余金珂，婁兵海，陽廷密，宋雅琴，李怡杰，豆 威，王進(jìn)軍

(1 廣西柑桔育種與栽培工程技術(shù)研究中心/廣西特色作物研究院，廣西桂林，541004； 2 重慶市潼南區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會(huì)，重慶，402660；3 西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，重慶，400715)

亞洲柑桔木虱Diaphorinacitri(以下簡稱柑桔木虱)屬半翅目Hemiptera，木虱科Psyllidae，不僅會(huì)吸食柑桔汁液和分泌蜜露造成煤污病，還能傳播柑桔黃龍病。因其體型小，繁殖能力快，世代重疊嚴(yán)重，以及生產(chǎn)中不合理施藥，柑桔木虱的抗藥性迅速增加[1]。生防真菌不易誘導(dǎo)害蟲產(chǎn)生抗性，且廣泛存在于自然界中，可安全、環(huán)保地防治害蟲[2]?，F(xiàn)已報(bào)道柑桔木虱的病原真菌，包括玫煙色擬青霉Isaria(Paecilomyces)fumosorosea、蠟蚧輪枝菌Lecanicilliumlecanii[3-7]、球孢白僵菌Beauveriabassiana、檬形被毛孢Hirsutellacitriformis[8-9]和綠僵菌Metarhiziumanisopliae等[10]，暫無棘孢曲霉Aspergillusaculeatus防治柑桔木虱的報(bào)道。本研究在田間死亡的柑桔木虱僵蟲上分離獲得1株曲霉，經(jīng)鑒定為棘孢曲霉，并對其生防效果進(jìn)行了測定，研究結(jié)果可為柑桔木虱的生物防治提供更多的選擇。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株與昆蟲：菌株來源于筆者在桂林市陽朔縣田間發(fā)現(xiàn)的僵死柑桔木虱成蟲，經(jīng)分離純化后，初步鑒定其為一種曲霉，命名為曲霉YS-1。試驗(yàn)所用曲霉YS-1均經(jīng)接種柑桔木虱復(fù)壯保存所得。供試?yán)ハx為柑桔木虱成蟲，全部采自桂林市雁山區(qū)附近失管柑桔園。

主要試劑：PDA培養(yǎng)基DifcoTM，美國BD公司；真菌基因組DNA快速提取試劑盒，北京華越洋生物科技有限公司；QIAquick Gel Extraction Kit，QIAGEN公司；TaKaRaTaqHot Start Version Kit，TaKaRa公司；引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)由上海生工生物工程股份有限公司合成。

主要儀器：常規(guī)PCR儀T100TMThermal Cycler，Bio-Rad 公司；超景深三維顯微鏡系統(tǒng)，日本基恩士；噴霧塔SOP-E-027，BURKARD POTTER；人工氣候箱RXZ-280B-LED，寧波江南儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 分生孢子液的制備 曲霉YS-1復(fù)壯后，用無菌刮孢器把分生孢子從PDA培養(yǎng)基上刮下，在4 ℃冷藏備用。使用前先溶于0.05%吐溫-80中，再用磁力攪拌器攪拌30 min后過濾，制成分生孢子母液。母液濃度用血球計(jì)數(shù)板確定。試驗(yàn)所用孢子溶液均由母液經(jīng)0.05%吐溫-80逐級(jí)稀釋獲得。每次使用前取5 μL分生孢子母液滴入PDA培養(yǎng)基，放置于培養(yǎng)箱[溫度(26±1)℃，相對濕度(80±5)%，光照L12∶D12]中12 h后，用顯微鏡檢測孢子萌發(fā)情況。每次檢測100個(gè)孢子，芽管明顯可見的視為萌發(fā)。重復(fù)3次。試驗(yàn)所用孢子的萌發(fā)率均高于90%。

