劉羽佳，陳堰珊，理 雅，3，徐煒俊，劉博婷，于白音

（1. 韶關(guān)學(xué)院 廣東省粵北食藥資源利用與保護重點實驗室，廣東 韶關(guān) 512005；2.韶關(guān)學(xué)院 英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005； 3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450046）

鐵皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo）是蘭科石斛屬多年附生草本植物，主要分布于中國熱帶和亞熱帶地區(qū)，在海拔800~1 500 m的懸崖或富含腐殖質(zhì)和苔蘚的樹干上常年生長. 在鐵皮石斛的莖和葉中共檢測到649種不同的物質(zhì)，其中以有機酸、氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物和黃酮類化合物為主，因此被譽為“中華九大仙草之首”［1］. 鐵皮石斛干燥莖為中國藥典歷版收載的珍貴中藥材，具有養(yǎng)陰生津、補脾益胃之功效，早在1987年鐵皮石斛就作為瀕危物種被《國家重點保護野生藥材物種名錄》收錄［2］. 研究表明，鐵皮石斛對腸胃病、心血管疾病、糖尿病、腫瘤、白內(nèi)障等均有顯效［3-5］.

近年來，受氣候改變、生境破壞及過度采挖等影響，加之培育者對選育和改良品種缺乏理論依據(jù)，存在盲目引種、缺乏技術(shù)管理體系與質(zhì)量安全保障等問題，嚴重影響了鐵皮石斛種質(zhì)馴化、良種選育、規(guī)范化栽培、安全使用以及產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展［6-7］. 筆者主要對鐵皮石斛種質(zhì)資源與遺傳改良方面進行了歸納，并指出了鐵皮石斛資源保護與利用、良種選育和種質(zhì)創(chuàng)新等方面是未來的重點研究方向，以期為鐵皮石斛野生資源的保護、開發(fā)與可持續(xù)利用及其產(chǎn)業(yè)的長期穩(wěn)定發(fā)展提供借鑒和研究思路.

1 鐵皮石斛種質(zhì)資源概況

1.1 鐵皮石斛重要農(nóng)藝性狀遺傳多樣性研究

鐵皮石斛種質(zhì)的遺傳多樣性主要體現(xiàn)在莖長度、莖粗細、莖形、莖節(jié)數(shù)、節(jié)距、莖稈色、葉形、葉面積、葉色等農(nóng)藝性狀上，其中莖形、節(jié)距、葉形和葉色為影響植株表型性狀的4個主因子，對其居群分類與鑒別起關(guān)鍵作用；同時研究發(fā)現(xiàn)莖長度是其表型性狀差異中數(shù)值最高的，因此莖長度可作為鐵皮石斛品質(zhì)篩選與良種選育的重要指標［8-9］.

鐵皮石斛根據(jù)其生長形態(tài)分為直立、斜立和斜臥生長3種類型，也可根據(jù)不同植株表觀形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)分為F型“軟腳”和H型“硬腳”2種類型，與H型相比，F(xiàn)型莖長度相對較短且質(zhì)地柔軟，具有較多糖類黏液，表皮細胞較薄且角質(zhì)含蠟質(zhì)豐富，外側(cè)纖維群細胞較少，一般不具備下皮層組織，因此是加工鐵皮楓斗的優(yōu)質(zhì)來源［10］. PCR序列檢測顯示，F(xiàn)型和H型分別在其ITS區(qū)第168個堿基位點和5.8 S區(qū)第4個堿基位點上存在顯著差異，表明遺傳差異是決定鐵皮石斛表型性狀的直接因素［11］. 另外，不同地域鐵皮石斛莖稈色具有顯著差異，浙江和福建以淡青色為主，云南和貴州以淡紫色為主，且不同地域其莖長度亦差異較大，表明種植環(huán)境和地理位置不同是造成鐵皮石斛農(nóng)藝性狀表型差異的主要因素［9，12］. 不同居群鐵皮石斛葉面積和數(shù)目存在較大差異，葉面積直接影響作物生長發(fā)育與開花結(jié)果，單片葉面積與葉長寬積之間呈顯著線性關(guān)系，而葉片數(shù)與莖葉總面積呈冪函數(shù)關(guān)系，因此，可以利用F1代葉片數(shù)估計莖總?cè)~面積，從而估計完整植株的葉面積，為科學(xué)篩選雜交植株提供依據(jù)和節(jié)省時間［13］. 此外，利用高通量表型成像技術(shù)，對鐵皮石斛進行多形態(tài)指標如植株高度、水平幅寬、緊密度、投影面積和含水量等檢測［14］，可以減少人為測量和主觀判斷帶來的誤差，以輔助篩選具有優(yōu)質(zhì)性狀且適宜人工栽培的鐵皮石斛優(yōu)良品種. 由此可見，農(nóng)藝性狀表型差異可作為鐵皮石斛種質(zhì)分類、資源鑒定和良種選育的重要依據(jù).

