莊爾俊 ， 岳鳳嬌 ， 趙俊杰 ， 李海龍,2

(1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 ， 云南 大理 671000 ； 2.云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點實驗室 ， 云南 大理 671000)

藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(Giardialamblia,G.lamblia)簡稱賈第蟲，是一種人獸共患、腸道內(nèi)寄生的單細(xì)胞原蟲，呈世界性分布[1]。賈第蟲感染宿主種類多，除人外，還包括絕大多數(shù)的哺乳動物[2]。賈第蟲病的傳播途徑主要是糞—口傳播，由糞便污染的水源、食物或直接接觸糞便引起，感染后可出現(xiàn)持續(xù)性腹瀉、吸收不良、稀便、脹氣、疲勞等癥狀[3]。近年來，國內(nèi)外對于人和動物感染賈第蟲的流行病學(xué)調(diào)查和基因型鑒定日益增多，在我國廣東、上海、河南、江西、寧夏等地均已有報道[4-8]。

哺乳動物中牛是賈第蟲常見的宿主之一，獨龍牛(Bosfrontalis,B.frontalis)是云南省怒江州的珍稀牛種，主要分布于云南省怒江州。賈第蟲作為一種人獸共患寄生蟲，其感染不僅可能對獨龍牛的健康帶來影響，引起疾病，還可能威脅當(dāng)?shù)鼐用竦慕】岛凸残l(wèi)生。本試驗以怒江州獨龍牛為調(diào)查對象，進(jìn)行賈第蟲的分子流行病學(xué)調(diào)查，旨在為當(dāng)?shù)刭Z第蟲的防控和研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集 于2017年9月—2018年9月，在云南省怒江州5個采樣點，分別為怒江流域的古泉村、亞左洛村、鳩門當(dāng)村、茨開鎮(zhèn)和獨龍江流域的獨龍江鄉(xiāng)，按4個季節(jié)(春、夏、秋、冬)采集新鮮獨龍牛糞便共987份，其中怒江流域813份，獨龍江流域174份，-20 ℃保存。賈第蟲陽性DNA樣本由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 糞便DNA提取試劑盒，購自美國OMEGA公司；MgCl2、dNTPs Mixture、10×PCR Buffer、TaqDNA聚合酶、DNA Marker DL2 000、6×DNA Loading Buffer，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA的提取與引物設(shè)計 根據(jù)糞便DNA提取試劑盒說明書步驟提取獨龍牛糞便樣本DNA，置-20 ℃凍存?zhèn)溆?。目的基因根?jù)賈第蟲β-賈第素(β-giardin,BG)基因，參考Bartley等[9]發(fā)表的研究報道設(shè)計2對引物，第1對引物：上游引物F1：5′-AAGCCCGACGACCTCACCCGCAGTGTGC-3′，下游引物R1：5′-GAGGCCGCCCTGGATCTTCGAGACGAC-3′；第2對引物：上游引物F2：5′-GAACGAACGAGATCGAGGTCCG-3′，下游引物R2：5′-CTCGACGAGCTTCGTGTT-3′。

1.3.2 巢式PCR擴(kuò)增 采用巢式PCR，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物為511 bp。PCR擴(kuò)增體系(總體積25 μL)：10×PCR Buffer 2.50 μL，MgCl21.50 μL，dNTP Mixrure 2.00 μL，Ex-Taq0.25 μL，引物F1/R1、F2/R2均為0.25 μL，模板DNA 2.50 μL，加ddH2O補(bǔ)至25.00 μL。第1輪擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共34個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min；第2輪擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共34個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物與1 μL的6×DNA Loading Buffer混合后，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓120 V，電泳時間約30 min。

1.3.3 測序結(jié)果分析 將PCR擴(kuò)增結(jié)果中與目的條帶大小相近的產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。用Clustal X 1.83和BLAST對測序結(jié)果進(jìn)行序列比對，所獲得的樣本序列在GenBank 上與賈第蟲參考序列進(jìn)行同源性比對，然后用MEGA-X計算序列之間的遺傳距離，采用鄰接法(Neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.4 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用卡方檢驗分析不同采樣點、不同流域和不同季節(jié)中獨龍牛的賈第蟲感染率的差異。當(dāng)P<0.05時，統(tǒng)計學(xué)差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 巢式PCR擴(kuò)增 根據(jù)賈第蟲BG基因位點進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，987份獨龍牛糞便樣品中，共有102份擴(kuò)增出大小約為511 bp的條帶(圖1)，總陽性率為10.33%。

圖1 賈第蟲BG基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of BG gene from G.lambliaM:DL2 000 DNA Marker； 1：陽性對照； 2：陰性對照； 3～17:部分陽性樣品M:DL2 000 DNA Marker; 1:Positive control; 2:Negative control; 3-17:Some positive samples

2.2 測序結(jié)果分析及基因型鑒定 對獲得的賈第蟲102份陽性樣品的測序結(jié)果進(jìn)行比對分析，共檢測出集聚體 A、B和E三種基因型，包括A集聚體亞型集聚體AII，均為人獸共患基因型；人獸共患基因型集聚體A的數(shù)量最多，共有93份(91.18%,93/102)。5個采樣點中均有集聚體A感染，集聚體B和E僅在鳩門當(dāng)村有感染(表1)。基于BG基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析并構(gòu)建進(jìn)化樹，序列分析結(jié)果顯示，共有8條不同的DNA序列，上傳至GenBank，登錄號分別為MZ682631、MZ701835、MZ720824～MZ720829)(圖2)。賈第蟲集聚體A基因型與GenBank：EU769205.2相比，序列同源性為96.93%～99.70%；賈第蟲集聚體E基因型與GenBank：KY658184.1相比，序列同源性為100%；賈第蟲集聚體B基因型與GenBank：MT713324.1相比，序列同源性為99.16%。