1.2.2 科赫法則檢測 將柑桔木虱置于-20 ℃冷凍2 min后放置于裝有冰塊的培養(yǎng)皿上，用噴霧塔(0.2 bar，1 mL)將孢子濃度為1×107個(gè)/mL的分生孢子液噴灑于試蟲體表。處理后的試蟲放置于裝有新鮮柑桔葉的一次性塑料杯中，并放入恒溫培養(yǎng)箱[溫度(26 ± 1)℃，相對濕度(80 ± 5)%，光照L12∶D12]。處理和對照每組所用試蟲數(shù)均為30頭。將死亡試蟲放入裝有濕潤濾紙的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)保濕培養(yǎng)5～8 d，培養(yǎng)溫度為(26 ±1)℃，用超景深顯微鏡觀察死蟲菌絲孢子生長情況，并將試蟲身上長出的菌絲孢子分離純化后進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。用上述在死蟲上分離的真菌以同樣的方法再次接種柑桔木虱，記錄僵蟲菌絲與孢子生長情況，再次在PDA培養(yǎng)基上分離純化后觀察菌的形態(tài)。

1.2.3 真菌鑒定 宏觀形態(tài)學(xué)觀察：在超凈工作臺(tái)中，將曲霉YS-1的分生孢子以單點(diǎn)的形式接種到PDA培養(yǎng)基上，放置在(25 ± 1)℃培養(yǎng)箱中5 d后觀察，并拍照記錄。

微觀形態(tài)學(xué)觀察：取少量菌絲置于裝有0.05%吐溫-80的1.5 mL離心管中，利用渦旋儀振動(dòng)洗脫孢子梗上的孢子。取洗脫后的菌絲和孢子于載玻片上制片，用超景深三維顯微鏡系統(tǒng)鏡檢記錄。

rDNA-ITS序列分析：取0.5 g菌絲，液氮處理研磨后，用真菌基因組DNA快速提取試劑盒提取DNA，并用真菌核糖體DNA區(qū)域通用引物ITS1和ITS4對提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL：ddH2O 17.4 μL，10 × PCR Buffer 2.5 μL，5 U/μL熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶0.1 μL，2.5 mmol/L dNTP mixture 2 μL，5 μmol/L ITS1 1 μL，5 μmol/L ITS4 1 μL，DNA模板1 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，52 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)QIAquick Gel Extraction Kit試劑盒純化回收后，送上海生工生物工程有限公司測序。測序結(jié)果進(jìn)行在線Nucleotide BLAST比對，并利用MEGA5.0鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 毒力測定 將制備好的分生孢子母液稀釋為1×107、5×106、1×106、5×105和1×105個(gè)/mL共5個(gè)濃度，孢子液噴灑于柑桔木虱體表，然后將其飼養(yǎng)于裝有新鮮柑桔葉的一次性塑料杯中，并放置于恒溫培養(yǎng)箱[溫度(26±1)℃，相對濕度(80±5)%，光照L12∶D12]。處理和對照每組所用的試蟲均為25頭。每隔12 h記錄一次死蟲數(shù)，連續(xù)記錄5 d，最后記錄存活蟲數(shù)。調(diào)查結(jié)束后將死蟲挑出，放在有濕濾紙的培養(yǎng)皿中保濕保存，8 d后觀察記錄僵蟲數(shù)。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，以0.05%吐溫-80溶液為對照。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 22.0軟件的Probit處理，將濃度轉(zhuǎn)化為對數(shù)值，以x表示；將死亡率轉(zhuǎn)化為概率值，以y表示，求出截距a和斜率b，得出毒力回歸方程。用僵蟲數(shù)除以處理中的死蟲總數(shù)得到僵蟲率。

2 結(jié)果與分析

2.1 科赫法則驗(yàn)證

利用噴霧法將曲霉YS-1接種于健康柑桔木虱成蟲上，待試蟲死后將其放在含濕潤濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，(26±1) ℃培養(yǎng)5～8 d后，蟲體長出菌絲和孢子(見圖1)。對試蟲尸體上長出的菌物再分離純化，并制成分生孢子懸浮液對健康試蟲噴霧處理，待試蟲死亡，死蟲經(jīng)保濕處理后，長出相似真菌，經(jīng)過分離純化得到與曲霉YS-1形態(tài)一致的真菌。上述結(jié)果表明，曲霉YS-1為柑桔木虱的病原真菌。

