林馥嘉 歐財文 柯培鋒 陳曲波 徐建華

廣東省中醫(yī)院檢驗科，廣州 510120

隨著現(xiàn)代社會人們的生活方式改變及日常工作中心理壓力的上升，腎結(jié)石患者的發(fā)病率已經(jīng)呈現(xiàn)了逐年攀升的態(tài)勢，我國腎結(jié)石患者發(fā)病率為1%～5%［1-2］。腎結(jié)石主要是泌尿系統(tǒng)的一種非常常見的多發(fā)性疾病，是擺在我們面前的一大難題。因此，在積極治療泌尿系結(jié)石患者的同時，重視和加強對結(jié)石病變的預防和復發(fā)措施也是必不可少的。

本研究擬通過建立動物實驗型，探討檸檬烏梅提取液對預防腎草酸鈣結(jié)石的協(xié)同作用機制，為進一步臨床預防腎結(jié)石以及開發(fā)新藥提供理論基礎(chǔ)依據(jù)。

材料與方法

1、實驗動物

SPF級雄性Wistar大鼠50只，體質(zhì)量200～250 g，由廣州中醫(yī)藥大學動物研究中心進行提供。

2、儀器與試劑

日立7180全自動分析儀和配套的化學試劑，Olympus光學顯微鏡，白洋牌常規(guī)離心機，良平電子天平，超速離心機（Eppendorf，離心半徑為11 cm），石蠟切片機（德國萊卡），pH計（梅特勒-托利），乙二醇和氯化銨（天津市天力化學試劑有限公司），兔抗骨橋蛋白（OPN）的多克隆動物抗體和動物免疫組化SP試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

3、檸檬烏梅提取液提取

首先取新鮮的檸檬100 g，洗凈，置于2 000 ml大小的燒瓶中，加二次性溫開水800 ml，煮沸60 min，過濾。濾渣首先加二次性清水600 ml，煮沸40 min，過濾。合并兩次檸檬過濾液，濃縮后即可形成一種具有可溶性生藥濃度含量范圍大約為0.05 g/ml的中性檸檬原液，用高速離心機對原液進行離心（16 000 r/min，離心半徑為11 cm）10 min，取出檸檬上清液，即檸檬提取液。取新鮮烏梅100 g，洗凈，放入2 000 ml大小的燒杯中，加二次性溫開水800 ml，煮沸60 min，過濾。濾渣再加二次性清水600 ml，煮沸40 min，過濾。合并兩次上清過濾液，濃縮后即可形成一種生藥濃度含量范圍大約為0.05 g/ml的烏梅上清原液，用高速離心機對原液進行離心（16 000 r/min，離心半徑為11 cm）10 min，取出烏梅上清液，即烏梅提取液。兩種提取液混合搖勻得檸檬烏梅提取液。

4、建立腎草酸鈣結(jié)石模型和給藥

參照曹正國等［3］研究者的建模方法，選擇分組使用SPF級雄性Wistar大鼠50只，在適應環(huán)境變化條件下連續(xù)飼養(yǎng)3 d后，按隨機數(shù)字表法分為5組，每組10只，設立A組（對照組）、B組（成石組）、C組（檸檬提取液組）、D組（烏梅提取液組）、E組（檸檬烏梅提取液組）。參照《中藥藥理研究方法學》計算劑量，A組大鼠以自來水作為日常飲用水，每天用純凈水灌胃；B組以含1%乙二醇+2%氯化銨的自來水作為日常飲用水，每天用純凈水灌胃；C、D、E組在B組的基礎(chǔ)上每天分別以檸檬提取液、烏梅提取液、檸檬烏梅提取液灌胃；連續(xù)喂養(yǎng)4周。

5、檢測指標和檢測方法

第30天收集24 h尿液，檢測尿量、尿鈣（尿Ca2+）、尿尿酸（尿UA）、尿肌酐（尿Cr）、尿草酸（尿OX）檢測；第30天，20%濃度的烏拉坦（0.7 ml/kg）進行腹腔麻醉后，下腔靜脈采血3～5 ml，離心后取上清液，全自動生化分析儀檢進行測大鼠血中肌酐（血Cr）、尿素氮（尿BUN）、鈣（血Ca2+）、磷（血P）的含量；第30天，切取腎臟做冰凍切片，偏光顯微鏡下進行觀察，記錄腎臟組織結(jié)晶的情況及腎小管擴張的情況；第30天，留取腎臟，采用10%中性福爾馬林固定腎臟組織制成3μm的石蠟切片，脫出石蠟后入水，使用免疫組化和蘇木素復染，制片，顯微鏡下即可觀察結(jié)果，病理軟件分析OPN含量結(jié)果。

