黃瀟航 ， 彭佳佳 ， 張 龍 ， 李詩(shī)藝 ， 王詩(shī)晨 ， 李夢(mèng)蕊 ，李永霞 ， 賀金峪 ， 黃志堅(jiān) ， 殷光文

(1.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 蜂學(xué)學(xué)院 ， 福建 福州 350002 ； 2.福建省動(dòng)物藥物工程實(shí)驗(yàn)室 ， 福建 福州 350002)

我國(guó)水禽產(chǎn)業(yè)較為發(fā)達(dá)，但是球蟲、蛔蟲等寄生蟲的感染影響了水禽的生產(chǎn)性能，造成了較為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，因此及時(shí)有效地確診水禽寄生蟲病的感染類型具有重要意義。動(dòng)物蛔蟲多具有較為相似的形態(tài)特征，依靠傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法較難進(jìn)行判斷，因此分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為快速鑒定蛔蟲種類提供了新方法。鴨蛔蟲的臨床案例在國(guó)內(nèi)報(bào)道較少，且尚未開展致病原相關(guān)研究。在已報(bào)道的臨床鴨源蛔蟲臨床案例中，林琳等[1]通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定診斷了1例番鴨蛔蟲病，通過(guò)蟲卵、成蟲形態(tài)學(xué)方法的比對(duì)判斷為雞蛔蟲。而在江梅[2]報(bào)道的臨床案例中，鴨蛔蟲被認(rèn)為主要是禽蛔蟲，但主要還是依據(jù)形態(tài)學(xué)進(jìn)行判斷。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)1例送檢至福建省畜禽疾病診療中心患有蛔蟲病的番鴨進(jìn)行剖檢，觀察其病理變化。通過(guò)蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin，H.E.)染色法對(duì)番鴨腸道由于蛔蟲寄生產(chǎn)生的腸道病變進(jìn)行了觀察。在形態(tài)學(xué)鑒定基礎(chǔ)上，使用分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)采集的蟲體進(jìn)行DNA提取和PCR擴(kuò)增鑒定，通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)中蛔屬線蟲的遺傳序列比對(duì)，基于18S rRNA遺傳區(qū)間對(duì)鴨源蛔蟲進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定，為鴨蛔蟲病的生物學(xué)分類提供了相關(guān)的借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源 用于剖檢、制備病理切片研究的病變組織，鴨源蛔蟲蟲株均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜禽疾病診療中心惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑和儀器 DNA提取試劑盒FastDNA SPIN Kit，購(gòu)自美國(guó)MP Biomedicals公司；EasyTaqMix 聚合酶、EasyPure Quick Gel Extraction Kit，均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司。Omega Fluor Plus 凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó) Aplegen 公司產(chǎn)品；Veriti 梯度 PCR 儀，美國(guó)Applied Biosystems公司產(chǎn)品；電泳儀，北京市六一儀器廠產(chǎn)品。

1.3 病理組織學(xué)觀察 采集樣品時(shí)記錄鴨腸道剖檢病變。取病變腸組織，固定于10%中性福爾馬林緩沖液，經(jīng)常規(guī)組織脫水、透明、包埋、切片，然后進(jìn)行H.E.染色，顯微鏡下觀察并記錄病理變化。

1.4 病原形態(tài)學(xué)觀察 使用體式顯微鏡對(duì)蟲體進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.5 PCR擴(kuò)增 將3條蟲體編號(hào)為Y1～Y3，按FastDNA SPIN Kit試劑盒說(shuō)明書所述方法，提取蟲體基因組DNA。使用線蟲通用引物[3](NEMF1:5′-CGCAAATTACCCACTCTC-3′;S3:5′-AGTCAAATTAAGCCGCAG-3′),通過(guò)PCR擴(kuò)增18S rRNA基因片段。引物由福州尚亞生物公司合成。反應(yīng)體系(25 μL)：DNA模板2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，2×EasyTaqMix酶12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)程序:94 ℃ 2 min;94 ℃ 20 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。同時(shí)設(shè)ddH2O作為陰性對(duì)照，使用雞蛔蟲DNA作為陽(yáng)性對(duì)照。通過(guò)膠回收純化目的條帶，送往福州鉑尚生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 系統(tǒng)進(jìn)化分析 將測(cè)序得到的基因序列與NCBI中公布的相關(guān)基因序列進(jìn)行對(duì)比分析，使用DNAMAN進(jìn)行同源性比對(duì)，采用MEGA 7.0生物軟件繪制鄰近法(Neighbor-joining,NJ)序列系統(tǒng)發(fā)生樹。

2 結(jié)果

2.1 病理組織學(xué)觀察 病理切片觀察結(jié)果顯示，發(fā)生腸道蛔蟲寄生的番鴨黏膜層腸絨毛排列不規(guī)則，大量腸絨毛脫落，周圍可見(jiàn)大量脫落的上皮細(xì)胞，腸腔內(nèi)可見(jiàn)大量壞死的細(xì)胞碎片；黏膜層腸腺數(shù)量豐富，排列緊密；肌層局部可見(jiàn)結(jié)締組織增生，并伴有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1)。從病理?yè)p傷程度判斷，鴨蛔蟲的感染造成了鴨腸道嚴(yán)重機(jī)械性損傷。

圖1 番鴨小腸病理切片 (H.E.染色，200×)Fig.1 Histopathological section of the small intestine from Muscovy duck (H.E.staining，200×)箭頭：炎性浸潤(rùn)，腸黏膜脫落Arrow:Inflammatory infiltration and intestinal mucosa abscission

