朱洪洋 ， 張 正 ， 王春元 ， 王印庚 ， 袁春營 ， 于永翔 ， 張 楊 ， 趙偉志

(1.天津科技大學(xué)海洋與環(huán)境學(xué)院 ， 天津 濱海新區(qū) 300450 ； 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究 ， 山東 青島 266000 ； 3. 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室 ， 山東 青島 266000)

2020年我國水產(chǎn)養(yǎng)殖因病害造成的經(jīng)濟損失約589億元，約占水產(chǎn)養(yǎng)殖總產(chǎn)值的5.8%[1]。急性肝胰腺壞死病(Acute hepatopancreas necrosis disease,AHPND)是影響國內(nèi)外對蝦健康的最嚴(yán)重的疾病之一，其特點是傳播速度快、流行范圍廣、死亡率高[2]。AHPND已經(jīng)給全球的對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[3-7]，目前主要采用抗生素等化學(xué)類藥物進行治療，但化學(xué)藥物長期、大量的應(yīng)用，會帶來環(huán)境污染、藥物殘留等諸多問題，并加速耐藥菌株的產(chǎn)生。中草藥具有純天然、無污染等優(yōu)點，將是未來漁藥發(fā)展的一個重要方向。榆銀蝦康散是針對海水養(yǎng)殖致病性弧菌，通過科學(xué)的藥物篩選及合理組方研制出的中藥散劑，具有環(huán)境污染小，藥物殘留低，不易產(chǎn)生耐藥性等特點，通過藥效學(xué)研究證實其對副溶血弧菌具有良好的抑制作用[8-10]。中藥散劑的質(zhì)量控制一般從性狀、鑒別、檢查、含量測定等方面進行[11-14]。因此，建立榆銀蝦康散簡便、可行的檢測方法對制劑生產(chǎn)的質(zhì)量控制具有重要意義。為了有效控制該產(chǎn)品的質(zhì)量，本試驗采用薄層色譜法(Thin layer chromatography,TLC)定性鑒別復(fù)方中的地榆、黃柏、黃芩和山銀花，采用光散射法對散劑粒度分布進行檢查，使用高效液相色譜法(High performance liquid chromatogrphy,HPLC)測定復(fù)方中黃芩苷的含量，以期建立榆銀蝦康散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 試驗藥品與試劑 榆銀蝦康散，規(guī)格：100 g/袋，批號為20210717、20210718、20210719。綠原酸對照品，批號為110753-202018；黃芩苷對照品，批號為110715-202122；沒食子酸對照品，批號為110831-201906；鹽酸小檗堿對照品，批號為110713-202015；地榆對照藥材：1 g/支，批號為121286-201703；山銀花對照藥材：1 g/支，批號為121595-201202；黃芩對照藥材：0.5 g/支，批號為120955-201810；黃柏對照藥材：0.5 g/支，批號為121510-201807；以上均購自中國食品藥品檢定研究院。

無水乙醇：HPLC級，科密歐。甲醇：HPLC級，Supelco。磷酸：HPLC級，F(xiàn)isher Chemical。甲苯，HPLC級，購自成都市科龍化工試劑廠。丙酮、鹽酸、乙酸乙酯、甲酸、乙醚、乙醇、甲醇、三氯化鐵，均為AR級，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；二氧化硅：儀器標(biāo)準(zhǔn)樣，累計含量為50%時對應(yīng)的粒徑D(50)的標(biāo)準(zhǔn)值為50 μm，美國Microtrac公司產(chǎn)品。

1.2 主要儀器 KQ5200型超聲波清洗器；XSE205DU精密天平(梅特勒-托利多有限公司)；LC-20A液相色譜儀(日本島津公司)；Extend-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)(美國安捷倫科技有限公司)；SPD-20A檢測器，SPD-M20A檢測器(日本島津公司)；LabSolutions色譜工作站；platisil-ODS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)(上海迪馬科技有限公司)；硅膠G薄層板(青島海洋化工廠)；薄層色譜攝影儀(天津市思利達科技有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 薄層色譜鑒別

1.3.1.1 地榆的鑒別 取榆銀蝦康散(批號為20210717、20210718、20210719)粉末3 g，按照2020版《中華人民共和國獸藥典》二部地榆項下方法處理，最后加2 mL甲醇溶解殘渣作為供試品溶液。取地榆對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。取沒食子酸對照品1 mg，加甲醇制成0.5 mg/mL的對照品溶液。按榆銀蝦康散成分比例，制成不含地榆的榆銀蝦康散，按照供試品溶液方法，制備出地榆陰性對照溶液。參照2020版《中華人民共和國獸藥典》二部地榆項下方法進行展開并檢視。

