沈 曄,錢芳波,司雯淼,袁文博,張 怡,徐 曄

(1.南京醫(yī)科大學附屬無錫婦幼保健院計劃生育科，無錫 214000；2.浙江博圣生物技術股份有限公司，杭州 310012；3.新西蘭奧克蘭大學，奧克蘭 1142)

研究報道，女性發(fā)生1次自然流產的風險約為10%，復發(fā)性流產的發(fā)生率為1%～5%[1]。流產與染色體異常、免疫、易栓癥(血栓前狀態(tài))、內分泌、感染、母體及環(huán)境等因素相關，其中約50%流產與染色體異常有關[2-3]。染色體異常主要包括數(shù)目異常(非整倍體、多倍體異常)、結構畸變、嵌合體以及雜合性缺失等?？截悢?shù)變異(copy number variations,CNVs)是指染色體上大于1kb的DNA片段的增加或減少[4]，致病性CNVs可導致基因組病，從而引起流產、死胎、發(fā)育滯后、多發(fā)畸形等[5]。染色體微陣列分析技術(chromosomal microarray analysis,CMA)在全基因組水平檢測染色體數(shù)目異常、CNVs、大多數(shù)的雜合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)和一定水平的嵌合體，檢測范圍較廣。本研究對673例流產樣本進行CMA檢測，探討CMA技術在流產或死胎遺傳學診斷的應用價值及流產或死胎頻率和母體年齡與染色體異常的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2016年10月至2020年5月無錫市婦幼保健院就診的673例患者的流產樣本(568例流產絨毛、55例流產組織、49例引產羊水和1例引產臍血)，患者年齡22～45歲，孕周6～28周。本研究經無錫市婦幼保健院倫理委員會審批通過，患者全部知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法 采用組織提取試劑盒(德國QIAGEN公司)提取流產標本基因組DNA，用CytoScan 750k(美國Affymetrix公司)單核苷酸多態(tài)性微陣列芯片(single nucleotide polymorphism array，SNP array)進行檢測，通過對基因組DNA酶切消化、PCR擴增、磁珠純化、片段化、添加生物素標記、芯片雜交、洗脫、染色和掃描，利用Chromosome Analysis Suite軟件及相關生物信息學方法比對GRCH37(hg19)分析原始數(shù)據(jù)，報告閾值為200kb以上的重復和100kb以上的缺失，不報告已知屬于正常多態(tài)的拷貝數(shù)變化。

2 結 果

2.1 染色體異常類型分布 673例樣本中有9例樣本存在嚴重的母血污染或DNA降解導致質控不達標，其余664例樣本檢測成功，檢測成功率為98.7%(664/673)。染色體正常276例(41.6%，276/664)，其中男性占53.6%(148/276)，女性占46.4%(128/276)，男女比例為1.16。染色體異常388例(41.6%，388/664)，包括非整倍體變異、整倍體變異、結構異常、雜合性缺失(LOH)。非整倍體變異(含嵌合體)占比最大，共271例(40.8%，271/664)；整倍體變異48例(7.2%，48/664)；結構變異75例(11.3%，75/664);LOH共11例(1.7%，11/664)。詳細的CMA結果匯總如圖1。

圖1 染色體微陣列分析的結果匯總

2.2 染色體數(shù)目異常 本研究共發(fā)現(xiàn)271例(40.8%，271/664)非整倍體，包括260例單一染色體非整倍體和11例合并多個染色體的非整倍體。除染色體1、Y外，所有染色體都鑒定出了非整倍體。單一染色體非整倍體多為染色體三體(77.7%，202/260)，其余為染色體單體(22.3%，58/260)，其中1例21號染色體單體，1例嵌合型14號染色體單體，其余全部為X單體，即特納綜合癥(45,X)患者。在11例多重非整倍體的病例中，包括5例(2.2%)發(fā)生了兩個染色體三體，5例(1.8%)發(fā)生了三個染色體三體和1例49,XXXXY。染色體非整倍體異常分布見圖2。整倍體變異共檢出48例(7.2%,48/664)，全部為三倍體。

2.3 染色體結構異常 本研究共檢出染色體結構異常75例(11.3%,75/664)，片段大小在106.4kb至105.2Mb之間，其中25例(3.8%,25/664)存在≥10Mb的缺失或重復，50例(7.5%，50/664)存在<10Mb的微缺失或微重復。在染色體結構異常的病例中，有31例CNV偏致病性的可能性大，占結構異常的41.3%(31/75)。根據(jù)CNVs的大小和位置，建議對夫婦進行進一步相應的遺傳學檢查。其中有24例病例做了相應的父母驗證(表1)，其中病例199的父親被確認為相互平衡易位攜帶者，F(xiàn)ISH驗證見圖3，該患者為1號染色體長臂末端片段與19號染色體短臂末端片段易位的攜帶者，另外6例CNV被確定遺傳自父母一人，其余病例的CNV來源均被認為是新發(fā)。