表1 云南省獨龍牛賈第蟲基因型分布Table 1 Genotypes of G.lamblia in B.frontalis in Yunnan Province

圖2 賈第蟲BG基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of G.lamblia based on BG gene sequence▲:本試驗鑒定的集聚體A基因型； ■：本試驗鑒定的集聚體B基因型； ●：本試驗鑒定的集聚體E基因型▲：Assemblage A genotypes identified in this study； ■：Assemblage B genotype identified in this study； ●：Assemblage E genotype identified in this study

2.3 獨龍牛賈第蟲感染情況統(tǒng)計 987份獨龍牛糞便樣品中賈第蟲陽性樣本共102份，總感染率為10.33%，5個地點中，怒江流域的古泉村、亞左洛村、鳩門當(dāng)村、茨開鎮(zhèn)感染率分別為10.19%(21/206)、13.90%(26/187)、11.98%(23/192)、8.33%(19/228)，獨龍江流域的獨龍江鄉(xiāng)感染率為7.47%(13/174)，亞左洛村與獨龍江鄉(xiāng)之間賈第蟲感染率差異顯著(P<0.05)；獨龍江流域和怒江流域感染率分別為7.47%(13/174)和10.95%(89/813)，差異不顯著(P>0.05)(表2)。春、夏、秋、冬4個季節(jié)中，賈第蟲感染率分別為12.05%(30/249)、10.55%(25/237)、8.68%(23/265)、10.17%(24/236)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析比較，差異不顯著(P>0.05)(表3)。

表2 不同采樣點賈第蟲的感染情況Table 2 Infection of G. lamblia in different sampling sites

表3 不同季節(jié)賈第蟲的感染情況Table 3 Infection of G.lamblia in different seasons

3 討論

近年來，國外的研究報道顯示，獨龍?？筛腥九９谆紫x、指形長刺線蟲、棘球絳蟲、弓形蟲[10-12]，國內(nèi)的獨龍牛感染的寄生蟲有環(huán)孢子蟲和畢氏腸微孢子蟲[13-14]。人和動物賈第蟲的流行病學(xué)調(diào)查在世界范圍內(nèi)均有報道，但我國云南省獨龍牛賈第蟲的相關(guān)報道較為罕見。本試驗通過調(diào)查云南省怒江州獨龍牛賈第蟲的感染情況，發(fā)現(xiàn)獨龍江和怒江兩大流域感染率差異不顯著(P>0.05)，亞左洛村感染率最高，獨龍江鄉(xiāng)感染率最低，可能與當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖模式有關(guān)。本試驗中獨龍牛感染陽性率為10.33%，與江西省報道的牛感染率相近(9.2%)[7]；高于甘肅省奶牛感染率(1%)[15]，西藏自治區(qū)牛感染率(3.8%)[16]；低于江蘇省奶牛感染率(20.6%)[17]，四川省斷奶后犢牛感染率(41.2%)[18]，廣東省斷奶前奶牛感染率(74.2%)[19]。賈第蟲感染率的差異可能與地理位置、生態(tài)環(huán)境、采樣數(shù)量、品種、檢測方法、植被以及自身免疫狀況等因素相關(guān)。本試驗結(jié)果顯示，四季中獨龍牛賈第蟲感染率在春季最高，秋季最低，但差異不顯著(P>0.05)，四季感染率呈現(xiàn)不同流行趨勢，可能是由于獨龍牛所處怒江地區(qū)為低緯帶高海拔，造就了獨特的立體氣候?qū)е碌摹?/p>

本試驗基于賈第蟲BG基因，通過測序分析，鑒定出3種基因型，分別為集聚體A、B、E，其中集聚體A有93份(93/102)，5個采樣點中均有感染，推測為怒江州獨龍牛感染賈第蟲的優(yōu)勢基因型，集聚體B(1/102)和集聚體E(8/102)僅在鳩門當(dāng)村有感染。目前為止，賈第蟲具有8種基因型，即集聚體A～H，根據(jù)Li等[20]的研究報道，集聚體A、B、E均為人獸共患基因型，集聚體E為我國牛感染賈第蟲的優(yōu)勢基因型。

獨龍牛是怒江州當(dāng)?shù)鬲汖堊寰用耖L期馴養(yǎng)的一種半野生畜種，繁育價值高，具有良好的經(jīng)濟(jì)前景，但因地處偏遠(yuǎn)山區(qū)，增加了人獸共患寄生蟲病的防治工作難度。本試驗結(jié)果表明，獨龍牛感染的賈第蟲基因型均為人獸共患基因型，對當(dāng)?shù)鬲汖埮．a(chǎn)業(yè)以及公共衛(wèi)生構(gòu)成威脅，建議有關(guān)部門定期檢查和驅(qū)蟲，加強(qiáng)對賈第蟲的防治以及宣傳教育，做好水源衛(wèi)生管理。