張豪， 李哲， 鄭澤慧， 王慶玲

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生物研究所， 濟(jì)南 250014)

木霉(Trichodermaspp.)屬于半知菌類(lèi)的絲孢綱、絲孢目、叢梗孢科、木霉屬，廣泛分布于自然界中，是土壤微生物群落的重要組成部分[1-3]。木霉是重要的微生物蛋白酶來(lái)源，許多研究證明木霉具有復(fù)雜的胞外蛋白水解酶類(lèi)系統(tǒng)，并且培養(yǎng)條件的不同可影響胞外蛋白酶的種類(lèi)及組成[4]。木霉胞外蛋白酶多為絲氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶，可以降解酪蛋白、牛血清白蛋白、溶菌酶、膠原蛋白、線(xiàn)蟲(chóng)體壁等多種蛋白類(lèi)底物，且沒(méi)有專(zhuān)一的底物酶切位點(diǎn)[4]。堿性蛋白酶(alkaline protease)屬于絲氨酸胞外高堿性蛋白酶，它能水解蛋白質(zhì)分子，具有較強(qiáng)的分解蛋白質(zhì)的能力，可用于工農(nóng)業(yè)廢棄物的降解利用，也在木霉與其他病原菌的相互作用中起著重要作用[4]。同時(shí)，木霉蛋白酶所具有的良好生化特性也使其在工業(yè)領(lǐng)域得到青睞，其堿性蛋白酶在食品加工、洗滌等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。

微生物酶的產(chǎn)生受包括pH、碳源、溫度等參數(shù)的影響。其中pH是改變代謝途徑、影響工業(yè)酶生產(chǎn)和酶合成效率的主要因素[5]。研究表明，pH<5時(shí)，里氏木霉(Trichodermareesei)能夠分泌酸性天冬氨酸蛋白酶；當(dāng)pH控制在6.0及以上時(shí)，里氏木霉(Trichodermareesei)則能夠分泌一種類(lèi)似胰蛋白酶的堿性絲氨酸蛋白酶。自然界中，真菌所處環(huán)境的pH一直處于不斷變化之中，這種改變對(duì)真菌的生長(zhǎng)、發(fā)育、次生代謝等生理活動(dòng)具有非常重要的影響[6]。為了生存和繁衍，真菌進(jìn)化出一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)響應(yīng)外界pH的變化，這一過(guò)程使得微生物能夠適應(yīng)外界酸堿環(huán)境的變化，保證真菌的正常生長(zhǎng)[7]。

前人在許多真菌中發(fā)現(xiàn)存在一條比較保守的pH響應(yīng)信號(hào)途徑，即Pal途徑，包括PacC基因和Pal基因，其中PacC是該途徑中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[8]。Pal途徑由堿性pH信號(hào)激活，經(jīng)過(guò)一系列傳遞，最終作用于PacC/Riml01轉(zhuǎn)錄因子。PacC是Pal途徑中至關(guān)重要的組成部分，也是真菌適應(yīng)酸堿環(huán)境的一個(gè)中樞性調(diào)控因子，其表達(dá)受酸性條件的抑制，而受鹽堿條件的誘導(dǎo)[8]。PacC編碼了一個(gè)與pH相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，在堿性條件下，PacC調(diào)節(jié)了堿性基因的轉(zhuǎn)錄，并在Pal基因產(chǎn)物介導(dǎo)的信號(hào)存在下抑制酸性表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄[9]。在黑曲霉(Aspergillusniger)[9]、棕曲霉(Aspergillusochraceus)[10]、金毛青霉(Penicilliumchrysogenum)[11]、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)[12]等菌株中已鑒定出PacC基因。

研究發(fā)現(xiàn)，PacC基因?qū)φ婢m應(yīng)高pH環(huán)境具有重要作用，真菌中許多有關(guān)鹽脅迫和金屬毒性響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)也受到PacC轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。在不同真菌中，PacC/Rim101能夠調(diào)節(jié)多種胞外分泌酶的產(chǎn)生，如蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶等。玉米黑粉菌(U.maydis)rim101敲除菌株所分泌的蛋白酶明顯比野生型和回補(bǔ)菌株減少[8]；在綠僵菌(M.robertsii)中MrPacC基因缺失對(duì)蛋白酶產(chǎn)生沒(méi)有影響，但是會(huì)導(dǎo)致幾丁質(zhì)酶活力和編碼基因表達(dá)量下降[8]；盾殼菌(C.minitans)CmPacC缺失菌株的幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶的活力都明顯降低[8]；在稻瘟病(M.oryzae)中MoPacC基因缺失導(dǎo)致多種分泌型糖類(lèi)降解酶的酶活力明顯下降，包括多聚半乳糖醛酸酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-1,3-葡聚糖酶等[8]。

