薄 云,劉 嘉,周 敏

(1.云南省第一人民醫(yī)院 a.麻醉科;b.婦產(chǎn)科，昆明 650100；2.昆明理工大學附屬醫(yī)院 a.麻醉科;b.婦產(chǎn)科，昆明 650012；3.昆明醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院麻醉科，昆明 650012)

宮頸癌是一種發(fā)生于宮頸上皮的婦科惡性腫瘤，發(fā)病率位居女性腫瘤第二位，僅次于乳腺癌[1]。據(jù)WHO統(tǒng)計，世界每年新增宮頸癌病例約50萬，其中約有30萬病例來源于經(jīng)濟落后國家或地區(qū)[2]。我國是宮頸癌高發(fā)國家，每年宮頸癌新發(fā)病例約13萬，約占世界宮頸癌年發(fā)病總數(shù)的1/4～1/3[3]。近年伴隨社會文化、飲食習慣及生活方式的改變，宮頸癌的發(fā)病率明顯上升，且呈現(xiàn)年輕化趨勢。有資料顯示，年輕女性宮頸癌發(fā)生率以每年2%～3%的速度迅速增長[3]。目前宮頸癌的治療方法主要包括手術治療、化療和放療，其中手術是治療宮頸癌最主要的方式。越來越多的證據(jù)表明，麻醉技術和其他圍術期因素是影響惡性腫瘤手術后長期轉(zhuǎn)歸的潛在因素[4]。近年來，隨著麻醉藥抗腫瘤的作用及機制正在被現(xiàn)代醫(yī)學工作者不斷的揭示，發(fā)現(xiàn)阿片類藥物能影響一些腫瘤細胞(如胃癌細胞、肺癌細胞)的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等[5-7]。芬太尼作為一款化學合成阿片類鎮(zhèn)痛藥被廣泛用于宮頸癌手術中。研究發(fā)現(xiàn)，芬太尼具有抑制胃癌細胞增殖轉(zhuǎn)移、肺癌細胞轉(zhuǎn)移的功能[7-8]，但是芬太尼對宮頸癌細胞的影響尚不得知。本研究以宮頸癌細胞系為研究對象，體外探究芬太尼對宮頸癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡的影響，為臨床宮頸癌手術治療時麻醉藥物的選擇提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 C33A細胞購于中國科學院細胞庫(中國上海)；芬太尼購自宜昌人福藥業(yè)；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基；CCK-8試劑盒購于MedChemExpress；Caspase 3、PARP1、MMP-2、MMP-9、N-cadherin、Akt、PI3K、p-Akt、p-PI3K及GAPDH抗體均購于Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及干預 C33A細胞在37℃、5% CO2、含10% FBS和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長狀況1～2天換一次液。將細胞分為對照組和芬太尼組，將對數(shù)生長期細胞按2×103/孔接種于96孔板，待細胞貼壁，芬太尼組細胞分別加終濃度為10nmol/L、100nmol/L、100nmol/L的芬太尼刺激，培養(yǎng)一定時間后對C33A細胞進行增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡檢測。

1.2.2 CCK-8檢測細胞增殖 取不同培養(yǎng)時間(0h、24h、48h、72h)細胞，使用CCK-8試劑盒檢測各組C33A細胞增殖情況。具體步驟：將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞接種到96孔板，待細胞生長80%時，每孔加10μL CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h，用酶標儀測定450nm處的吸光度值。

1.2.3 細胞周期檢測 取對數(shù)生長期細胞，用胰蛋白酶消化并混勻，按2×105細胞/孔鋪于6孔板，培養(yǎng)12h,待細胞貼壁，加相應濃度的LukS-PV，繼續(xù)培養(yǎng)24h，用胰蛋白酶消化細胞，1000r/min離心5min，收集細胞，用PBS洗滌2次，4℃條件下用70%乙醇過夜固定，用PBS洗滌2次，加0.5mL的PI/RNase staining染液，避光室溫孵育30min，上機檢測。

1.2.4 Transwell法檢測細胞遷移能力 取Transwell 48孔培養(yǎng)板(孔徑8μm，購于康寧公司)，下室加1mL含10% FBS和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，上室加0.5mL含10% FBS和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液的C33A細胞懸液，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)12h，取上室濾膜和下室培養(yǎng)基，對濾膜進行結晶紫，顯微鏡下觀察濾膜下側細胞數(shù)；使用Muse Cell Analyer全能細胞狀態(tài)分析儀(默克密理博公司)對下室培養(yǎng)基中細胞數(shù)進行計數(shù)。

1.2.5 細胞凋亡檢測 收集干預48h后C33A細胞，立即使用Annexin Ⅴ-PI凋亡染色試劑盒對各組細胞進行染色；使用流式細胞儀(BD公司，Aria II)對細胞凋亡情況進行分析，采用固定流速(6mL/min)，收集1min，Q1+Q2+Q3門的細胞即為發(fā)生凋亡的細胞。