2.2 病原形態(tài)學(xué)觀察 在病鴨腸道內(nèi)壁可以觀察到細(xì)長(zhǎng)的蟲體，蟲體顏色為褐黃色，腸道內(nèi)容物中觀察到大量蟲體寄生(圖2)。收集蟲體后，通過(guò)體視顯微鏡觀察懷疑蟲體為蛔蟲。

圖2 番鴨小腸的蟲體(箭頭)Fig.2 Worms in the small intestine of Muscovy duck (Arrow)

2.3 PCR擴(kuò)增及系統(tǒng)進(jìn)化分析 擴(kuò)增獲得的目的片段大小在744 bp左右(圖3)。切割陽(yáng)性產(chǎn)物經(jīng)過(guò)膠回收純化后送往福州鉑尚生物公司進(jìn)行Sanger雙向測(cè)序，獲得Y1～Y3序列。3條鴨源蛔蟲的18S rRNA序列經(jīng)過(guò)DNAMAN片段修剪對(duì)齊，雙向多序列比對(duì)后，片段同源性為100%。選取Y1作為代表株與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中弓首蛔蟲、雞蛔蟲、雞異刺線蟲等蟲種的18S rRNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)。結(jié)果如圖4所示，擴(kuò)增的Y1～Y3鴨源蛔蟲18S rRNA片段種群遺傳上與雞蛔蟲同源性在99%～100%，其次是雞異刺線蟲；Y1～Y3鴨源蛔蟲在進(jìn)化樹分支上形成了獨(dú)立的分支，與Ascaridiagalli(EF180058.1)序列聚合為一支，與弓首蛔蟲屬等形成了獨(dú)立分支，且與雞異刺線蟲等分支可信度超過(guò)50，置信度較高。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定和序列生物同源性分析，本試驗(yàn)分離自鴨腸道的蛔蟲屬于Ascaridiagalli。

圖3 鴨源蛔蟲18S rRNA的 PCR擴(kuò)增Fig.3 PCR amplification of 18S rRNA gene from duck-source AscarisM：2K plus DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1～3：Y1～Y3鴨源蛔蟲18S rRNA基因片段； 4：陽(yáng)性對(duì)照； 5：陰性對(duì)照M:2K plus DNA Marker; 1-3:18S rRNA gene fragment of Y1-Y3 strains; 4:Positive control; 5:Negative control

圖4 鄰近法進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree by Neighbor-joining method▲:鴨源蛔蟲福建株樣本▲:Fujian strains of duck-source Ascaris

3 討論

蛔蟲是一種演化歷史時(shí)間較長(zhǎng)的寄生蟲，種類繁多。我國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè)中較常見(jiàn)的蛔蟲種類為雞蛔蟲、豬蛔蟲、鴿蛔蟲等，在臨床上多以造成動(dòng)物腸道損傷為主，寄生數(shù)量較多時(shí)會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物虛弱甚至死亡。從本試驗(yàn)病理組織學(xué)觀察結(jié)果來(lái)看，蛔蟲的感染寄生造成番鴨腸黏膜損傷、炎性反應(yīng)，造成腸道機(jī)械性損傷，表明鴨源蛔蟲對(duì)禽腸道具有較強(qiáng)的致病性。

符敖齊等[4]根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察報(bào)道了家鵝感染雞蛔蟲的臨床案例，李欣等[5]采用分子生物學(xué)方法通過(guò)對(duì)核糖體間隔轉(zhuǎn)錄區(qū)(Internal transcribed spacer,ITS)的測(cè)定分析，認(rèn)為分離自鵝腸道的蛔蟲是有別于雞蛔蟲的新種蛔蟲——鵝蛔蟲，這也提示了在現(xiàn)有水禽臨床案例中，基于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)歸類的蛔蟲分類可能由于分子生物學(xué)介入而有了更多新種發(fā)現(xiàn)的可能性。有關(guān)雞蛔蟲的分子生物學(xué)研究、臨床防控等已經(jīng)有較多報(bào)道[6-11]，但是關(guān)于鴨的蛔目線蟲感染，目前的報(bào)道較少，在2020年de Carvalho等[12]報(bào)道了異尖線蟲在巴西番鴨的寄生。

國(guó)內(nèi)對(duì)于鴨源蛔蟲的分子生物學(xué)研究鮮有報(bào)道，診斷也多數(shù)停留在了形態(tài)學(xué)鑒定上。本試驗(yàn)借助分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)鴨源蛔蟲進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定，從18S rRNA的基因同源性分析，本試驗(yàn)中的鴨源蛔蟲屬于雞蛔蟲，這進(jìn)一步佐證了早期臨床研究中對(duì)感染鴨蛔蟲的種類為雞蛔蟲的觀點(diǎn)[1]，為防控鴨群蛔蟲病提供了分子生物學(xué)上的相關(guān)參考。本試驗(yàn)中雞蛔蟲在鴨蛔蟲腸道中的感染，可能與鴨攝入雞蛔蟲的感染性蟲卵有關(guān)。因此，在臨床養(yǎng)殖中鴨群不應(yīng)與雞等家禽混養(yǎng)，且做好環(huán)境消毒，定期使用阿苯達(dá)唑、左旋咪唑等驅(qū)蟲藥物能夠起到防控效果。