圖2 首次流產和復發(fā)性(≥2)流產患者非整倍體中各染色體占比

圖3 病例199父源的FISH驗證結果

表1 染色體結構異常做父母驗證的結果

2.4 純合區(qū)域 664例樣本中有11例(1.7%,11/664)出現(xiàn)了LOH(表2)，其中3例為全基因組UPD(uniparental disomy)，3例為單條染色體UPD，5例為區(qū)域性UPD。

2.5 流產次數(shù)和年齡與染色體異常的關系 將單核苷酸多態(tài)性微陣列芯片結果分為首次流產(spontaneous abortion，SA)和復發(fā)性流產(recurrent miscarriage，RM)。本研究的復發(fā)性流產定義為兩次或兩次以上的流產或胎停。SA組和RM組微陣列芯片的檢出率比較見表3。根據(jù)母親的年齡對結果進行分析，染色體異常在高齡產婦(≥35歲)與低齡產婦(<35歲)的分布情況見表4。

表2 11例涉及雜合性缺失的結果

表3 流產次數(shù)與流產物染色體異常的關系

表4 母親年齡與流產物染色體異常的關系

3 討 論

本研究檢測成功的664例標本中，染色體異?？倷z出率為58.4%(388/664)，與之前研究報道的57.9%基本相符[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，染色體異常占比最大的是非整倍體(40.8%)，證實了染色體非整倍體變異是引起臨床流產或死胎的最主要遺傳因素[7]。其次是染色體結構異常(11.3%,75/664)，多倍體異常(7.2%,48/664)占染色體異常的第三大比例，染色體異常比例最小的為雜合性缺失(1.7%，11/664)。

本次研究的非整倍體和多倍體的頻率(40.8%和7.2%)與其他大規(guī)模研究的頻率(40%和7.5%)[6]相似。非整倍體異常中，16號染色體三體和特納綜合癥(45,X)數(shù)量最多，均為56例，分別占染色體數(shù)目異常的20.7%(56/271)，是最常見的非整倍體數(shù)目異常。其余異常主要集中在13、14、21、22三體，這與肖艷華等[8]報道基本一致。除染色體1、Y外，所有染色體都鑒定出了非整倍體。其中1號染色體占人類基因組全長的8%，發(fā)生數(shù)目異常將導致嚴重的胚胎畸形，基本在妊娠4周內流產，故很難在流產物遺傳學檢測中發(fā)現(xiàn)[9]。染色體非整倍體胎兒形成主要原因是精子或卵子在減數(shù)分裂時，同源染色體或姐妹染色單體不分離，當這種異常的配子形成受精卵就會導致非整倍體異常的發(fā)生。對于流產物遺傳學檢測報告結果為13、14、15、21、22號染色體三體或單體時，一般建議其父母進行染色體核型分析，以排除親本存在染色體羅氏易位的可能性[10]。據(jù)報道羅氏易位的人群攜帶率為1.23‰[11]，本次研究暫未發(fā)現(xiàn)羅氏易位的攜帶者。

CNVs是產前超聲異常、多發(fā)畸形、智力落后、發(fā)育遲緩的重要原因[12]，現(xiàn)也被認為可能導致流產、死胎。CNVs常表現(xiàn)為染色體的缺失和重復，通過基因劑量改變、染色體斷裂等方式影響基因的表達，從而產生致病性變異，嚴重可導致流產或胎停。對于CNVs致病性的判讀，常需考慮CNVs所包含基因的數(shù)目、功能及非編碼區(qū)重要的調控元件等來判斷致病性等級，同時還需參考數(shù)據(jù)庫、正常人群中出現(xiàn)類似CNVs的頻率、變異來源等進行綜合分析。根據(jù)2019年ClinGen/ACMG拷貝數(shù)變異解讀標準，將CNVs按五級分類系統(tǒng)進行分類，分別為致病變異、疑似致病變異、臨床意義未明變異、疑似良性變異、良性變異。

本研究共檢出75例CNVs，片段大小106.4kb～105.2Mb，通過致病性判讀發(fā)現(xiàn)31例(4.7%，31/664)CNVs涉及大量功能基因，致病性可能性較高，19例(2.9%，19/664)疑似致病變異，23例(3.5%，23/664)臨床意義不明變異，2例(0.3%，2/664)疑似良性變異。不平衡易位被定義為一個染色體的末端存在缺失，同時另一個染色體的末端存在重復，本研究中有4例發(fā)生了不平衡易位。本研究中，可能來源于親本染色體平衡重排的染色體不平衡重排的頻率(0.6%，4/664)與之前的研究(0.6%，12/1861)[13]相似，其中1例經FISH驗證明確來源于父源的平衡易位。因此CNVs發(fā)生在染色體末端時，父母之一可能是該變異片段平衡易位的攜帶者，建議對夫婦進行核型或FISH等相應的遺傳學檢查；而對于非染色體末端的微缺失微重復，大多數(shù)為新發(fā)變異，少數(shù)遺傳自父母。

