包杰，寧梓健，豐程程，姜宏波,2*

(1. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.東北畜禽疫病研究教育部重點實驗室，遼寧 沈陽 110866)

微孢子蟲是一類高度進(jìn)化的、專性營細(xì)胞內(nèi)寄生的單細(xì)胞真核生物，普遍存在于自然環(huán)境中，宿主類型多樣，可感染包括人在內(nèi)的所有動物[1-3]。目前為止，已有約200個屬，1 500余種微孢子蟲被報道[4-6]。經(jīng)過對微孢子蟲150多年的探究，科研人員發(fā)現(xiàn)其特征具有獨特性：裂殖增殖期過渡至孢子形成期，孢子形態(tài)產(chǎn)生差異；在細(xì)胞水平上，缺乏過氧化物酶體和典型的高爾基體結(jié)構(gòu)[7-8]；已進(jìn)化出極管和孢壁參與的獨特侵染機(jī)制[3]。微孢子蟲游離于胞外環(huán)境時，其孢壁蛋白可能與宿主細(xì)胞上的信號分子識別互作，觸發(fā)極管彈出以刺破宿主細(xì)胞膜，隨之迅速將含有遺傳物質(zhì)的孢原質(zhì)注入宿主細(xì)胞，開始胞內(nèi)寄生階段[8-10]。鑒于孢壁在入侵裝置中的重要作用，研究其組成對闡明宿主與寄生蟲相互作用的機(jī)制具有重要意義。

微孢子蟲的孢壁由3部分組成，分別為致密的外壁、較厚的電子透明內(nèi)壁和包圍孢原質(zhì)的質(zhì)膜。多項研究表明，孢壁中包含許多孢壁蛋白(spore wall protein，SWP)，其為孢壁提供結(jié)構(gòu)支撐，保護(hù)孢原質(zhì)免受環(huán)境壓迫的同時，也參與到信號傳遞、粘附等重要的生理過程中。在兔腦炎微孢子蟲(Encephalitozooncuniculi)、腸腦炎微孢子蟲(Encephalitozoonintestinealis)的內(nèi)壁和外壁，已成功地定位到幾種孢壁蛋白[11-12]。此外，一些研究人員還發(fā)現(xiàn)孢壁蛋白可通過宿主細(xì)胞表面GAG粘附在宿主細(xì)胞上[13-14]。

蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoonhepatopenaei，EHP)2001年首次發(fā)現(xiàn)于日本囊對蝦(Penaeusjaponicus)的肝胰腺上皮細(xì)胞內(nèi)[15]。直到2009年，Tourtip等[16]通過顯微觀察和分子檢測等技術(shù)手段將其命名。EHP極具傳染性，目前世界上主要的凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)養(yǎng)殖地區(qū)都有蝦肝腸胞蟲病的報道，給對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。因此，探究EHP感染機(jī)制對該病的預(yù)防與治療具有指導(dǎo)性意義。微孢子蟲的所有成員都有一種獨特的、高度專業(yè)化的入侵機(jī)制，涉及極管和孢壁，但關(guān)于EHP孢壁結(jié)構(gòu)的研究較少。因此，本研究以EHP全基因組中鑒定到的孢壁蛋白SWP7為研究對象，首先通過生物信息學(xué)方法對其序列基本特征進(jìn)行分析，然后合成該基因序列、構(gòu)建原核表達(dá)載體和表達(dá)純化蛋白，最后制備多克隆抗體。通過Western blotting 驗證該抗體的特異性后，利用間接免疫熒光技術(shù)觀察和分析該蛋白在成熟孢子上的定位情況，為深入研究EHP孢壁結(jié)構(gòu)和入侵機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

蝦肝腸胞蟲樣品由本實驗室保存，新西蘭白兔購自重慶市第三軍醫(yī)大學(xué)。實驗所需試劑有：Acr、Bis、Tris和弗氏佐劑(Sigma)；6xHis標(biāo)簽蛋白純化和BCA蛋白濃度測定試劑盒(ProbeGene)；Percoll細(xì)胞分離液(鼎國生物)；Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG(生工生物)。