在不同木霉菌株中，PacC基因也對(duì)木霉的生長(zhǎng)、水解酶的產(chǎn)生和基因表達(dá)起著重要的調(diào)節(jié)作用。在哈茨木霉(Trichodermaharzianum)中，ThPacC表達(dá)量隨pH升高而增加，可調(diào)節(jié)幾丁質(zhì)酶、蛋白酶、葡萄糖滲透酶、細(xì)胞壁蛋白的表達(dá)[12]；在里氏木霉(Trichodermareesei)中，隨著pH的提高，TrPacC的表達(dá)量增加，并促進(jìn)堿性基因表達(dá)，同時(shí)抑制酸性基因表達(dá)[13]。綠色木霉是各種蛋白酶的有效生產(chǎn)者，是現(xiàn)代工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)線(xiàn)上不可缺少的“生物機(jī)器”。研究發(fā)現(xiàn)，酸堿環(huán)境的變化對(duì)其蛋白酶分泌也有著重要影響，解析綠色木霉蛋白酶的合成途徑與基因表達(dá)調(diào)控方式，挖掘綠色木霉產(chǎn)蛋白酶的調(diào)控系統(tǒng)及代謝網(wǎng)絡(luò)極其重要。

為此，針對(duì)綠色木霉pH響應(yīng)因子編碼基因TvPacC進(jìn)行功能鑒定，并通過(guò)構(gòu)建TvPacC基因敲除工程菌株來(lái)開(kāi)展其在綠色木霉堿性環(huán)境適應(yīng)能力和產(chǎn)堿性蛋白酶能力等方面的應(yīng)用研究，旨在為解析木霉響應(yīng)堿性環(huán)境的分子機(jī)制及推進(jìn)木霉在產(chǎn)堿性蛋白酶中的應(yīng)用提供一定的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

綠色木霉(Trichodermaviride)Tv-1511為本實(shí)驗(yàn)室篩選鑒定的一株具有良好生物質(zhì)降解能力的木霉菌株，其在中國(guó)普通微生物菌種保藏中心的保藏號(hào)為CGMCC No.16800。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖水(PDB)培養(yǎng)基等購(gòu)自青島海博公司。

基本培養(yǎng)基(minimal medium， MM)：1 L ddH2O, + 15 g KH2PO4, + 5 g (NH4)2SO4, + 0.6 g MgSO4(或1.23 g MgSO4.7H2O), + 0.6 g CaCl2(或0.8 g CaCl2·2H2O) + 0.005 g FeSO4·7H2O + 0.001 6 g MnSO4·H2O + 0.001 4 g ZnSO4·7H2O + 0.003 7 g CoCl2·6H2O(或0.002 g CoCl2) + 20 g葡萄糖。

1.1.3 試劑

大腸桿菌DH5α、T4連接酶試劑盒、高保真Taq酶等購(gòu)自南京諾唯贊公司；氨芐、潮霉素B和溶菌酶購(gòu)自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 不同pH條件下綠色木霉菌株pH響應(yīng)因子TvPacC轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平及產(chǎn)蛋白酶水平的測(cè)定

將200 μL木霉出發(fā)菌株Tv-1511的孢子分別接種于MM液體培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min培養(yǎng) 48 h，通過(guò)2層無(wú)菌紗布過(guò)濾獲得無(wú)菌的菌絲體。將等量的菌絲體分別接種于不同pH(pH=5、7、9)的含有2%脫脂奶粉的MM 液體無(wú)氮源培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min培養(yǎng)72 h，分別收集菌絲體和發(fā)酵液。

菌絲體液氮研磨，利用Trizol法提取總RNA并制備cDNA，利用引物(TvPacC-qPCR-F: GATACTC-TGGCGGAATGC；TvPacC-qPCR-R: ATCCTTGCGAA-TGCGATT)，采用熒光定量PCR的方法檢測(cè)TvPacC的轉(zhuǎn)錄表達(dá)?；厥盏囊后w發(fā)酵液經(jīng) 10 000 r/min 離心后取上清，制備粗酶提取液，利用福林酚法測(cè)定蛋白酶活性。

在PDA平板上活化木霉菌株，28 ℃避光培養(yǎng)48～72 h，使得木霉長(zhǎng)勢(shì)均一，再使用打孔器制備大小均一的菌塊并分別接種于不同pH(pH=5、7、9)的含有2%脫脂奶粉的MM固體無(wú)氮源培養(yǎng)基(MM液體無(wú)氮源培養(yǎng)基+ 2% 瓊脂)中，28 ℃靜置培養(yǎng)48 h，觀察菌落直徑和水解圈。

