劉進娜

氣虛是由于氣的推動、溫煦、防御、固攝和氣化作用減退引起的一系列病理變化，可伴隨多種病證的發(fā)生[1]。氣虛發(fā)熱多因飲食失節(jié)或勞倦過度、或久病耗傷等損傷脾氣伴有發(fā)熱癥的一種病證，常又謂之“脾虛發(fā)熱證”。脾虛發(fā)熱證臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱、少氣懶言、倦怠乏力、面色萎黃、腹脹納呆、形瘦、大便溏薄、舌淡苔白、脈緩弱等。圍繞“氣虛發(fā)熱”的發(fā)熱機制，歷代醫(yī)家各執(zhí)己見，眾說紛紜。其中較有代表性的論點有龔?fù)①t、柯琴的“脾胃虛弱、陰血不足”說；蒲輔周的“虛陽外越”致熱說；趙獻可、張介賓認(rèn)的“虛人外感”說[2]。李東垣《內(nèi)外傷辨惑論》認(rèn)為氣虛發(fā)熱是因脾虛不能升清，水谷精微等清氣反下流成濕，致濕氣閉塞下焦，郁久而化熱，即所謂“陰火上沖”說。從臨床實際來看，并非所有的脾虛患者都出現(xiàn)發(fā)熱，而脾虛發(fā)熱多見以脾胃氣虛日久或氣虛較重，不少患者同時伴有易感或勞累后易發(fā)熱等特點[3]，提示該證的病機中存在氣虛衛(wèi)外無能及“虛邪郁表”的病理。中醫(yī)藥治療發(fā)熱有較好效果，對于一些癌性發(fā)熱、術(shù)后發(fā)熱或不明原因發(fā)熱尤具優(yōu)勢。脾/氣虛發(fā)熱除了有體溫升高體征外，還伴有免疫力低下、能量代謝障礙和腸道內(nèi)分泌紊亂等表現(xiàn)[4]，大量臨床研究表明，基于中醫(yī)脾/氣虛發(fā)熱及“甘溫除熱”治法理論，辨證運用補中益氣湯治療多種非感染性發(fā)熱(如骨折、術(shù)后、產(chǎn)后、腫瘤晚期及艾滋病等)均有良好療效[5]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是將計算機技術(shù)與生物學(xué)協(xié)同應(yīng)用的新興學(xué)科，目前在中醫(yī)方面廣泛應(yīng)用其進行復(fù)方的相關(guān)藥理學(xué)的研究[6,7]。本研究將運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)的方法，通過構(gòu)建中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來預(yù)測補中益氣湯防治氣虛發(fā)熱證的潛在靶標(biāo)和作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采用TCMSP中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫分析平臺(http://www.snedu.gov.cn/)以補中益氣湯的8味中藥為關(guān)鍵詞分別進行其有效化學(xué)成分和作用靶標(biāo)搜索，在進行有效化學(xué)成分檢索時以每一活性分子的藥物相似性(DL)>0.18、口服生物利用度(OB)>30% 及半衰期(HL)>4 h作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 收集發(fā)熱疾病靶點 對氣虛發(fā)熱證進行靶基因搜索時，從genecard基因信息平臺(https://www.genecards.org/)以關(guān)鍵詞“fever”進行疾病相關(guān)的已知靶基因信息檢索，并對檢索到的靶基因以其評分大于中位數(shù)進行篩選；將篩選后的靶基因和補中益氣湯的有效成分作用的靶點對比分析，篩選出其交集基因。

1.3 篩選核心靶點與PPI建立 利用String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)進行成分與疾病的交集基因分析，并制作PPI圖。蛋白節(jié)點的連線越多、越粗，表明和其他蛋白關(guān)聯(lián)度越大，更有可能成為核心靶點。

1.4 成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 采用Cytoscape(版本3.7.2)構(gòu)建成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖，并對其進行可視化分析；分析各成分對應(yīng)通路和相應(yīng)degree值，確定補中益氣湯治療氣虛發(fā)熱證的作用主要藥效成分。根據(jù)拓?fù)鋮?shù)進行有效作用靶點的篩選，即中介中心性、接近中心性及點度中心性。

1.5 靶點的GO和KEGG富集分析 使用DAVIA數(shù)據(jù)庫完成GO功能富集分析及KEGG通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 補中益氣湯組成中藥的主要化學(xué)成分 使用TCMSP數(shù)據(jù)庫進行補中益氣湯組成重要的有效化學(xué)成分搜索，共篩選出有效化學(xué)成分153個，其中黃芪有16個，人參有20個，甘草有74個，陳皮有5個，升麻有17個，柴胡有14個，將全部有效化學(xué)成分使用TCMSP數(shù)據(jù)庫進行作用靶點的搜索，共得到2 600個，進行去重后共獲得256個相關(guān)靶點。見圖1，表1。