1.2.6 Real-time PCR 收集干預48h后C33A細胞，Trizol法提取細胞中RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，Real-time PCR法檢測細胞中MMP-2、MMP-9、N-cadherin mRNA表達水平，以GAPDH作為內(nèi)參。MMP-2引物：上游5'-AGCCCGGAAGATATCGTTGA-3'，下游5'-GTGAACGCCTGGTAGCAATA-3'；MMP-9引物：上游5'-CACCTATGGCATATAGGAGG-3'，下游5'-AGAGGTTCGGTCTAAGCAAC-3'；N-cadherin引物：上游5'-CCGGCGTTATCTGCGATG-3'，下游5'-CTCTAGCAGGGAGGAGACTATTG-3'；GAPDH引物：上游5'-CCGGCTCGCTTAGCACA-3'，下游5'-AACACGGCGTAATTCGCTTT-3'。

1.2.7 Western blot檢測 收集干預48h后C33A細胞，加1mL RIPA裂解液，使用組織勻漿機對細胞進行勻漿，勻漿后的細胞放于冰上裂解5min，4℃、12000g離心5min，取上清。往上清液中加loading buffer(上清液體積：loading buffer體積=4∶1)；SDS-PAGE跑膠、轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)印蛋白的膜用5%脫脂奶粉37℃封閉2h，抗人Caspase 3抗體(1∶1000)、PARP-1抗體(1∶1000)、GAPDH(1∶1000)抗體、MMP-2抗體(1∶1000)、N-cadherin抗體(1∶1000)、MMP-9抗體(1∶1000)、Akt抗體(1∶1000)、p-Akt抗體(1∶1000)、PI3K、p-PI3K(1∶1000)，4℃孵育12h(GAPDH、Caspase 3、PARP-1、MMP-2、MMP-9、Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K抗體均購于Abcam公司)。使用HRP標記的二抗37℃孵育1h，加ECL發(fā)光液曝光檢測。

2 結 果

2.1 芬太尼干預對宮頸癌細胞增殖的影響 相比于空白組，芬太尼刺激顯著減緩了C33A細胞增殖速度，且呈劑量依賴性(P<0.05)(圖1)。

圖1 芬太尼干預對C33A細胞增殖的影響**P<0.01 vs 空白組；#P<0.05 vs 芬太尼(10nmol/L)組；△P<0.05 vs 芬太尼(100nmol/L)組

2.2 芬太尼干預對宮頸癌細胞細胞周期的影響 流式細胞術檢測結果顯示，相比于空白組，不同濃度芬太尼刺激后，C33A細胞周期被阻滯在G1/G0期，且芬太尼濃度越高，阻滯在G1/G0期的細胞越多(P<0.05)(圖2)。Western blot法結果顯示，與空白組相比，芬太尼刺激降低C33A細胞內(nèi)Cyclin D1蛋白及CDK4蛋白表達量，且呈劑量依賴性(P<0.05)(圖3)。

2.3 芬太尼干預對宮頸癌細胞細胞遷移的影響 Transwell試驗結果顯示，相比于空白組，芬太尼組穿膜細胞數(shù)顯著減少，且呈劑量依賴性(P<0.05)(圖4)。

圖2 不同濃度芬太尼干預后C33A細胞周期分布占比**P<0.01 vs 空白組；#P<0.05 vs 芬太尼(10nmol/L)組；△P<0.05 vs 芬太尼(100nmol/L)組

圖3 芬太尼對C33A細胞周期調(diào)節(jié)蛋白Cyclin D1和CDK4表達的影響**P<0.01 vs 空白組；##P<0.01 vs 芬太尼(10nmol/L)組；△△P<0.01 vs 芬太尼(100nmol/L)組

圖4 不同濃度芬太尼干預對C33A細胞遷移的影響**P<0.01 vs 空白組；#P<0.05 vs 芬太尼(10nmol/L)組；△P<0.05 vs 芬太尼(100nmol/L)組

2.4 芬太尼干預對宮頸癌細胞MMP-2、MMP-9、N-cadherin表達的影響 Real-time PCR和Western blot法檢測結果顯示，芬太尼干預顯著降低C33A細胞內(nèi)MMP-2、MMP-9、N-cadherin的mRNA及蛋白表達水平(P<0.05)(圖5、6)，且呈劑量依賴性。

圖5 不同濃度芬太尼干預對C33A細胞MMP-2、MMP-9及N-cadherin mRNA表達的影響**P<0.01 vs 空白組；#P<0.05 vs 芬太尼(10nmol/L)組；△P<0.05 vs 芬太尼(100nmol/L)組

圖6 不同濃度芬太尼干預對C33A細胞MMP-2、MMP-9及N-cadherin蛋白表達的影響**P<0.01 vs 空白組；##P<0.01 vs 芬太尼(10nmol/L)組；△P<0.05，△△P<0.01 vs 芬太尼(100nmol/L)組

2.5 芬太尼干預對宮頸癌細胞凋亡的影響 流式細胞術及Western blot檢測結果顯示，相比于空白組，芬太尼顯著增加了C33A細胞凋亡率及活化PARP1、Caspase 3含量，且呈劑量依賴性(P<0.05)(圖7)。