1.2.2 綠色木霉TvPacC基因缺失工程菌的構(gòu)建

(1)敲除片段的構(gòu)建。以綠色木霉Tv-1511基因組DNA為模板，擴(kuò)增TvPacC基因的上游片段和下游片段。敲除片段擴(kuò)增引物分別為：上游片段擴(kuò)增引物TvPacC-UP-F：GATTCGGGCGTCTCGAGATA和TvPacC-up-R： GAGAGCTACCTTACATCAATATGGCAAGAGGCGCTTTGGCGCA；下游片段擴(kuò)增引物TvPacC-DOWN-F：GGTACTATGGCTTAGATGGAATACCCGCACTGAGACGTTCATGGCATTT和TvPacC-down-R：TCACTGCATGGCGTCTCCTT。以線(xiàn)性化的pBARGPE1-Hygro質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增潮霉素抗性基因(HygR)，擴(kuò)增引物為：HygR-F: GAGAGCTACCTTACATCAATATGGC和HygR-R: GGTACTATGGCTTAGATGGAATACCC。

(2)原生質(zhì)體制備。接種綠色木霉Tv-1511于PDA平板，28 ℃培養(yǎng)10 d后，產(chǎn)生大量新鮮分生孢子；用10 mL生理鹽水(0.9% NaCl，0.05% Tween-20)洗滌菌絲表面，經(jīng)玻璃絨紙過(guò)濾，去除菌絲體得到孢子懸液；在玻璃紙覆蓋的PDA平板上，取 200 μL 孢子懸液涂布，28 ℃避光培養(yǎng)24 h，使PDA平板上的孢子萌發(fā)；配制溶解酶溶液：取0.15 g 溶解酶(Lysing enzyme，Sigma：L1412)溶于20 mL溶液I(1.2 mol/L D-sorbitol, 0.1 mol/L KH2PO4, pH 5.6)，0.2 μmol/L濾膜過(guò)濾除菌；取出PDA平板，將長(zhǎng)有菌絲的纖維膜取出并反向貼在含有3～4 mL 裂解液的平板上，于28 ℃、100 r/min條件下處理 100 min。在無(wú)菌超凈臺(tái)下將平板中的纖維膜取出，確保大部分菌絲體保留在平板中，在此過(guò)程中可以用溶液A沖洗顯微膜上殘留的菌絲塊，利用槍頭反復(fù)吹吸液體中的菌絲塊200次以上，充分釋放內(nèi)部的原生質(zhì)體；用裝有4層紗布的1.5 mL 管過(guò)濾上述混合液，保留下層濾液并進(jìn)行4 ℃離心，2 000 r/min離心10 min，棄上清，保留底部的原生質(zhì)體，加1 mL溶液A，再次離心，棄上清；加1 mL 4 ℃預(yù)冷的溶液II (1 mol/L sorbitol, 50 mmol/L CaCl2, 10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5)，冰上得到原生質(zhì)體；用血球計(jì)數(shù)板觀察計(jì)數(shù)，稀釋原生質(zhì)體至107個(gè)/mL。

(3)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及突變子篩選。冰上放置 15 mL 離心管，分別加入200 μL原生質(zhì)懸浮液、10 μL 純化的PCR產(chǎn)物、50 μL PEG溶液(25% PEG600, 50 mmol/L CaCl2, 10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5)；用槍頭混勻，冰上放置20 min；加 2 mL PEG溶液，輕輕混勻，常溫下放置5 min；加2 mL 溶液II，輕輕混勻；加2 mL混合液涂布在覆蓋層析紙的含1 mol/L蔗糖PDA平板上，層析紙預(yù)先剪成條形；28 ℃避光培養(yǎng) 24 h；將條形層析紙轉(zhuǎn)導(dǎo)含抗生素的PDA平板上，28 ℃避光培養(yǎng)36 h，待條形層析紙邊緣長(zhǎng)出菌落后，挑取菌落，轉(zhuǎn)接至新鮮的抗生素平板上，培養(yǎng)2 d。

利用獲得的TvPacC缺失工程菌株，采用熒光定量PCR的方法檢測(cè)TvPacC的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，擴(kuò)增引物為：TvPacC-qPCR-F: GATACTCTGGCGGAATGC和TvPacC-qPCR-R: ATCCTTGCGAATGCGATT；利用蛋白質(zhì)免疫印跡(WB)的方法，檢測(cè)TvPacC的蛋白表達(dá)。