在這些CNVs中值得注意的是，1p36微缺失出現(xiàn)了5次(0.75%，5/664)，大小1.75Mb～9.21Mb，4例確定為新發(fā)變異，1例未知。1p36缺失綜合征缺失片段介于1p36.13～1p36.33，其發(fā)生率為1/5000～1/10000，此類患者一般具有不同程度的智力障礙、結構性心臟缺陷、顏面部異常(如眼睛凹陷)及其他并發(fā)癥[14-15]。已有多篇文章對于產前和產后的1p36缺失進行了報道[14,16]，但對于流產物遺傳學檢測發(fā)現(xiàn)1p36缺失的報道不多。本研究流產物遺傳學研究中1p36缺失出現(xiàn)了5次，因此，1p36缺失可能與流產或胎停有關。導致胚胎早期死亡的可能潛在機制是由1p36缺失導致的畸形胎兒心臟異常、腦發(fā)育異常有關，具體致病機理有待進一步研究。

此外，本次研究還檢測出11例(1.7%，11/664)LOH，與Wang等[6]研究的1.9%基本一致，高于用其他平臺檢測LOH檢出率為0.7%[17]，表明SNP-array可更好地檢出LOH。研究表明，接近3%染色體核型無異常的妊娠失敗與全基因組UPD相關[18]。由于技術的局限性，CMA只能檢測出等單親二倍體。目前已知母源的7、14和15號染色體及父源的6、11、14和15號染色體的UPD可導致臨床的異常表型，也有少數(shù)涉及母源的2、16和20號染色體及父源的20號染色體UPD表征異常的病例報道[19]，CMA可以通過父母的SNP微陣列結果對比確定親本起源。本研究中單一染色體UPD與區(qū)域性UPD是否攜帶有與遺傳印記(imprinting)相關的基因尚不完全清楚。該區(qū)域相關隱性致病基因變異的檢測有助于確認是否有導致胎兒嚴重結構畸形甚至致死性基因。

對于LOH的解讀原則大致有四種：(1)血源同一，這是由于父母是遠親關系，在基因組中常表現(xiàn)為小的LOH分散在少數(shù)幾條染色體上面；(2)近親關系，這是由于父母親緣關系較近，在基因組中表現(xiàn)為許多染色體上面有較大的LOH片段，這樣會增加隱性遺傳病的發(fā)生風險[20]；(3)LOH發(fā)生在整條染色體或某一染色體部分區(qū)域，主要產生機制有受精后分裂錯誤、配子互補、三體拯救及單體拯救等。依據(jù)不同的產生機制，可以形成完全性或嵌合性的整條或區(qū)段單親二倍體；(4)全基因組UPD，一般是由孤雌生殖或孤雄生殖引起的，全基因組UPD是無法正常發(fā)育，在早孕期自然流產，本研究檢出3例全基因組單親二倍體。

常規(guī)核型分析、基于微陣列的比較基因組雜交(array-based comparative genomic hybridization,aCGH)[21]、低深度高通量測序(copy number variation sequencing,CNV-seq)[10]等都無法檢測單親二倍體，而單核苷酸多態(tài)性微陣列芯片不但可進行染色體劑量的檢測，還能對單核苷酸多態(tài)性位點進行分型檢測，故其能檢出單親二倍體，體現(xiàn)了單核苷酸多態(tài)性微陣列芯片的獨特優(yōu)勢。

目前，在國內復發(fā)性流產仍定義為同一夫妻發(fā)生3次或3次以上在妊娠28周之前的流產或胎停[22]。由于我國現(xiàn)階段生育年齡延遲、計劃生育政策改變，高齡孕婦越來越多，流產再發(fā)風險也相應增加。同時有研究發(fā)現(xiàn)自然流產2次和3次者的病因構成比相似[23]。近年來大多數(shù)專家認為將連續(xù)兩次的自然流產定義為復發(fā)性流產。本研究中，比較了首次流產和2次及2次以上流產者的染色體異常發(fā)生頻率和分布，發(fā)現(xiàn)兩組間沒有顯著差異，這與Wang等[6]研究結果一致，提示染色體異常的頻率和分布與流產的頻率無關。因此，建議在臨床實踐中，無論是首次還是復發(fā)性流產，如需要查明流產原因,應對妊娠產物標本做CMA分析。

此外，本結果還顯示，高齡(≥35歲)產婦組染色體總異常的頻率明顯高于低齡(<35歲)產婦組，這與Wang等[6]研究結果一致。非整倍體發(fā)生頻率在高齡產婦組明顯高于年輕產婦組，而其他染色體異常的頻率在兩組間無顯著差異。表明胚胎非整倍體的發(fā)生率隨母體年齡的增加而增加，而多倍體、染色體結構異常和UPD的發(fā)生率似乎與母體年齡無關。

綜上所述，SNP微陣列芯片是一種可靠、快速、高分辨率、全基因組水平的臨床妊娠流產的染色體檢測方法。SNP微陣列芯片可以同時檢測非整倍體、多倍體、亞顯微觀結構的染色體拷貝數(shù)變異以及LOH，提高了流產物遺傳學檢測中染色體異常的檢出率?？傊?，SNP微陣列分析是確定流產遺傳病因的一種有價值的方法。