譚嘉娜等發(fā)現(xiàn)隨著鐵皮石斛植齡的增長，其莖長度、鮮葉重與分蘗數(shù)增加，莖長度、莖粗細和鮮葉重均與產(chǎn)量呈極顯著正相關(guān)，分蘗數(shù)與產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)，但莖長度與鮮葉重沒有明顯相關(guān)性［15］，換言之，可以通過增加莖長度和莖粗細，提高鮮葉重與分蘗數(shù)，達到提高產(chǎn)量的目的. 另外，栽培環(huán)境對鐵皮石斛生長發(fā)育和代謝物積累具有較大影響［16］，與設(shè)施盆栽相比，巖壁附生和梨樹附生的鐵皮石斛植株粗壯矮小，莖稈逐漸變?yōu)樽霞t色且根系發(fā)達，葉片稀疏、變厚，氣孔變小而加密，但生物量較低［17］；巖壁附生的鐵皮石斛多糖和醇溶性浸出物成分含量最高（且其醇溶性物質(zhì)的化學(xué)成分最為復(fù)雜），梨樹附生其次，設(shè)施盆栽居末［18］；鐵皮石斛種質(zhì)、種植方式、年限、產(chǎn)地以及形態(tài)特征均對鐵皮石斛總生物堿含量有顯著影響［19］.

1.2 鐵皮石斛種質(zhì)資源分子聚類分析

近年來，由于不同種源鐵皮石斛在不同產(chǎn)地的混亂引種，致使鐵皮石斛種質(zhì)來源日漸模糊，利用分子標記技術(shù)進行聚類分析，能夠較準確地獲得鐵皮石斛種內(nèi)和種間親緣關(guān)系及其遺傳多樣性信息. SSR多態(tài)性聚類分析顯示，紅褐色莖稈與綠色莖稈的鐵皮石斛分別聚在相對獨立的亞組［20］，這一結(jié)論與SRAP標記聚類分析結(jié)果一致，推測莖稈色與鐵皮石斛的親緣關(guān)系存在密切聯(lián)系［21］. 然而，僅依靠單一農(nóng)藝性狀的差異或單一技術(shù)的聚類分析，難以對不同來源鐵皮石斛進行準確區(qū)分［22］，必須采用多種分子標記技術(shù)相結(jié)合的方法來進行聚類分析，才能提高鐵皮石斛種源間遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析的可靠性［23］.