1.2 SWP7基因序列的生物信息學(xué)分析

從Genbank下載獲得編碼為OQS55031.1_1的SWP7蛋白氨基酸序列；利用ExPASy預(yù)測和分析SWP7氨基酸組成、分子式、等電點等理化特征；SignalP-4.0用于分析SWP的信號肽；KohGPI篩選錨定位點；使用TMHMM Server v.2.0預(yù)測跨膜域；用NetOGlyc3.1Server和NetNGlyc 1.0 Server預(yù)測和分析O-糖基化和N-糖基化位點；利用NetPhos 2.0 Server預(yù)測磷酸化位點；通過ProtScale分析SWP7的疏水性；應(yīng)用SMART預(yù)測SWP7的功能結(jié)構(gòu)域。

1.3 SWP7基因克隆

根據(jù)蝦肝腸胞蟲SWP7序列信息、His標(biāo)簽以及酶切位點位置，設(shè)計載體構(gòu)建方案見圖1，基因合成這一序列。通過雙酶切膠回收PCR擴(kuò)增片段以獲得目的片段；pET28a載體采用NcoI/XhoI 雙酶切線性化后通過膠回收獲得載體片段；再將上述目的DNA片段連接至載體中。連接反應(yīng)條件為22.0 ℃，1 h；體系為載體片段4.0 μL，目的基因片段8.0 μL，10×T4 Ligase buffer 2.0 μL，T4 DNA Ligase 1.0 μL，加ddH2O至20.0 μL。將連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TOP10感受態(tài)菌株中，涂布于含有抗生素的LB平板進(jìn)行培養(yǎng)。挑取單克隆菌落稀釋100倍后作為DNA模板，采用pET載體通用引物(T7)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選取陽性菌落擴(kuò)培后，提取其質(zhì)粒進(jìn)行測序驗證。

圖1 SWP7序列載體構(gòu)建方案Fig.1The vector construction scheme of SWP7 sequence

1.4 SWP7蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將陽性單克隆菌落接種至無菌的LB液體培養(yǎng)基(含50 mg/L的卡納霉素)，37.0 ℃培養(yǎng)至OD600約為0.6時，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)pET28a-SWP7表達(dá)，2 h后將培養(yǎng)基離心獲得菌體，利用Western Blot檢測蛋白表達(dá)情況。用Ni-IDA柱純化以上收集到的菌體蛋白。

1.5 SWP7多克隆抗體的制備和Western Blot分析

將純化后的SWP7重組蛋白與弗氏佐劑按1∶1混合均勻，至呈乳化狀態(tài)，通過皮下免疫對2只新西蘭白兔(2.0～2.5 kg)注射4次，每次400.0 μg。第1次免疫注射液為重組蛋白與完全弗氏佐劑的混合液。第1次免疫后每隔2～3周通過重組蛋白與不完全弗氏佐劑混合進(jìn)行強(qiáng)化免疫。免疫過程中，通過間接ELISA方法監(jiān)測抗血清針對SWP7的效價，當(dāng)效價大于1∶50 000時收集抗體。

取適量處理后的蛋白樣品在12% SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，再用牛血清白蛋白進(jìn)行封閉，用稀釋好的一抗孵育，洗滌，隨后用稀釋好的二抗孵育，再次洗滌，最后曝光和顯色。

1.6 間接免疫熒光實驗

將EHP樣品均勻涂在粘附性載玻片上，室溫過夜；4%多聚甲醛固定后用PBS緩沖液沖洗；1%Triton X-100透明處理(無菌操作)后用PBS緩沖液沖洗；然后用5%牛血清白蛋白封閉；在載玻片上均勻滴加用封閉液稀釋100倍的anti-SWP7，輕輕蓋上一層封口膜(無氣泡)，4.0 ℃孵育過夜，對照組載玻片滴加封閉液稀釋的免疫前兔血清并以同樣方式進(jìn)行孵育，然后用PBS沖洗；避光條件下向載玻片均勻滴加用PBS稀釋100倍的熒光二抗[羊抗兔二抗，Alexa488(GAR-Alexa488)]，37 ℃恒溫?fù)u床避光孵育1 h后用PBS沖洗；避光條件下向載玻片均勻滴加DAPI染料，室溫孵育；輕輕蓋上蓋玻片，立即于倒置熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 SWP7基因序列的生物信息學(xué)分析

