABA檢出限為0.102 pg/μL，定量限為0.943 pg/μL，平均加標(biāo)回收率達(dá)到78.33%。對(duì)實(shí)際樣品中IAA和ABA進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.75%和1.38%，說明該方法精確、快速、試驗(yàn)重現(xiàn)性好，適用于荔枝各組織中內(nèi)源激素含量的檢測(cè)。