張瑞華 ， 高善頌 ， 龐天津 ， 張丹萍 ， 竇心怡 ， 李煥發(fā) ， 叢 楊 ， 韓先杰

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 山東 青島 266109 ； 2. 青島中仁動(dòng)物藥品有限公司 ， 山東 青島 266300)

停乳鏈球菌(Streptococcusdysgalactiae)分為停乳鏈球菌類馬亞種(Streptococcusdysgalactiaesubsp.equisimilis,SDSE)和停乳鏈球菌停乳亞種(Streptococcusdysgalactiaesubsp.dysgalactiae,SDSD)，為鏈球菌屬的成員之一，是牛和羊乳腺炎的主要病原體。停乳鏈球菌為革蘭陽性球菌，顯微鏡下成對或鏈狀排列，蘭氏分群為C群[1]。停乳鏈球菌類馬亞種于1996年首次被發(fā)現(xiàn)，其在血瓊脂平板上呈現(xiàn)β溶血[2]。該菌可以通過傷口、皮膚等途徑進(jìn)入血液中造成菌血癥或敗血癥，通常會(huì)引起人的化膿性疾病、呼吸道疾病和牛羊的乳腺炎等疾病[3]。

2020年8月，山東省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室接到文登市某規(guī)?；傪B(yǎng)殖場送檢的病死狐貍，本試驗(yàn)對送檢的病例進(jìn)行了細(xì)菌分離鑒定、基因測序、動(dòng)物試驗(yàn)和耐藥性分析，為確診此次疫情及該狐貍養(yǎng)殖場防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源 5只病死狐貍，由山東省文登市某規(guī)?；傪B(yǎng)殖場提供。

1.2 主要試劑 腦心浸液肉湯、血瓊脂平板、革蘭染色液等，均購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；API 20 STREP鏈球菌屬生化鑒定試劑盒，購自生物梅里埃法國股份有限公司；藥敏試紙，購自青島科盛源科技發(fā)展有限公司；Bacteria DNA lsolation Mini Kit DNA提取試劑盒、PCR反應(yīng)試劑、Gel DNA Extraction Mini Kit膠回收試劑盒等，均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20～24 g健康昆明系小鼠，購自青島大任富城畜牧有限公司。

1.4 細(xì)菌分離、培養(yǎng)和純化 無菌條件下取病死狐貍的脾臟劃線接種到血瓊脂平板上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～36 h；挑取大小、形態(tài)和顏色基本一致的菌落再次接種至血瓊脂平板，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～36 h，進(jìn)行細(xì)菌純化；挑取單菌落接種至腦心浸液肉湯中增殖培養(yǎng)；挑取單菌落進(jìn)行革蘭染色，顯微鏡下觀察形態(tài)特征。

1.5 生化鑒定 按照API 20 STREP鏈球菌屬生化鑒定試劑盒說明書對分離菌株進(jìn)行生化鑒定。

1.6 PCR鑒定和序列分析 根據(jù)鏈球菌16S rRNA 基因，使用Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)1對鏈球菌通用引物(F:5′-GCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCG-3′；R:5′-GGCTTTAAGAGATTAGCTTGCC-3′；擴(kuò)增片段大小為891 bp)，并交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。增殖培養(yǎng)的分離菌株使用Bacteria DNA lsolation Mini Kit 試劑盒提取DNA。PCR擴(kuò)增體系(25.0 μL)：2×Master Mix 12.5 μL，上游引物(F)1.0 μL，下游引物(R)1.0 μL，DNA模板1.5 μL，無菌水9.0 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，33個(gè)循環(huán); 72 ℃終延伸7 min，4 ℃保存結(jié)束反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用Gel DNA Extraction Mini Kit膠回收試劑盒回收產(chǎn)物，并交由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行基因測序。測序結(jié)果使用NCBI網(wǎng)站的BLAST工具進(jìn)行比對，并利用MEGA 6軟件繪制遺傳進(jìn)化樹。