圖1 補中益氣湯主要有效成分-靶點圖

表1 作用于靶基因數(shù)目最多的10個有效化學(xué)成分

2.2 發(fā)熱的相關(guān)靶點 使用genecard數(shù)據(jù)庫使用發(fā)熱為關(guān)鍵詞進行疾病的相關(guān)靶點搜索，并進行篩選后共獲得1 501個和發(fā)熱有關(guān)疾病靶基因，利用Cytocape建立發(fā)熱相關(guān)靶點相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。將補中益氣湯的主要有效化學(xué)成分和疾病相關(guān)靶點進行交集篩選，最終得到105個可能和補中益氣湯治療氣虛發(fā)熱證的相關(guān)靶點。見圖2。

圖2 補中益氣湯主要有效化學(xué)成分與疾病相關(guān)靶點交集

2.3 篩選核心靶點 利用String數(shù)據(jù)庫獲取補中益氣湯氣虛發(fā)熱靶點的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，其存在105個靶蛋白節(jié)點，共有2 009條相互作用連線，平均度值為38.3,排名前五的是TNF、IL6、AKT1、JUN、VEGFA。見圖3。

圖3 交集靶點蛋白-蛋白之間相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.4 補中益氣湯有效成分-發(fā)熱靶點-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 采用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建補中益氣湯中藥-有效成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)圖，共有266個節(jié)點(分別是8個中藥節(jié)點，153個化學(xué)成分節(jié)點，105個疾病靶點節(jié)點)和2 008條邊。見圖4。

圖4 補中益氣湯中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

2.5 補中益氣湯GO功能富集分析及KEGG通路富集分析 將105個發(fā)熱疾病相關(guān)靶點輸入DAVIA數(shù)據(jù)庫完成GO功能富集分析及KEGG通路富集分析。最終得到GO功能富集分析條目計689個具有明顯意義(P<0.05)，生物進程包括：RB1,TOP2A,IL1A,SERPINE1,ADRB2,TNF,RELA,EGFR,PPP3CA,MYC,TGFB1,E2F1,AKT1,MAPK3,IL10,JUN,IL2, STAT1,IL1B,STAT3,FOS,IL4,NFKBIA, CXCL10,VEGFA,AR,IL6,IFNG,IRF1,MAPK14,PGR,PPARA,MET,TP53,NFE2L2；細胞成分：CRP,CXCL8,GSTP1,PON1,SERPINE1,PLAT,MPO,TNF,CXCL2,EGFR,ICAM1,THBD,ERBB3,SPP1,CCL2,HMOX1,LBP,CD14,TIMP1,IL10,TGFB1,ADIPOQ,VCAM1,EGF,MMP3,IGF2,SELE,MMP9,F3,IL2,SOD1,VEGFA,IL4,COL1A1,IL1A,CXCL10,COL3A1,IL6,CD40LG,IFNG,SLPI,IL1B,CAT；分子功能：TOP2A,PTEN,CYP3A4,PTGS2,EGFR,PPP3CA,CCND1,AKT1,HMOX1,SCN5A,JUN,TGFB1,GSTM1,UGT1A1,HSPA5,STAT1,CAV1,MAPK14,NFKBIA,AR,SLPI,CYP1A2,CAT,PGR,TP53。KEGG通路富集分析結(jié)果得到118個有明顯意義的條目(P<0.05)。見圖5、6。

圖5 補中益氣湯發(fā)熱作用靶點的GO功能富集分析

圖6 補中益氣湯KEGG通路富集分析

3 討論

發(fā)熱是許多疾病急性期反應(yīng)中的重要癥狀之一，主要由炎性反應(yīng)引發(fā)體溫調(diào)節(jié)中樞紊亂而產(chǎn)生，通常分為感染性發(fā)熱和非感染性發(fā)熱[8]。在感染性疾病中，發(fā)熱通常屬于體內(nèi)抵抗感染機制，有利于提高機體抵抗力、縮短疾病時間、降低傳染性。非感染性發(fā)熱常涉及腫瘤、自身免疫、血液等多種疾病[9]，臨床持續(xù)性發(fā)熱會導(dǎo)致身體明顯不適、消耗體能從而給患者的康復(fù)帶來很大不利，并且還可能成為疾病發(fā)展惡化的重要環(huán)節(jié)[10]。目前對于非感染性發(fā)熱，特別是不明原因發(fā)熱的有效處理仍是臨床面臨的難題。

現(xiàn)代研究認(rèn)為,發(fā)熱一般是由于外源性致熱原進入機體,作用于巨噬細胞、淋巴細胞、單核細胞等免疫活性細胞,產(chǎn)生內(nèi)源性致熱原,即大量致熱性細胞因子，直接或通過中樞介質(zhì)間接作用于體溫調(diào)節(jié)中樞，使體溫調(diào)定點上移，產(chǎn)熱增加，散熱減少，體溫在一個新的調(diào)定點達到平衡[11]。目前認(rèn)為,致熱性細胞因子主要包括IL-1、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素(INF)。這些致熱細胞因子之間相互調(diào)節(jié)，最后識別靶細胞受體，尤其是視前葉-前下丘腦區(qū)(preoptic anterior hypothalamus,PO/AH)的神經(jīng)細胞，受體介導(dǎo)活化磷脂酶A,并以花生四烯酸為底物激活環(huán)氧化酶(COX)通路，或直接使環(huán)氧化酶表達和花生四烯酸代謝增加，產(chǎn)生前列腺素(PGE)，PGE可通過血腦屏障進入下丘腦，影響體溫調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)元[12]。