2.6 芬太尼干預對宮頸癌細胞凋亡的影響 Western blot結果顯示，相比于空白組，芬太尼干預顯著降低C33A細胞內(nèi)PI3K和Akt磷酸化水平(P<0.05)(圖8)，且呈劑量依賴性。

圖7 不同濃度芬太尼干預對C33A細胞凋亡的影響A:Annexin V-PI染色定量結果；B:Western blot檢測;cl-PARP1：PARP1剪切片段；cl-Caspase 3：Caspase 3剪切片段;**P<0.01 vs 空白組；##P<0.01 vs 芬太尼(10nmol/L)組；△△P<0.01 vs 芬太尼(100nmol/L)組

圖8 不同濃度芬太尼干預對C33A細胞內(nèi)PI3K/Akt通路影響**P<0.01 vs 空白組；##P<0.01 vs 芬太尼(10nmol/L)組；△P<0.05，△△P<0.01 vs 芬太尼(100nmol/L)組

3 討 論

近年來麻醉藥抗腫瘤作用的研究逐漸增多，多數(shù)麻醉藥均能影響患者免疫系統(tǒng)功能和腫瘤細胞的活性，從而影響腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等。研究發(fā)現(xiàn)，阿片類藥物具有抑制腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移的功能[9-10]。芬太尼是一種廣泛用于手術和癌癥治療的麻醉劑，在許多癌癥中能抑制細胞的生存能力和入侵，如芬太尼抑制結腸直腸癌的轉(zhuǎn)移[11]，芬太尼通過調(diào)節(jié)NF-κB抑制胃癌細胞生長[12-13]，芬太尼干預能降低胰腺癌細胞和細胞移植小鼠的細胞生存能力和腫瘤生長[14]。本研究利用宮頸癌細胞系C33A，探究芬太尼對宮頸癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，芬太尼顯著抑制C33A細胞增殖生長，且呈劑量依賴性；芬太尼能將C33A細胞周期阻滯在G1/G0期，繼而抑制C33A的增殖。Cyclin D1，即G1/S-特異性周期蛋白-D1，這種亞型的周期蛋白與周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)形成復合物并作為它們的調(diào)節(jié)亞基，這兩種周期蛋白依賴性激酶對于G1到S期的轉(zhuǎn)變不可或缺，這種蛋白質(zhì)已被證明與腫瘤抑制蛋白Rb相互作用，并且這個基因被Rb積極調(diào)控表達。研究發(fā)現(xiàn)，該基因出現(xiàn)突變、擴增或過度表達會改變細胞周期進程，這些現(xiàn)象常發(fā)生在多種腫瘤中并可能導致腫瘤發(fā)生[15]。本研究進一步發(fā)現(xiàn)，芬太尼干預能劑量依賴性地抑制Cyclin D1、CDK4表達，表明芬太尼是通過抑制Cyclin D1、CDK4，繼而阻滯細胞周期，抑制細胞增殖生長。同時還發(fā)現(xiàn)，芬太尼干預能劑量依賴性地促進C33A細胞凋亡，分子層面促進凋亡蛋白PARP1和Caspase 3的活化，表明芬太尼干預能促進C33A細胞凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，芬太尼具有劑量依賴性抑制C33A細胞轉(zhuǎn)移的作用。腫瘤細胞遷移與ECM密切相關，ECM是一類由細胞合成，然后分泌到細胞外的大分子物質(zhì)，主要由細胞之間的基質(zhì)和基底膜構成，它能阻止腫瘤向遠處轉(zhuǎn)移[16]。MMPs的活動是在轉(zhuǎn)錄水平上精密調(diào)控的，主要以酶原的形式分泌到細胞外。當腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移時，首先激活前體酶原，特定細胞外基質(zhì)成分以及內(nèi)源性抑制劑相互作用，其活動控制喪失以后，MMPs和其組織抑制劑之間可能失去平衡[17]。此外，腫瘤在遷移與侵襲的過程中，常常伴隨上皮-間質(zhì)化轉(zhuǎn)變，它是上皮細胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細胞的過程，其中N-cadherin是間充質(zhì)細胞表型標志蛋白[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，芬太尼劑量依賴性降低細胞內(nèi)MMP-2、MMP-9及N-cadherin表達水平，表明過芬太尼能通過抑制C33A細胞轉(zhuǎn)化抑制細胞轉(zhuǎn)移。

信號轉(zhuǎn)導通路的異常改變是腫瘤細胞的重要生物學特性，其中PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路在維持細胞惡性生物學特性中起重要作用。細胞在一系列內(nèi)外因素的作用下，通過啟動PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路，誘導細胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移等[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，芬太尼能劑量依賴性地抑制PI3K及Akt磷酸化，表明芬太尼抑制C33A細胞增殖、轉(zhuǎn)移，促進C33A細胞凋亡與抑制PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路的激活有關。但有關后續(xù)動物實驗及芬太尼用于宮頸癌的相關臨床實驗仍處于籌備階段，有待后續(xù)完善并報道。

綜上所述，芬太尼具有抑制宮頸癌細胞增殖生長、分化轉(zhuǎn)移以及促進其凋亡的作用，其作用分子機制與抑制PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路激活有關。