1.3.1.2 黃柏的鑒別 取榆銀蝦康散(批號為20210717、20210718、20210719)粉末0.4 g，加10 mL甲醇后加熱回流30 min，過濾殘渣，取濾液作為供試品溶液。取黃柏對照藥材0.1 g，同法制成對照藥材溶液。精密稱定鹽酸小檗堿對照品1 mg，加甲醇制成0.5 mg/mL的對照品溶液。按榆銀蝦康散成分比例，取除黃柏外的其余藥材，制成不含黃柏的榆銀蝦康散，按照供試品溶液方法，制備出黃柏陰性對照溶液。吸取上述3種溶液各1 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下觀察。

1.3.1.3 黃芩和山銀花的鑒別 取榆銀蝦康散(批號為20210717、20210718、20210719)粉末2 g，加15 mL甲醇后靜置12 h，過濾后將濾液揮干，再加5 mL甲醇溶解，作為供試品溶液。分別取黃芩藥材粉末0.6 g和山銀花藥材粉末0.2 g，按照供試品溶液方法制成對照藥材溶液。取黃芩苷對照品和綠原酸對照品各1 mg，分別加甲醇制成1 mg/mL的對照品溶液。按榆銀蝦康散成分比例，分別取除黃芩、黃柏、山銀花、山銀花和黃柏外的其余藥材，按工藝要求制成不含這些藥材的陰性對照樣品，按照供試品溶液制備方法操作，制得缺少黃芩、黃柏、山銀花、山銀花和黃柏的陰性對照溶液。參照2020版《中華人民共和國獸藥典》二部銀黃提取物口服液項下方法進行展開并檢視。

1.3.2 粒度分布檢查 取適量榆銀蝦康散(批號為20210717、20210718、20210719)置于激光散射粒度分析儀的樣品槽中，使樣品平鋪均勻，檢測粒度分布。設(shè)備參數(shù)：空氣壓力：20psi；折光率：2.0；Transpatency方式：Transparent；Distribution：Number；Shape：Irregular；進樣時間：5 s。每個批次樣品分別測定3次，取平均值。

1.3.3 黃芩苷的含量測定

1.3.3.1 色譜條件 用Extend-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫為30 ℃，流速為1 mL/min，檢測波長為280 nm；流動相比例為甲醇∶水∶磷酸(47∶53∶0.2)。

1.3.3.2 供試品溶液的制備 研究以下2種提取方法對提取效率的影響。(1)加熱回流提取：分別取本品粉末3份，每份精密稱定約0.5 g，加70%乙醇40 mL后加熱回流3 h，冷卻后過濾，濾液置100 mL量瓶中，用少量70%乙醇分次洗滌容器和殘渣，洗液濾入同一量瓶中，加70%乙醇定容，搖勻，精密量取1 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻即得。(2)超聲提?。悍謩e取本品粉末8份，每份精密稱定約0.5 g，置100 mL量瓶中，加 70%乙醇70 mL，分別超聲處理20、30、40 min和60 min，冷卻后用70%乙醇定容，搖勻，濾過，精密量取1 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻即得。

精密吸取上述供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定。

1.3.3.3 對照品溶液 精密稱定黃芩苷對照品10.42 mg，加甲醇制成每1 mL含59.65 μg黃芩苷的溶液，即得。

1.3.3.4 陰性對照品溶液 按榆銀蝦康散成分比例，制備不含黃芩的榆銀蝦康散，按1.3.3.2中確定的制備方法配制缺少黃芩的陰性對照品溶液。

1.3.3.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 取上述3種溶液各10 μL測定，考察供試品溶液的理論塔板數(shù)、分離度、專屬性。

1.3.3.6 線性關(guān)系考察 精確稱取黃芩苷對照品10.42 mg(按純度95.4%)，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，搖勻作為標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。分別取適量儲備液，用甲醇稀釋成9.94、29.82、59.65、79.53 μg/mL和99.41 μg/mL一系列濃度的對照品溶液。精密吸取上述對照品溶液10 μL，測定。以進樣濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.7 精密度試驗 吸取濃度為59.65 μg/mL的對照品溶液10 μL，重復(fù)進樣6次，進行儀器精密度試驗。在同一實驗室，用不同儀器、不同時間、不同操作者考察，分別用島津LC-20A SPD-M20A高效液相色譜儀和島津LC-20A SPD-20A高效液相色譜儀進樣分析，計算黃芩苷含量，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，進行中間精密度試驗。