6、統(tǒng)計分析方法

本文采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對所有組間參數(shù)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，其中所有組間參數(shù)等計量資料均符合正態(tài)分布，用（±s）表示，組間差異用獨立樣本t檢驗，結(jié)晶評分及OPN強度評分用秩和檢驗進行統(tǒng)計學分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1、各組大鼠24 h尿液的相關(guān)結(jié)果

各組大鼠24 h尿液的相關(guān)結(jié)果如表1所示：B組的24 h尿量明顯低于其他各組，結(jié)果數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），C組和D組的24 h尿量明顯低于A組，結(jié)果數(shù)據(jù)差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），E組的24 h尿量也明顯低于A組，結(jié)果數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），C組、D組、E組3組的24 h尿量相比，結(jié)果數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。E組尿液pH的測定結(jié)果比B組高，結(jié)果數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其余各組相比差異變化不大，結(jié)果數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。B組、C組和D組的24 h尿Ca2+結(jié)果明顯高于A組和E組，結(jié)果數(shù)據(jù)差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），A組、E組的24 h尿Ca2+結(jié)果相比差異不大，結(jié)果數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。B組、C組、D組、E組的24 h尿OX結(jié)果明顯高于A組，結(jié)果數(shù)據(jù)差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），與B組相比，C組和D組的24 h尿OX含量減少，結(jié)果數(shù)據(jù)差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），E組24 h尿OX的含量明顯降低，結(jié)果數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），C組和D組的24 h尿OX高于E組，結(jié)果數(shù)據(jù)差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。B組、C組、D組的24 h尿UA結(jié)果明顯高于A組，結(jié)果數(shù)據(jù)差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），與A組相比，E組的24 h尿UA增高，結(jié)果數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），C組、D組和E組的24 h尿UA結(jié)果明顯低于B組，結(jié)果數(shù)據(jù)差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。B組的24 h尿Cr明顯低于A組、C組和E組，結(jié)果數(shù)據(jù)差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），低于D組，結(jié)果數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），C組和D組的24 h尿Cr低于A組，結(jié)果數(shù)據(jù)差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），C組和D組的24 h尿Cr低于E組，結(jié)果數(shù)據(jù)差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），A組和E組的24 h尿Cr變化不大，結(jié)果數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠24 h尿液尿量、尿pH值、尿Ca2+、尿OX、尿UA、尿Cr比較（±s）

表1 各組大鼠24 h尿液尿量、尿pH值、尿Ca2+、尿OX、尿UA、尿Cr比較（±s）

注：A組大鼠以自來水作為日常飲用水，每天用純凈水灌胃；B組以含1%乙二醇+2%氯化銨的自來水作為日常飲用水，每天用純凈水灌胃；C、D、E組在B組的基礎(chǔ)上每天分別以檸檬提取液、烏梅提取液、檸檬烏梅提取液灌胃；OX為草酸，UA為尿酸，Cr為肌酐；與A組相比，a P＜0.01，b P＜0.05；與B組相比，c P＜0.01，d P＜0.05；與E組相比，e P＜0.01，f P＜0.05

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2、各組血液的相關(guān)生化指標結(jié)果

各組的大鼠血液相關(guān)生化指標測定結(jié)果如表2所示：B組的相關(guān)生化大鼠血液BUN明顯高于其他各組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），與A組相比，C組、D組和E組的相關(guān)生化大鼠血BUN明顯增高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），C組、D組、E組3組的相關(guān)生化大鼠血BUN相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。B組的大鼠血液Cr明顯高于其他各組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），與A組相比，C組、D組和E組的血Cr明顯增高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），C組和E組的大鼠血Cr相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），D組和E組的大鼠血Cr相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。各組大鼠的血Ca2+和血P的檢測結(jié)果比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