通過ExPASy在線軟件對SWP7序列的基本特征進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：SWP7由250個氨基酸組成，分子質(zhì)量為27.8 kDa，等電點為5.25。SignalP 4.0預(yù)測SWP7的N端具有一個疏水峰，信號肽剪切位點位于第21～22個氨基酸之間(圖2)。SWP7無GPI錨定位點和跨膜域(圖3)，通過ProtScale對SWP7疏水性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，SWP7的前25個左右的氨基酸疏水性較高(圖4)，符合信號肽預(yù)測的疏水性峰位置。SWP7沒有潛在的糖基化位點，但有多個磷酸化位點(圖5)，主要集中在蘇氨酸(Thr)、絲氨酸(Ser)和酪氨酸(Tyr)上。另外，未在SWP7序列中預(yù)測到已知功能的結(jié)構(gòu)域。

圖2 SWP7的信號肽預(yù)測分析Fig.2The prediction analysis of signal peptide in SWP7

圖3 SWP7的跨膜域預(yù)測分析Fig.3The prediction analysis of transmembrane domain in SWP7

圖4 SWP7的疏水性預(yù)測分析Fig.4The hydrophobicity prediction analysis of SWP7

圖5 SWP7的磷酸化位點預(yù)測分析Fig.5 The prediction analysis of phosphorylation site inSWP7

2.2 SWP7基因克隆

根據(jù)從基因組數(shù)據(jù)庫下載的SWP7序列信息，基因合成該序列(689 bp)并連接到pET28a載體上，重組質(zhì)粒雙酶切驗證構(gòu)建pET28a-SWP7陽性克隆(圖6-A)。將目的DNA 片段與載體連接，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌，涂布培養(yǎng)后篩選陽性菌落進(jìn)行PCR鑒定(圖6-B)。結(jié)果顯示擴(kuò)增所得條帶與目的條帶長度一致。選取陽性單克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)培，然后提取質(zhì)粒，測序比對結(jié)果正確，表明已成功構(gòu)建pET28a-SWP7原核表達(dá)載體。

2.3 SWP7蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將上述陽性單克隆菌落于37 ℃恒溫培養(yǎng)4 h至OD600約為0.6左右，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)pET28a-SWP7表達(dá)2 h后，收集蛋白并電泳檢測表達(dá)情況(圖7-A)。電泳結(jié)果顯示：誘導(dǎo)的重組菌在28 kDa處有明顯的高表達(dá)條帶，而未誘導(dǎo)的重組菌沒有該條帶。放大培養(yǎng)后，用6xHis標(biāo)簽蛋白純化試劑盒對SWP7蛋白進(jìn)行純化，結(jié)果如圖7-B，可以看出，SWP7主要以包涵體形式存在于沉淀中，且純度較高，上清液中目的蛋白很少，不易純化，接著對SWP7包涵體進(jìn)行復(fù)性和濃縮(圖8)，最終獲得約8.0 mg蛋白。

圖6 蝦肝腸胞蟲SWP7原核表達(dá)載體的構(gòu)建(A) pET28a-SWP7重組質(zhì)粒雙酶切驗證。1：質(zhì)粒DNA；2：pET28a-SWP7重組質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物；M：4500bp marker；(B) pET28a-SWP7重組質(zhì)粒菌落PCR鑒定。M：5000bp marker；1-5：pET28a-SWP7菌檢。Fig.6 The prokaryotic expression vector construction of EHP SWP7(A) The enzyme digestion analysis of pET28a-SWP7 recombinant plasmid. 1: Plasmid DNA; 2: The enzyme digested products of pET28a-SWP7 recombinant plasmid; M: 4500bp marker; (B) The bacterial colony PCR identification of pET28a-SWP7 recombinant plasmid. M: 5000bp marker; 1-5: The bacterial colony of pET28a-SWP7 recombinant plasmid.