1.3.3.8 日間穩(wěn)定性試驗 精密稱取樣品0.5 g，按1.3.3.2確定的方法制備供試品溶液，在制備后0、2、4、8 h和12 h各進樣1次，測定峰面積，計算精密度。

1.3.3.9 重復(fù)性試驗 精密稱取樣品6份，每份精密稱取0.5 g，按1.3.3.2確定的方法制備供試品溶液，各進樣10 μL，檢測并記錄峰面積，計算RSD值。

1.3.3.10 加樣回收率試驗 取本品(黃芩苷含量44.97 mg/g)約0.25 g，精密稱取6份，分別精密加入黃芩苷對照品12 mg，制備供試品溶液，進樣，計算回收率。

1.3.3.11 耐用性試驗 取同一批號樣品，按1.3.3.2確定的方法制備供試品溶液，分別考察流動相比例變化±5%、柱溫變化±5 ℃、流速±0.1 mL/min對樣品色譜行為的影響，記錄色譜圖。觀察黃芩苷和臨近峰的基線分離情況。

1.3.3.12 榆銀蝦康散樣品測定 取榆銀蝦康散樣品3批，各批次取平行樣品2份，按1.3.3.2確定的方法制備供試品溶液，每份樣品進樣量10 μL，記錄峰面積并計算黃芩苷含量。

2 結(jié)果

2.1 地榆的薄層色譜鑒別 供試品溶液與對照品溶液和對照藥材溶液在色譜中同一位置顯示出一樣顏色的斑點，而缺少地榆的榆銀蝦康散陰性對照溶液沒有相應(yīng)的斑點(圖1)。

圖1 地榆的薄層色譜圖Fig.1 Thin-layer chromatography of Sanguisorbae radix1～3：供試品溶液(批號：20210717，20210718，20210719)； 4：沒食子酸對照品溶液； 5：地榆對照藥材溶液； 6：缺少地榆的陰性對照溶液1-3:Test solution (batch number:20210717,20210718,20210719); 4:Control solution of gallic acid; 5:Control herbs solution of Sanguisorbae radix; 6:Negative control solution without Sanguisorbae radix

2.2 黃柏的薄層色譜鑒別 供試品溶液與對照品溶液和對照藥材溶液在色譜中同一位置顯示出一樣的熒光斑點，而缺少黃柏的榆銀蝦康散陰性對照溶液沒有相應(yīng)的斑點(圖2)。

圖2 黃柏的薄層色譜圖Fig.2 Thin-layer chromatography of P.cidnensis cortex1～3：供試品溶液(批號：20210717、 20210718、 20210719)； 4：鹽酸小檗堿對照品溶液； 5：黃柏對照藥材溶液； 6：缺少黃柏的陰性對照溶液1-3:Test solution (batch number:20210717,20210718,20210719); 4:Control solution of berberine hydrochloride; 5:Control herbs solution of P.cidnensis cortex; 6:Negative control solution without P.cidnensis cortex

2.3 黃芩和山銀花的薄層色譜鑒別 供試品溶液與黃芩苷對照品溶液和黃芩對照藥材溶液在色譜中同一位置顯示出一樣的暗色斑點，且缺少黃芩的陰性對照溶液沒有相應(yīng)的斑點；供試品溶液與綠原酸對照品溶液和山銀花對照藥材溶液在色譜中同一位置顯示出一樣的熒光斑點，且缺少山銀花陰性對照溶液和缺少黃柏陰性對照溶液都有熒光強度較暗的斑點，缺少山銀花和黃柏陰性對照溶液無相應(yīng)的斑點(圖3)。

圖3 黃芩和山銀花的薄層色譜圖Fig.3 Thin-layer chromatography of Scutellariae radix and L. flos1～3：供試品溶液(批號：20210717、 20210718、 20210719)； 4：黃芩苷對照品溶液； 5：黃芩對照藥材溶液； 6：缺少黃芩陰性對照溶液； 7：綠原酸對照品溶液； 8：山銀花對照藥材溶液； 9：缺少山銀花陰性對照溶液； 10：缺少黃柏陰性對照溶液； 11：缺少黃柏和山銀花陰性對照溶液1-3:Test solution (batch number:20210717,20210718,20210719); 4:Control solution of baicalin; 5:Control herbs solution of Scutellariae radix; 6:Negative control solution without Scutellariae radix; 7:Control solution of chlorogenic acid; 8:Control herbs solution of L. flos; 9:Negative control solution without L. flos; 10:Negative control solution without P. cidnensis cortex; 11:Negative control solution without P. cidnensis cortex and L. flos