鐵皮石斛基因組內(nèi)含有大量多態(tài)性較高的簡單重復(fù)序列，使其自然種群具有相當豐富的遺傳多樣性［24］. 研究發(fā)現(xiàn)，我國鐵皮石斛主要分布于浙江、江西、福建、云南、廣東等南方地區(qū)，而不同地域分布的鐵皮石斛種質(zhì)間是否存在親緣關(guān)系的相關(guān)性，得出的結(jié)果并不一致. 苑鶴等利用RAPD標記對14個居群的鐵皮石斛進行聚類分析，結(jié)果表明鐵皮石斛種質(zhì)的親緣關(guān)系遠近與其地理種源具有顯著相關(guān)性，與栽培地點無關(guān)［25］，利用RAMP和SSR標記對不同種源地鐵皮石斛親緣關(guān)系的多態(tài)性聚類分析也證實了這一結(jié)論［26-27］，而且隨著方法的改進與人工栽培鐵皮石斛范圍的不斷擴大，鐵皮石斛的區(qū)域差異性有所減弱［28］；徐蕾等利用SSR標記進行遺傳多樣性聚類分析，結(jié)果顯示位于同一居群的鐵皮石斛來源地卻不同，而遺傳相似系數(shù)較大的同源鐵皮石斛卻被分配在不同居群，推測鐵皮石斛親緣關(guān)系與來源地缺少相關(guān)性［29］；Ding等通過ISS與RAPD標記技術(shù)分析了廣東、廣西、浙江等7省共9個鐵皮石斛居群，發(fā)現(xiàn)居群內(nèi)遺傳多樣性高達78%，同樣暗示鐵皮石斛居群間親緣關(guān)系與地域分布缺乏直接相關(guān)聯(lián)系［30］；此外，對比野生與人工栽培的鐵皮石斛的遺傳多樣性，顯示野生與人工栽培的鐵皮石斛存在較遠的親緣關(guān)系，這可能意味著野生鐵皮石斛的遺傳多樣性更為豐富，且群內(nèi)的變異系數(shù)遠大于群間變異系數(shù)［31］. 由此可見，野生鐵皮石斛居群發(fā)生了嚴重遺傳漂變，與過度采挖與源生地環(huán)境惡劣高度相關(guān)，因此迫切需要保護.

2 鐵皮石斛遺傳改良研究現(xiàn)狀

2.1 雜交育種在鐵皮石斛遺傳改良中的應(yīng)用

對具有親本優(yōu)良性狀的植株加以人工培育以獲得遺傳相對穩(wěn)定的新品種，是目前鐵皮石斛育種最主要方法，可以有針對性地開發(fā)鐵皮石斛新品種. 研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛全同胞F1代家系的農(nóng)藝性狀相對穩(wěn)定（半同胞的變異率較高），可以利用來獲得穩(wěn)定且遺傳性狀優(yōu)質(zhì)的家系植株［32］；人工異株授粉試驗發(fā)現(xiàn)，雜交育種技術(shù)可以將鐵皮石斛的結(jié)實率由自然授粉的2%顯著提高至36%［33］. 雜交育種也是提高鐵皮石斛多糖含量的有效手段. 章曉玲發(fā)現(xiàn)，同一環(huán)境不同種源的鐵皮石斛，其多糖含量和醇溶性浸出物種類差異顯著，多糖含量低的可借助含量高的遺傳優(yōu)勢，通過親本雜交顯著提高子代多糖含量，表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢［34］；同樣地，F(xiàn)1代雜交鐵皮石斛產(chǎn)量和主要農(nóng)藝性狀的雜種優(yōu)勢也明顯，與表型因子相關(guān)的莖粗細、葉片數(shù)、葉長寬等量化指標與產(chǎn)量均顯著相關(guān)［35］. 因此，結(jié)合對產(chǎn)量顯著相關(guān)的農(nóng)藝性狀相關(guān)量化指標的監(jiān)測［13］，可以在早期提高鐵皮石斛雜交植株品種選擇的效率.