表2 各組大鼠血BUN、血Cr、血Ca2+、血P比較（±s）

表2 各組大鼠血BUN、血Cr、血Ca2+、血P比較（±s）

注：A組大鼠以自來水作為日常飲用水，每天用純凈水灌胃；B組以含1%乙二醇+2%氯化銨的自來水作為日常飲用水，每天用純凈水灌胃；C、D、E組在B組的基礎(chǔ)上每天分別以檸檬提取液、烏梅提取液、檸檬烏梅提取液灌胃；BUN為尿素氮，Cr為肌酐，P為磷；與A組相比，a P＜0.01，b P＜0.05；與B組相比，c P＜0.01；與E組相比，d P＜0.05

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3、各組大鼠腎臟病理切片中草酸鈣晶體結(jié)果

草酸鈣結(jié)晶在HE及Van-Kossa，s染色病理切片上呈現(xiàn)黑褐色。A組的大鼠沒有看到任何草酸鈣結(jié)晶沉積和腎小管不見任何擴張（圖1A）；B組鏡下多數(shù)腎小管腔內(nèi)均存在連續(xù)片狀結(jié)晶，部分腎小管存在連續(xù)的團狀結(jié)晶，可以清楚地看到見腎小管管腔明顯的擴張（圖1B）；C組、D組和E組鏡下即可觀察，小部分腎小管管腔擴張，腎小管管腔中偶爾可見一定量的點狀散布草酸鈣結(jié)晶，偶爾也可見成為片狀結(jié)晶，草酸鈣結(jié)晶沉積和腎小管管腔擴張等情況均顯著較B組改善（圖1C）。結(jié)晶分級見表3，根據(jù)表3數(shù)據(jù)，采用多個單獨樣品進行比較的Kruskal-Wallis H檢驗，可以確定各組腎小管的結(jié)晶差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中A組無結(jié)晶形成，B組結(jié)晶最明顯。相對B組，C組、D組和E組各組含有少量的草酸鈣結(jié)晶。C組、D組和E組組間比較，采用Kruskal-Wallis H檢驗，E組與C組和D組組間腎小管結(jié)晶差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），C組與D組組間腎小管結(jié)晶差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠腎臟病理切片中草酸鈣晶體結(jié)果。A：A組，HE染色，×200；B：B組，HE及Van-Kossa，s染色，×400；C：C組、D組、E組，HE及Van-Kossa，s染色，×400

表3 各組大鼠腎小管草酸鈣結(jié)晶分級（只）

4、各組大鼠腎臟OPN結(jié)果

OPN在各組大鼠的腎臟組織中均有表達，實驗發(fā)現(xiàn)在腎近曲小管和遠曲小管、亨利氏袢、集合導管（主要髓袢升支）上表達最為突出，在皮質(zhì)腎小球中反而未發(fā)現(xiàn)有OPN的表達。A組大鼠只能檢測到OPN微量表達（圖2A），但是B組大鼠腎組織中OPN表達則明顯增強（圖2B），C組、D組和E組大鼠腎組織中OPN表達強度高于A組、低于B組（圖2C）。各組大鼠OPN表達強度比較見表4，根據(jù)表4數(shù)據(jù)，采用多個組的獨立組對樣本分組進行定量比較的方法Kruskal-WallisH檢驗，可以得出確定各組腎小管OPN表達強度差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其A組的OPN表達最少，B組的OPN表達最明顯，C組、D組、E組的OPN表達強度次之。C組、D組和E組組間比較，采用Kruskal-Wallis H檢驗，統(tǒng)計結(jié)果為C組、D組和E組組間的OPN表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠OPN表達強度（只）

圖2 各組大鼠腎臟OPN結(jié)果。A：A組髓質(zhì)OPN（×400）；B：B組髓質(zhì)OPN（×400）；C：C組、D組、E組髓質(zhì)OPN（×400）