圖7 pET28a-SWP7重組蛋白表達(dá)及純化的SDS-PAGE檢測(A)pET28a-SWP7誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白驗證 M：蛋白質(zhì)marker；0：pET28a-SWP7總菌體裂解液(未誘導(dǎo))；1-2：pET28a-SWP7總菌體裂解液(0.5 mmol/L IPTG 37 ℃，誘導(dǎo)2小時)；(B) pET28a-SWP7融合蛋白的純化 M：蛋白質(zhì)marker；0：超聲沉淀；1：超聲上清；2：流出；3：Ni-IDA洗滌；4：Ni-IDA洗脫；5：殘留。Fig.7The SDS-PAGE analysis of expression and purification of pET28a-SWP7 recombinant protein(A)The SDS-PAGE electropherogram of induced pET28a-SWP7 recombinant protein expressed in bacterium. M: Protein marker; 0: The uninduced pET28a-SWP7 recombinant protein expressed in total bacterial lysate; 1-2: The induced pET28a-SWP7 recombinant protein expressed in total bacterial lysate (0.5 mmol/L IPTG at 37 ℃ for 2 hours); (B) The purification of pET28a-SWP7 fusion protein; M: Protein marker; 0: The precipitation after ultrasonic treatment; 1: The supernatant after ultrasonic treatment; 2: The effluent; 3: The washing liquid of Ni-IDA; 4: The elution of Ni-IDA; 5: The residuum.

圖8 pET28a-SWP7重組表達(dá)蛋白復(fù)性M：蛋白質(zhì) marker；1：pET28a-SWP7重組表達(dá)蛋白復(fù)性前；2：復(fù)性后濃縮。Fig.8 The renaturation of pET28a-SWP7 recombinant proteinM: Protein marker; 1: The induced pET28a-SWP7 recombinant protein before renaturation; 2: The induced pET28a-SWP7 recombinant protein after renaturation and concentration.

2.4 SWP7多克隆抗體的制備和Western Blot分析

用處理過的SWP7蛋白免疫新西蘭白兔，8～12周后收集血液，通過間接ELISA法測定抗血清對SWP7的效價大于121 500(表1)。通過Weatern blotting檢測抗血清(圖9)，結(jié)果表明：一抗稀釋1 000倍，二抗稀釋5 000倍時，抗體特異性很好，稀釋1 000倍使用時仍可以檢測出2.0 ng SWP7蛋白，靈敏度較高；并且SWP7蛋白Western Blot檢測條帶單一，與理論分子量相當(dāng)，表明成功制備了SWP7多克隆抗體。

表1 抗血清間接Elisa結(jié)果Tab.1 Antiserum indirect Elisa results

圖9 SWP7多克隆抗體免疫印跡分析M：Western blot ECL marker；1：SWP7蛋白1.0 ng；2：SWP7蛋白2.0 ng；3：SWP7蛋白5.0 ng。Fig.9The western blot analysis of anti-SWP7 polyclonal antibodies in rabbitM: Western blot ECL marker; 1: SWP7 of 1.0 ng; 2: SWP7 of 2.0 ng; 3: SWP7 of 5.0 ng.

2.5 間接免疫熒光實驗

利用間接免疫熒光實驗對蝦肝腸胞蟲SWP7進(jìn)行定位分析，結(jié)果如圖10所示，在倒置熒光顯微鏡下，觀察到SWP7抗體與孢壁識別發(fā)出綠色熒光，在明場下顯示為橢圓形的成熟孢子，在藍(lán)色熒光通道下，可觀察到明亮的藍(lán)色熒光，證明未萌發(fā)的EHP孢壁上有SWP7表達(dá)。

圖10 間接免疫熒光實驗(IFA)檢測蝦肝腸胞蟲SWP7的定位A：對照組；B：實驗組；DIC：明場；DAPI：示核，標(biāo)記孢子位置；Alexa488：多克隆抗體標(biāo)記SWP7在孢子中的定位信息；Merge：疊加圖；比例尺=5.0 μm.Fig.10 The IFA analysis of the localization of SWP7A: Control group; B: Experimental group; DIC: Bright field; DAPI: Nucleus stained by DAPI, indicating spores location; Alexa488: The anti-SWP7 rabbit polyclonal antibody showed the SWP7 location in spores; Merge: Overlay chart. Scale=5.0 μm.