《內(nèi)外傷辨惑論》云：“脾胃之氣下流，使谷氣不得升浮，是生長之令不行，則無陽以護其榮衛(wèi)，不任風(fēng)寒，乃生寒熱，皆脾胃之氣不足所致也”，李東垣創(chuàng)制補中益氣湯主治脾胃氣虛及氣虛發(fā)熱證。之后明代醫(yī)家薛己在論述補中益氣湯適應(yīng)證時謂之“治元氣不足，四肢倦怠，口干發(fā)熱，飲食無味，或飲食失節(jié)，或勞倦身熱”。張景岳也指出“凡因辛苦勞倦而病者，多有患頭痛發(fā)熱惡寒，或微渴，或無汗，或自汗，脈雖浮大而無力，宜補中益氣湯”。該方中重用黃芪，補中益氣，固表止汗，為君藥。人參、白術(shù)助黃芪補中健脾，合為臣藥。當(dāng)歸和營養(yǎng)血，陳皮理氣行滯，為佐藥；更用少量輕清升散的柴胡、升麻，協(xié)助益氣之品升提下陷之中氣，與炙甘草合為佐使藥。該方作為主治“脾胃虛弱,氣虛發(fā)熱”的要方不僅為歷代醫(yī)家經(jīng)驗傳承，也被現(xiàn)代臨床運用[13]所印證。

本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析了補中益氣湯中的8味中藥的有效成分及其靶點并完成中藥-化學(xué)成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。實驗發(fā)現(xiàn)，山柰酚可以同時抑制白三烯 B4、TNF-α的釋放; Formononetin在抗炎、抗氧化應(yīng)激、神經(jīng)組織修復(fù)等過程中起重要作用,尤其是可促進Nrf2/HO-1通路激活，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護腦部組織[14]；licochalcone a能有效的抑制TNF-α誘導(dǎo)的炎性因子的表達，并通過促進 MAPK 通路相關(guān)蛋白磷酸化的表達繼而抑制炎性因子IL-1β的表達[15]。

對核心靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)進行拓?fù)浞治鲲@示，TNF、AKT1、IL-6是網(wǎng)絡(luò)中的核心節(jié)點。TNF即腫瘤壞死因子，是一種可以引起細胞凋亡的細胞因子，有研究表明TNF-α作為炎性因子，它能促進其他多種細胞因子的產(chǎn)生和釋放，最終形成細胞因子網(wǎng)絡(luò)而擴大炎性連鎖反應(yīng)，可以引起感染及自身免疫性疾病患者出現(xiàn)發(fā)熱癥狀；此外，亦有研究表明TNF-α還可刺激下丘腦前列腺素E2產(chǎn)生，從而調(diào)節(jié)體溫[16]。IL-6主要由巨噬細胞、T細胞、B細胞等多種細胞產(chǎn)生的一種糖蛋白,參與機體炎性反應(yīng)和抗感染防御作用,還與自身免疫疾病等有密切相關(guān)[17]。AKT1編碼的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶以抑制細胞凋亡，而后磷酸化并使凋亡機制的組成部分失活。有研究表明AKT1是PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中最為關(guān)鍵的酶[18]，AKT1可通過調(diào)節(jié)氧自由基的產(chǎn)生及TNF-α、IL-6、IL-8等促炎細胞因子的產(chǎn)生和釋放，參與到炎性、免疫調(diào)節(jié)、細胞存活、分化、增殖等過程中[19]。

進一步的GO功能富集分析顯示補中益氣湯治療氣虛發(fā)熱證與生物過程相關(guān)的主要有炎性反應(yīng)、免疫應(yīng)答、脂多糖反應(yīng)等；與分子功能相關(guān)的主要有DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα、DNA-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ-特異性DNA轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體的活動等。KEGG通路富集分析顯示，補中益氣湯有效成分治療氣虛發(fā)熱證要涉及TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、NOD-like受體信號通路和HIF-1信號通路等。有實驗研究發(fā)現(xiàn)，補中益氣湯能改善氣虛發(fā)熱大鼠模型的免疫底下狀態(tài)，并推測補中益氣健脾退熱作用機制可能與提高免疫分子含量相關(guān)[20]。亦有研究表明補中益氣湯對氣虛發(fā)熱大鼠模型的胃腸激素、免疫介質(zhì)、物質(zhì)代謝等具有良好的防治效用，而且有調(diào)節(jié)相關(guān)介質(zhì)及中樞發(fā)熱介質(zhì)的作用[21,22]，但有關(guān)氣虛發(fā)熱及補中益氣湯益氣退熱的機制并不清楚。

綜上所述，補中益氣湯對氣虛發(fā)熱證的治療涉及多成分、多靶點、多通路，這也是中醫(yī)方劑發(fā)揮療效的最重要特色。補中益氣湯可通過TNF、AKT1、IL-6等多個核心靶點及TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、NOD-like受體信號通路和HIF-1信號通路等多通路來防治氣虛發(fā)熱。