2.4 粒度分布檢查 3批樣品粒度分布檢查結(jié)果顯示，<75 μm的顆粒比例分別為99.4%、99.0%和99.0%，RSD為0.22%。結(jié)果表明，3批散劑的顆粒均勻度相對較好，且均符合粒度的要求。

2.5 黃芩苷的含量測定

2.5.1 樣品溶液制備方法考察 由表1可知，超聲提取的方法不穩(wěn)定，供試品溶液的制備方法確定為：精密稱定本品粉末約0.5 g，加40 mL 70%的乙醇溶液，加熱回流3 h，放置冷卻后過濾至100 mL量瓶中，用少量70%乙醇分次洗滌容器和殘渣，洗液濾入同一量瓶中，加70%乙醇定容。精密量取1 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。

表1 供試品溶液不同提取方法考察Table 1 Investigation on different extraction methods of test solution

2.5.2 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 結(jié)果顯示，理論塔板數(shù)按黃芩苷計為4 239，符合《中華人民共和國獸藥典》規(guī)定不低于2 500。專屬性考察結(jié)果如圖4所示，在1.3.3.1色譜條件下樣品中黃芩苷與相鄰雜質(zhì)峰分離良好，陰性對照在黃芩苷出峰時間無色譜峰，檢測無干擾。

圖4 黃芩苷的系統(tǒng)適應(yīng)性試驗HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of system adaptability test of baicalinA：黃芩苷對照品溶液； B：缺少黃芩的陰性對照溶液； C：供試品溶液A:Control solution of baicalin; B:Negative control solution without Scutellariae radix; C:Test solution

2.5.3 線性關(guān)系考察 以黃芩苷進樣含量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗結(jié)果顯示，黃芩苷在9.94～99.41 μg/mL范圍內(nèi)，進樣濃度與峰面積積分值線性關(guān)系良好：Y=36 881X-29 331(R2=0.999 6)(圖5)。

圖5 黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of baicalin

2.5.4 精密度試驗 經(jīng)計算RSD為0.19%(n=6)，符合《中華人民共和國獸藥典》規(guī)定RSD不大于2.0%，表明該方法具有良好的精密度。在同一個實驗室，用不同儀器、不同時間、不同操作者，按建立的色譜條件，分別用LC-20A SPD-20A高效液相色譜儀和島津LC-20A SPD-M20A高效液相色譜儀進樣分析，經(jīng)計算RSD為0.62%，表明中間精密度良好。

2.5.5 日間穩(wěn)定性試驗 經(jīng)計算RSD為0.14%，表明12 h內(nèi)樣品具有良好的穩(wěn)定性。

2.5.6 重復(fù)性試驗 測定的黃芩苷平均含量為41.89 mg/g，RSD為1.14%，表明該檢測方法重復(fù)性良好。

2.5.7 加樣回收率試驗 結(jié)果如表2所示，平均加樣回收率為100.95%，RSD為0.45%，表明該方法加樣回收率良好。

表2 黃芩苷加樣回收率試驗Table 2 Recovery test of baicalin

2.5.8 耐用性試驗 結(jié)果表明，柱溫分別為20 ℃、25 ℃、30 ℃時RSD為0.50%；流動相比例分別為甲醇∶水∶磷酸(47∶53∶0.2)、甲醇∶水∶磷酸(45∶55∶0.2)、甲醇∶水∶磷酸(50∶50∶0.2)時，RSD為2.17%；流速分別為0.9 mL/min、1.0 mL/min、1.1 mL/min時，RSD為9.16%，峰面積偏差或含量變化較小，能保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.5.9 榆銀蝦康散樣品測定 經(jīng)測定，3批榆銀蝦康散的黃芩苷含量分別為40.77、40.08 mg/g和38.62 mg/g,表明不同批號的榆銀蝦康散中黃芩苷的含量穩(wěn)定性較好。