3 討論

近年來，微孢子蟲的孢壁研究成為國內(nèi)外學(xué)者的熱點，但是，由于微孢子蟲個體微小，且孢壁結(jié)構(gòu)獨特，成分復(fù)雜，無形中加大了科研難度。目前已有的孢壁蛋白研究結(jié)果相對有限，為了深入研究并了解微孢子蟲孢壁形成機(jī)制，有必要進(jìn)一步探索微孢子蟲孢壁中的其他蛋白成分，尤其是那些具有特殊結(jié)構(gòu)的孢壁蛋白。本研究采用生物信息學(xué)方法對SWP7進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該蛋白在N末端具有一段信號肽序列，但沒有跨膜域和GPI錨定位點，推測該蛋白是一個分泌型蛋白。分泌蛋白合成于胞內(nèi)，需分泌到胞外發(fā)揮作用，已有關(guān)于微孢子蟲的研究表明，一些分泌蛋白是介導(dǎo)蟲體入侵宿主細(xì)胞的重要因子[17-18]，也可能發(fā)揮毒力作用，影響宿主免疫功能。在家蠶微孢子蟲(Nosemabombycis)中，部分孢壁蛋白被證明為分泌蛋白，在粘附和侵染過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[17,19]。SWP7未預(yù)測到潛在的糖基化位點，但有多個磷酸化位點。蛋白質(zhì)翻譯后會利用糖基化和磷酸化等修飾方式，促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊的正確性及其構(gòu)象的穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)的活力和多種生理功能，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答、受體激活等[20]。

本研究制備了SWP7的兔多克隆抗體，這為后續(xù)研究該蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。為了研究該蛋白在EHP中的表達(dá)情況，利用間接免疫熒光技術(shù)對其進(jìn)行了定位。間接免疫熒光結(jié)果如圖10所示，實驗組中在被DAPI標(biāo)記的成熟孢子周圍有環(huán)狀的綠色信號存在，而明場下呈空泡狀的孢子未被DAPI染色，表明該孢子已經(jīng)發(fā)芽，但在該孢子的外殼上仍可見環(huán)狀的綠色熒光，進(jìn)一步說明了SWP7確為EHP的孢壁蛋白，且孢子成熟時SWP7已被分泌到孢壁上。另外值得注意的是，已萌發(fā)的成熟EHP外殼上仍可獲得較強(qiáng)的SWP7熒光信號，推測SWP7可能參與到了萌發(fā)過程中。孢壁是微孢子蟲溝通外界環(huán)境的橋梁，可能參與了侵染時的粘附、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。Pattana等[21]鑒定了EHP的第一個孢壁蛋白(SWP1)，在孢子內(nèi)壁和外壁均有表達(dá)，其能夠利用N端的3個肝素結(jié)合基序(HBMs)，在感染過程中主動連接宿主細(xì)胞表面的肝素。家蠶微孢子蟲中，SWP9作為一種支架蛋白，比SWP7更早地定位于孢子母細(xì)胞的孢壁。隨后，SWP7分泌到孢壁并與SWP9相互作用，在黏附和感染中共同發(fā)揮作用[22]。兔腦炎微孢子蟲有一個孢壁蛋白4(SWP4)，定位于孢子內(nèi)壁，其半胱氨酸含量較高，能夠利用本身HBMs與宿主細(xì)胞膜表面的粘多糖GAG識別作用，參與并推動孢子與宿主細(xì)胞的粘附入侵過程[13,23]。成熟孢子的外壁含有大量的孢壁蛋白(SWPs)，被認(rèn)為是與環(huán)境和宿主細(xì)胞相互作用的第一層，也是最直接的一層[24]。同時，外壁中包含的SWPs是重要的功能蛋白，可能參與信號傳遞、粘附或酶促相互作用等重要過程[10,24]。

本研究中利用生物信息學(xué)方法對SWP7進(jìn)行分析，結(jié)果顯示SWP7為一種分泌蛋白，間接免疫熒光結(jié)果顯示該蛋白定位于EHP孢壁，我們推測SWP7可能參與到蟲體的萌發(fā)過程，研究結(jié)果對于明確EHP孢壁結(jié)構(gòu)組成和進(jìn)一步研究EHP的入侵機(jī)理具有重要意義。