1.7 藥敏試驗(yàn) 按照K-B藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行操作，吸取100 μL含分離菌株的腦心浸液肉湯至含5%血清的TSA平板上，使用一次性涂布器將其均勻涂抹開，隨后將藥敏紙片放置到平板上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～36 h，藥敏試驗(yàn)按照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果[4]。

1.8 動(dòng)物試驗(yàn) 設(shè)置6個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對照組，每組隨機(jī)選取10只小鼠。分別向試驗(yàn)組小鼠注射1.5×108、3×108、6×108、1.2×109、2.4×109CFU和4.8×109CFU菌液，對照組小鼠注射無菌PBS。連續(xù)觀察7 d，記錄小鼠發(fā)病和死亡情況，計(jì)算半數(shù)致死量(Median lethal dose,LD50)。剖檢死亡小鼠，觀察其病變情況，無菌采集病變組織，分離細(xì)菌，進(jìn)行病原菌鑒定。

2 結(jié)果

2.1 分離菌的培養(yǎng)特性和形態(tài)特征 分離菌在血瓊脂平板上生長緩慢，培養(yǎng)24 h可見針尖大小菌落，培養(yǎng)48 h后可見直徑0.8～1.2 mm、乳白色、圓形、表面濕潤的菌落。菌落周圍呈現(xiàn)β型溶血。分離菌革蘭染色為陽性球菌，成對或呈鏈狀排列(圖1)。

圖1 顯微鏡下分離菌形態(tài) (革蘭染色，1 000×)Fig.1 Microscopic morphology of isolated strains (Gram staining,1 000×)

2.2 生化鑒定 3株分離菌使用API 20 STREP鏈球菌屬生化鑒定試劑盒得到的鑒定編碼均為4463415，經(jīng)系統(tǒng)鑒定，分離菌為停乳鏈球菌類馬亞種的可信度達(dá)99.6%(%ID=99.6)，T值=0.91，鑒定結(jié)果見表1，結(jié)果良好，初步將其判定為停乳鏈球菌類馬亞種。

表1 生化鑒定結(jié)果Table 1 Results of biochemical identification

2.3 PCR鑒定 3株分離菌經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，出現(xiàn)大小約為891 bp的條帶，見圖2，與預(yù)期大小相符，初步鑒定為鏈球菌，將其分別命名為SD-TR03、SD-TR04和SD-TR05。

圖2 分離菌16S rRNA基因的PCR鑒定Fig.2 PCR amplification of 16S rRNA gene from isolated strainsM：DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2 000； 1：SD-TR03； 2：SD-TR04； 3：SD-TR05； 4：陰性對照M：DL2 000 DNA Marker； 1：SD-TR03； 2：SD-TR04； 3：SD-TR05； 4：Negative control

2.4 序列分析 使用NCBI網(wǎng)站上的BLAST工具將3株分離菌測序序列與基因庫中的序列進(jìn)行同源性比對，結(jié)果顯示，分離菌株與停乳鏈球菌類馬亞種(GenBank登錄號(hào)：CP053074.1、CP051624.1和CP051623.1)序列同源性均高達(dá)100%，可以確定此次試驗(yàn)從該養(yǎng)殖場不同病死狐貍中分離到的3株優(yōu)勢菌均為停乳鏈球菌類馬亞種。根據(jù)序列進(jìn)化樹結(jié)果分析可知，分離株SD-TR03、SD-TR04、SD-TR05與日本分離株Kdys0611、TPCH-A88以及沙特分離株SCDR-SD1在同一分支，親緣關(guān)系較近(圖3)。

圖3 分離菌基于16S rRNA基因序列的遺傳進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic tree of isolated strains based on 16S rRNA gene sequence▲：本試驗(yàn)分離株▲：Strains isolated in this study

2.5 藥敏試驗(yàn) 本試驗(yàn)分離株對頭孢曲松、左氧氟沙星、頭孢吡肟、頭孢噻肟、氨芐西林、氯霉素、頭孢唑林、阿莫西林、苯唑西林、氟苯尼考、利福平敏感，對卡那霉素和新霉素中敏，對亞胺培南、頭孢呋辛、諾氟沙星、慶大霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、阿奇霉素、克林霉素、紅霉素耐藥(表2)。