討 論

腎結(jié)石的形成是一個復雜而隱匿的過程，多年來眾多學者提出了許多學說，如腎鈣斑學說、基質(zhì)學說、免疫損傷學說等［4］。目前研究認為，腎結(jié)石的形成是一個多因素互相作用的結(jié)果，其中包括促進因素，如基因易感性、體內(nèi)物質(zhì)代謝異常、腎解剖異常［5］，也包括檸檬酸、磷酸鹽、OPN等抑制因素［6-8］。腎結(jié)石主要成分包括草酸鈣結(jié)石（70%）、磷酸鈣結(jié)石（10%）、尿酸鈣結(jié)石（17%）及胱氨酸結(jié)石等［1］。草酸鈣結(jié)石最為常見，草酸鈣結(jié)石的全年發(fā)病率大概為每年占我國泌尿系結(jié)石總發(fā)病患者全年發(fā)病率的60%～80%［4］，研究解決草酸鈣結(jié)石臨床形成機制問題尤其具有重要的學術(shù)科學性和重要臨床意義。

近幾年，國外學者通過對比結(jié)石患者飲用可樂、咖啡、蘇打水、檸檬酸飲料及正常飲食對結(jié)石形成作用的研究顯示，飲用檸檬酸飲料的尿量升高、尿枸櫞酸濃度增加、草酸鈣飽和度減低，尿酸濃度降低，降低了結(jié)石復發(fā)率等［9-10］。臨床系統(tǒng)評價也顯示檸檬預防腎結(jié)石的有效性［11］，且無不良作用。薔薇科杏屬植物烏梅為多年生草本植物，烏梅葉、果、根等均可入藥，傳統(tǒng)用于治療久咳、久瀉、虛熱煩渴、痢疾、便血、尿血等癥［12］。商英成等［13］通過雄性大鼠動物學模型研究了烏梅對草酸鈣晶體生長的抑制影響，發(fā)現(xiàn)烏梅提取液在草酸鈣晶體中的生成過程中具有抑制性作用，且其抑制性作用也會隨烏梅提取液中含水量和濃度的減少而進一步增加。

本實驗研究結(jié)果表明，檸檬提取液、烏梅提取液和檸檬烏梅提取液都可以顯著降低腎結(jié)石大鼠尿液Ca2+、尿液OX、尿液UA等水平，提高尿液pH水平，增加大鼠的排尿量，提高Cr排泄，能有效抑制腎臟組織草酸鈣結(jié)晶的形成，降低血BUN和Cr含量。給予檸檬提取液、烏梅提取液和檸檬烏梅提取液后，組織病理學檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腎臟組織內(nèi)草酸鈣結(jié)晶顯著程度減少，未見良性腎小管明顯厚度增大和小管擴張，OPN表達強度降低。通過分析原因，可能是檸檬和烏梅中的枸櫞酸與鈣離子發(fā)生絡合反應，減輕了腎臟的損傷，保護腎功能。通過OPN表達實驗結(jié)果分析，檸檬烏梅提取液可能通過降低腎臟OPN的表達來抑制大鼠草酸鈣結(jié)晶的形成。而且C組、D組、E組的實驗結(jié)果分析顯示，檸檬提取液、烏梅提取液和檸檬烏梅提取液都能降低尿Ca2+，但檸檬烏梅提取液降低尿液Ca2+的功能明顯較強；檸檬提取液、烏梅提取液和檸檬烏梅提取液都能降低尿OX含量，但檸檬烏梅提取液降低尿液OX的功能明顯較強；檸檬提取液、烏梅提取液和檸檬烏梅提取液都能降低尿UA含量，但檸檬烏梅提取液降低尿液UA的功能明顯較強；檸檬提取液、烏梅提取液和檸檬烏梅提取液都能降低大鼠血液BUN的含量，且降低大鼠血BUN的功能一致；檸檬提取液、烏梅提取液和檸檬烏梅提取液都能降低大鼠血液Cr的含量，檸檬提取液和檸檬烏梅提取液降低大鼠血Cr的功能一致，而檸檬烏梅提取液降低大鼠血Cr的功能比烏梅提取液好。通過腎小管草酸鈣結(jié)晶分級結(jié)果，檸檬烏梅提取液抑制腎小管結(jié)晶生成能力比檸檬提取液、烏梅提取液強。分析其原因可能為檸檬和烏梅的協(xié)同作用，增強了枸櫞酸與鈣離子發(fā)生絡合反應，大大減輕了腎小管草酸鈣結(jié)晶的生成。

綜上所述，檸檬烏梅提取液能有效抑制大鼠草酸鈣腎結(jié)石的形成，但檸檬烏梅提取液的有效活性成分和其更多的功能還有待進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突