2.2 誘變育種在鐵皮石斛遺傳改良中的應(yīng)用

目前多采用物理射線和化學(xué)誘變劑等進行鐵皮石斛誘變育種. 其中，137Cs γ射線誘變育種的鐵皮石斛表型性狀會明顯改變：發(fā)育不良、葉片缺綠、老化提前、產(chǎn)生非整數(shù)倍植株但多糖含量變化不大［36］，隨著輻射劑量增加突變率上升、存活率下降，證實誘變育種存在突變方向不受控、有用突變頻率低等［37］；人工模擬UV-B輻射誘變的鐵皮石斛葉片焦黃、掉葉，多糖、黃酮、生物堿等含量增加，但來源不同的植株表現(xiàn)多樣［38］. 空間誘變技術(shù)也是鐵皮石斛育種的有效方法，徐靖等利用太空強輻射、高真空等特殊環(huán)境，將雜交的F1代鐵皮石斛蒴果進行航天搭載，獲得了適應(yīng)性強、抗逆性好、產(chǎn)量高的新品種“仙斛3號”［39］. 常用化學(xué)誘變劑秋水仙素（也可用烷化劑或核酸堿基類似物）能將鐵皮石斛誘變?yōu)槎啾扼w，使得代謝加快、抗逆性強、產(chǎn)量增益［40-41］，但鐵皮石斛不同組織器官對秋水仙堿的耐受不同［42］.另外，鐵皮石斛多倍化不僅可以改變植株形態(tài)，也可增加植株多糖含量［43］：吳睿發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛四倍體多糖含量比二倍體增加了30.34%，多糖合成相關(guān)基因相對表達量均呈上調(diào)變化，其中PEPC顯著上調(diào)［44］. 因此對以多糖為主要藥用成分的鐵皮石斛而言，加大誘變多倍化對多糖、生物堿等的影響研究，對鐵皮石斛優(yōu)質(zhì)品種選育意義重大.

2.3 基因工程技術(shù)在鐵皮石斛遺傳改良中的應(yīng)用

雜交育種是轉(zhuǎn)移篩選后親本的基因鏈，而基因工程育種則是直接轉(zhuǎn)移基因片段并在植物體內(nèi)有效表達出相應(yīng)產(chǎn)物，可以精確對植株進行基因改良［45］. Zhang等成功完成了鐵皮石斛全基因組測序和全基因組基因圖譜繪制，為鐵皮石斛分子水平分析、基因功能鑒定和生理生化效應(yīng)研究奠定了基礎(chǔ)［46］.

目前應(yīng)用于鐵皮石斛基因工程育種的方法主要以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法和花粉管通道法為主，并都以研究適宜轉(zhuǎn)化條件來提高轉(zhuǎn)化率為關(guān)鍵［47］. 如崔波等建立了鐵皮石斛原球莖的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化體系，為鐵皮石斛新品種的開發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)［48］；張振華等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功將建蘭花葉病毒外殼蛋白表達載體導(dǎo)入石斛類球莖，育成抗病毒石斛新品種解決了建蘭花葉病毒對石斛植株造成的葉片發(fā)育不良、開花不正常等問題［49］；武榮花等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶反義基因?qū)腓F皮石斛原球莖，獲得的新植株可減少乙烯合成、抑制開花進而提高鐵皮石斛品質(zhì)［50］；基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)能夠?qū)⒋篼溈购的望}基因嵌入鐵皮石斛植株基因組中，使耐鹽性增強、育種效率提高、育種周期縮短［51］；冼康華等利用花粉管通道法將綠色熒光蛋白基因（GFP）和β-葡萄糖苷酸酶基因（GUS）轉(zhuǎn)入鐵皮石斛基因組中，在成熟的轉(zhuǎn)化種子中檢測到GFP和GUS基因表達信號［52］.

由此可見，基因工程育種對鐵皮石斛遺傳改良具有轉(zhuǎn)化效率高、遺傳穩(wěn)定性好、可轉(zhuǎn)化較大基因片段的優(yōu)勢，可培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)、抗逆性強的藥用優(yōu)良品種，不再受育種周期長、結(jié)果不可測等因素的限制.

2.4 分子標記技術(shù)在鐵皮石斛遺傳改良中的應(yīng)用

利用分子標記技術(shù)與分子設(shè)計育種能提高鐵皮石斛品種鑒別［53］和親緣關(guān)系分析的準確性［54］. 研究發(fā)現(xiàn)，石斛屬葉綠體DNA中LSC區(qū)的psbK-psbI序列在不同石斛種間均存在差異，可作為石斛屬鑒別的內(nèi)參基因［55］. 徐慧君用RT-PCR結(jié)合ARMS方法對鐵皮石斛和其他石斛的楓斗進行區(qū)分，能有效減弱石斛多糖含量高對DNA多態(tài)性條帶擴增的干擾［56］. 同時，應(yīng)用分子標記技術(shù)可對不同來源鐵皮石斛進行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析. 曹奕鴦等研究發(fā)現(xiàn)，與其它石斛屬植物相比，福建泰寧野生鐵皮石斛葉綠體DNA rps 16序列變異較大，多樣性較高，其中T2型、T65型、D5型是泰寧野生鐵皮石斛獨有的DNA rps序列，推斷泰寧是福建與周邊野生石斛發(fā)源地之一［57］.