3 討論

中藥處方的定性鑒別研究主要目的是保證在生產(chǎn)流通過程中不會出現(xiàn)少藥、偽藥、違規(guī)添加等現(xiàn)象。在中藥處方的鑒別研究中原則上應(yīng)對處方中所有藥味進行鑒別研究，《中華人民共和國獸藥典》2020年版記載的154種散劑中主要鑒別方法為顯微鑒別、薄層色譜鑒別和理化鑒別?？紤]到榆銀蝦康散是由地榆、黃柏、黃芩和山銀花四味中藥經(jīng)粉碎后通過200目篩而制成的散劑，部分植物細胞已破碎，不能完整體現(xiàn)單味藥材的顯微特征，重現(xiàn)性和專屬性不強。因此，本制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不采用顯微鑒別的方法。而薄層色譜法具有直觀性強、分離度好、簡單易操作等優(yōu)點，所以在榆銀蝦康散鑒別研究過程中只采用薄層色譜法對處方中四味藥進行定性鑒別。在黃柏的鑒別研究過程中，首先采用《中華人民共和國獸藥典》2020版二部黃柏項下的薄層鑒別方法，以鹽酸黃柏堿作為對照品[15]，發(fā)現(xiàn)該方法操作復(fù)雜，且供試品色譜中鹽酸黃柏堿斑點不清晰；其后，嘗試《中華人民共和國藥典》2020年版一部復(fù)方黃柏液涂劑項下的鑒別方法，改用鹽酸小檗堿作為對照品[16]，該方法供試品斑點清晰，并獲得了良好的重現(xiàn)性。需要特別指出的是，在山銀花的鑒別研究中，采用綠原酸對山銀花進行鑒別[15,17]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，因黃柏中也含有少量綠原酸，導(dǎo)致缺少山銀花的陰性對照溶液(含有黃柏)也出現(xiàn)較暗的熒光斑點，所以對其山銀花中綠原酸鑒別稍有干擾。但因黃柏出現(xiàn)的熒光斑點亮度大大低于因山銀花出現(xiàn)的熒光斑點，所以，該方法仍可用作榆銀蝦康散中山銀花的鑒別。

根據(jù)已有研究報道，散劑降低粒度可以提高有效成分溶出率、增加體內(nèi)吸收、提高生物利用度，最終達到增強療效的目的[18-19]。從對蝦生物學(xué)特征來看，其消化道短，那么藥物吸收時間也較短；為此，榆銀蝦康散的粒度越細其療效越好。本課題組制成不同粒度的榆銀蝦康散藥液，對AHPND致病原副溶血弧菌的體外抑菌效果進行觀察，結(jié)果顯示其抑菌效果為300目>200目>80目(相關(guān)結(jié)果將另行發(fā)表)?！吨腥A人民共和國獸藥典》2020年版關(guān)于散劑粒度的要求為通過5號篩(80目)的粉末不少于95%，微粉劑的粒度要求為小于48 μm(300目)的粉末不少于95%?？紤]到微粉劑生產(chǎn)成本較高，所以榆銀蝦康散的粒度選定為200目，該粒度范圍仍屬于散劑。

除對榆銀蝦康散的藥味進行定性鑒別外，對處方中主效成分進行含量測定也是控制榆銀蝦康散質(zhì)量的有效手段。黃芩是榆銀蝦康散中主要藥味，其所含的成分主要為黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等黃酮類物質(zhì)，其中黃芩苷的含量高、性質(zhì)穩(wěn)定，在中藥材及制劑標(biāo)準(zhǔn)中常作為含量測定的指標(biāo)成分。因此，本試驗采用高效液相色譜法對處方中黃芩主要成分黃芩苷進行含量測定，可對榆銀蝦康散成分含量進行定量化監(jiān)測。本試驗中對影響黃芩苷含量的供試品提取方法進行了比較分析，確定黃芩苷供試品溶液采用加熱回流法制備，在最終的色譜條件下，該方法分離度好，精密度高，重現(xiàn)性好，陰性無干擾，可用作處方中黃芩苷的含量測定方法。

綜上，本試驗通過薄層色譜法對榆銀蝦康散中主要成分(地榆、黃柏、黃芩、山銀花)進行定性鑒別、采用光散射法對粒度分布進行檢查以及高效液相色譜法對黃芩苷進行含量測定，建立了一套該散劑主要成分的定性、定量分析方法，操作簡便、重現(xiàn)性好、精密度高，能夠作為榆銀蝦康散的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。本試驗為該種散劑的深入研究提供了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，也為申報新漁藥提供了試驗數(shù)據(jù)和參考資料。