圖1 柑桔木虱被曲霉YS-1侵染后形成的僵蟲

2.2 分子鑒定與形態(tài)觀察

將擴(kuò)增測序獲得的曲霉YS-1 ITS序列進(jìn)行在線Nucleotide BLAST比對的結(jié)果表明，YS-1與棘孢曲霉A.aculeatus及該種真菌的多個(gè)分離株序列相似性達(dá)99%～100%。針對已知曲霉屬中蟲生真菌相關(guān)種[11-14]和曲霉YS-1的同源模式菌，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果表明，A.aculeatus(NR111412.1)與曲霉YS-1聚在同一分支上，且同源性達(dá)100%(見圖2)。

注：采用鄰接法(NJ)構(gòu)建進(jìn)化樹，每個(gè)菌株后面編號(hào)為其在基因庫中的登錄號(hào)。

形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，在26 ℃下，曲霉YS-1在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后，具同心圓環(huán)，菌絲為白色，分生孢子為棕褐色，質(zhì)地絲絨狀(見圖3 A)。通過超景深三維顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，分生孢子為球形，分生孢子柱頭為球形輻射狀(圖3 B和C)。上述形態(tài)特征符合棘孢曲霉的形態(tài)學(xué)描述[15]。因此，結(jié)合分子鑒定及形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，確認(rèn)該真菌為棘孢曲霉，命名為棘孢曲霉YS-1。

注：A為形態(tài)菌落，B、C為超景深顯微鏡視野下的分生孢子。

2.3 曲霉YS-1對柑桔木虱的毒力測定

試驗(yàn)結(jié)果看出，隨著曲霉YS-1分生孢子濃度增加，試蟲死亡率逐漸增加(見圖4)。

圖4 不同濃度曲霉YS-1分生孢子液處理下柑桔木虱死亡率的變化

曲霉YS-1處理試蟲5 d的毒力回歸方程及相關(guān)系數(shù)(見表1)，LC50為3.017×106個(gè)/mL。1×107個(gè)/mL曲霉YS-1孢子懸浮液處理試蟲，5 d后的校正死亡率為71.4%。在所有的死蟲中，僵蟲率為88.1%。

表1 曲霉YS-1對柑桔木虱的毒力(5 d)

3 討論

柑桔木虱可傳播柑桔黃龍病菌，嚴(yán)重威脅柑桔產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。隨著柑桔木虱的抗藥性增加以及農(nóng)藥減量政策的推進(jìn)，加強(qiáng)生防真菌資源的挖掘十分重要。生防真菌的種類多樣，其中，曲霉屬Aspergillus蟲生真菌種類有黃曲霉A.flavus、寄生曲霉A.parasiticus、米曲霉A.oryzae、溜曲霉A.tamarii、棕曲霉A.ochraceus、黑曲霉A.niger和亮白曲霉A.candidus[15]。此外，有研究者從田間柑桔木虱蟲體上分離得到日本曲霉A.japonica和韋斯特迪克氏曲霉A.westerdijkiae，其中，韋斯特迪克氏曲霉具有高致病性[12，13]。本研究結(jié)果顯示，從田間柑桔木虱僵蟲上分離純化出的真菌是棘孢曲霉A.aculeatus，且為柑桔木虱的病原真菌。由于棘孢曲霉對柑桔木虱具有較強(qiáng)的毒力，因此有望成為一種新型殺蟲真菌。棘孢曲霉常存在于土壤中，未被報(bào)道用于害蟲防治，因此在實(shí)際田間應(yīng)用前，需要試驗(yàn)驗(yàn)證其在田間的實(shí)際防效，同時(shí)應(yīng)評估該類真菌是否會(huì)產(chǎn)生對人畜有害的物質(zhì)，以及其對環(huán)境和生態(tài)是否有負(fù)面影響。