由于種質(zhì)豐富的遺傳多樣性、人工種植工序繁瑣極可能產(chǎn)生種質(zhì)混雜，加之忽視選育，鐵皮石斛已產(chǎn)生了多種遺傳變異類型，容易導(dǎo)致栽培整齊度差、產(chǎn)量低、品質(zhì)不穩(wěn)定［58］. 因此，今后鐵皮石斛選育應(yīng)考慮但不限于以下方面：一是完善人工栽培大幅提高種質(zhì)純度；二是多利用ISSR、TRAP、SSR等分子標記技術(shù)來區(qū)分野生還是人工品種［27，59］，并準確鑒別品種來源地區(qū)［24，60］.

3 研究展望

近年來，野生鐵皮石斛的種質(zhì)資源日漸減少、種質(zhì)來源日漸模糊、中藥臨床療效減退、用藥安全堪憂. 那么，采取何種措施才能有效保護鐵皮石斛種質(zhì)資源，實現(xiàn)該產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展呢？目前已有研究多是從種質(zhì)資源的某一或兩個方面進行剖析，實際上種質(zhì)資源的保護與利用必然是辯證統(tǒng)一、相互依存、協(xié)同發(fā)展的，因此，有關(guān)鐵皮石斛的種質(zhì)資源收集、質(zhì)量評價體系、栽培技術(shù)標準等方面的規(guī)范化管理策略構(gòu)建，以及重要性狀精準鑒定技術(shù)和優(yōu)良種質(zhì)發(fā)掘利用等的研究亟待加強，挖掘多種分子標記技術(shù)協(xié)同優(yōu)化的聚類分析方法更需系統(tǒng)深入研究. 目前鐵皮石斛種質(zhì)選育多為傳統(tǒng)的選擇育種和雜交育種，而以基因工程技術(shù)和分子標記技術(shù)為核心的生物育種技術(shù)已逐步得到應(yīng)用；隨著鐵皮石斛全基因組基因圖譜繪制完成，生物育種（包括轉(zhuǎn)基因育種、分子標記育種、分子設(shè)計育種等）技術(shù)能提高育種的精確性、高效性、可控性和預(yù)見性，并已為加快蘭科植物的發(fā)育速度和種質(zhì)的快速識別與鑒定提供了可能性［7，61］. 因此，鐵皮石斛的資源利用和種質(zhì)創(chuàng)新需加強基因功能方面研究，并從分子水平闡明功能基因的表達模式及其生長調(diào)控機制. 此外，代謝組學(xué)研究表明，鐵皮石斛莖和葉上的代謝物質(zhì)相似，且葉片含有較高水平脂質(zhì)含量［62］，可對葉片和花朵進行開發(fā)利用與安全性評價研究，充分挖掘鐵皮石斛各器官的藥用功效.

建議在鐵皮石斛種質(zhì)資源保護與生物育種實踐方面，今后需加大以下幾方面的研究：（1）根據(jù)不同種源地野生鐵皮石斛所處的生態(tài)環(huán)境，按其生物特性、環(huán)境適應(yīng)性與生境破壞程度對種質(zhì)進行就地保護、遷地保護或發(fā)展人工栽培技術(shù)；（2）盡可能收集來自不同種源地鐵皮石斛資源，建立本地基地，加強對野生鐵皮石斛的馴化，建立種質(zhì)信息管理系統(tǒng)，共享鐵皮石斛種質(zhì)資源；（3）提高鐵皮石斛種植業(yè)的培育技術(shù)標準，選育適合本地栽培的優(yōu)良品種，保證鐵皮石斛的藥用品質(zhì)與種植效益；（4）加速推進鐵皮石斛功能基因研究，揭示種間與種內(nèi)遺傳物質(zhì)的流向，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，為優(yōu)良新種的選育奠定堅實基礎(chǔ).