表2 分離菌藥物敏感試驗(yàn)Table 2 Drug sensitivity test of isolated strains

2.6 動(dòng)物試驗(yàn) 接種菌液的小鼠呈現(xiàn)精神萎靡、扎堆聚集、活動(dòng)減少等癥狀，接種大劑量菌液(≥2.4×109CFU)的小鼠于16 h內(nèi)全部死亡(表3)。剖檢死亡小鼠，可見其脾臟腫大，顏色暗淡，肺臟有針尖狀出血，腎臟腫大。無菌采集死亡小鼠腹腔液接種血平板，可見形狀單一，呈現(xiàn)β溶血的菌落。革蘭染色鏡檢顯示為成對或呈鏈狀排列的革蘭陽性球菌。試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS Statistics 25.0軟件處理后得出不同死亡概率對應(yīng)的接種菌液劑量以及接種菌液劑量的95%置信區(qū)間(CI)，概率為0.500時(shí)的菌液劑量即為半數(shù)致死量(LD50)，經(jīng)查詢輸出數(shù)據(jù)可知，分離菌的LD50為5.818×108CFU，95%CI為3.695×108～8.865×108CFU(表4)。

表3 各組小鼠注射分離菌劑量與死亡數(shù)量統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistics of the injected doses of isolated strains and the number of deaths in mice of each group

表4 不同死亡概率所對應(yīng)的接種菌液劑量以及95%置信區(qū)間Table 4 Inoculant amounts and 95%CI for different mortality probability

3 討論

本試驗(yàn)從山東省文登市某規(guī)模化狐貍養(yǎng)殖場提供的不同病例中分離到了3株優(yōu)勢菌，通過細(xì)菌分離純化、革蘭染色、生化鑒定、基因測序分析等，確定本次引起該狐貍養(yǎng)殖場狐貍死亡的病原菌為停乳鏈球菌類馬亞種。將該菌接種小鼠會(huì)使小鼠在短時(shí)間內(nèi)死亡，具有很強(qiáng)的致病性。通過藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在22種抗菌藥中該菌對11種抗菌藥敏感，2種抗菌藥中敏，9種抗菌藥耐藥，因此在發(fā)生疑似停乳鏈球菌類馬亞種感染時(shí)要及時(shí)送檢，并根據(jù)藥敏試驗(yàn)指導(dǎo)用藥，避免濫用抗菌藥。

停乳鏈球菌通常會(huì)引起牛、羊等動(dòng)物的乳腺炎癥[1]，而且能夠引起人類的菌血癥和化膿性疾病，特別是老年人和抵抗力低下的人群[5]。2020年5月22日在天津發(fā)生一起由停乳鏈球菌類馬亞種感染導(dǎo)致的聚集性發(fā)熱，發(fā)病者多為青壯年，主要以呼吸道癥狀為主且癥狀相對較輕[6]。因此該菌對公共衛(wèi)生安全具有一定的危害，需要引起足夠的重視。何永強(qiáng)等[7]在2009年對進(jìn)境狐貍的檢測中曾發(fā)現(xiàn)具有致病性的停乳鏈球菌，因此應(yīng)加強(qiáng)對入境動(dòng)物和乳制品的檢疫。目前，國內(nèi)對于停乳鏈球菌的研究主要集中在豬和貉等動(dòng)物上，龍劍等[8]于2019年7月在湖南某豬場的仔豬病料中分離出具有較強(qiáng)致病性的豬源停乳鏈球菌類馬亞種；2020年8月蓋玉強(qiáng)等[9]在山東省文登市某貉養(yǎng)殖場發(fā)病幼貉中分離到1株貉源停乳鏈球菌類馬亞種。查閱國外文獻(xiàn)罕見狐貍源停乳鏈球菌類馬亞種的相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)果為狐貍源停乳鏈球菌類馬亞種的防控提供了依據(jù)。