1.2.3 綠色木霉工程菌株Tv-1511-△TvPacC適應(yīng)堿性脅迫環(huán)境能力的測(cè)定

(1)無(wú)菌孢子的收集。接種綠色木霉出發(fā)菌株及Tv-1511-△TvPacC工程菌(△表示染色體缺失)于PDA平板，28 ℃培養(yǎng)10 d后，產(chǎn)生大量新鮮分生孢子；用10 mL生理鹽水(0.9% NaCl，0.05% Tween)洗滌菌絲表面，經(jīng)玻璃絨紙過(guò)濾，去除菌絲體得到孢子懸液；用30%的甘油懸浮，充分混勻，分裝到1.5 mL離心管中，標(biāo)記好名稱(chēng)和時(shí)間，-80 ℃凍存；取1管孢子液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，確定孢子液的濃度。

(2)平板耐堿實(shí)驗(yàn)。先在PDA平板上活化木霉出發(fā)菌株(Wildtype)和Tv-1511-△TvPacC工程菌，28 ℃避光培養(yǎng)48～72 h，使得原始菌株和突變工程菌木霉長(zhǎng)勢(shì)均一，再使用打孔器制備大小均一的菌塊并轉(zhuǎn)移到pH 9的PDA平板。將接有菌塊的平板置于28 ℃培養(yǎng)72 h后，測(cè)量菌落生長(zhǎng)直徑。

(3)液體搖瓶耐堿實(shí)驗(yàn)。將200 μL木霉出發(fā)菌株(Wildtype)和Tv-1511-△TvPacC工程菌的孢子分別接種于PDB液體培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min培養(yǎng)48 h，通過(guò)2層無(wú)菌紗布過(guò)濾獲得無(wú)菌的菌絲體。將等量的菌絲體分別接種于pH 9的PDB液體培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min培養(yǎng)72 h，收集菌絲體，測(cè)定菌體生物量。

1.2.4 綠色木霉工程菌株Tv-1511-△TvPacC產(chǎn)堿性蛋白酶能力的測(cè)定

(1)平板水解圈實(shí)驗(yàn)。在MM固體平板上活化木霉出發(fā)菌株(Wildtype)和Tv-1511-△TvPacC工程菌，28 ℃避光培養(yǎng)48～72 h，使得原始菌株和突變工程菌木霉長(zhǎng)勢(shì)均一，再使用打孔器制備大小均一的菌塊并轉(zhuǎn)移到pH 9的含有2%脫脂奶粉的MM 液固體無(wú)氮源培養(yǎng)基平板中。將接有菌塊的平板置于28 ℃培養(yǎng)72 h后，觀察蛋白酶水解圈。

(2)液體發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶酶實(shí)驗(yàn)。將200 μL木霉出發(fā)菌株(Wildtype)和Tv-1511-△TvPacC工程菌株的孢子分別接種于MM液體培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min 培養(yǎng)48 h，通過(guò)2層無(wú)菌紗布過(guò)濾獲得工程菌和原始菌株的菌絲體。將等量的菌絲體分別接種于pH 9的含有2%脫脂奶粉的MM 液體無(wú)氮源培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min培養(yǎng)，進(jìn)行蛋白酶的誘導(dǎo)，72 h后通過(guò)2層無(wú)菌紗布過(guò)濾菌絲體，回收液體發(fā)酵液。回收的液體發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min離心后取上清，制備粗酶提取液，利用福林酚法測(cè)定蛋白酶活性。

2 結(jié)果

2.1 不同pH條件下TvPacC基因轉(zhuǎn)錄水平及綠色木霉產(chǎn)蛋白酶水平的變化

從綠色木霉(Trichodermaviride)Tv-1511基因組中鑒定出了編碼pH響應(yīng)信號(hào)Pal途徑中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子PacC 的編碼基因TvPacC。通過(guò)前期對(duì) Tv-1511 開(kāi)展的全基因組測(cè)序和精細(xì)基因組圖譜繪制工作(GenBank Accession No.VCEC00000000；BioProject: PRJNA543939；BioSample: SAMN11791795)，得到了TvPacC基因及其編碼蛋白的詳細(xì)信息。TvPacC(NCBI accession number MZ417538)基因的序列已提交到NCBI GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)。TvPacC的氨基酸序列包含有3個(gè)Cys2His2鋅指結(jié)構(gòu)，能特異結(jié)合靶標(biāo)基因啟動(dòng)子區(qū)域的 5′-GCCARG序列(圖1)。

TvPacC基因的表達(dá)受酸性條件的抑制，受堿性條件的誘導(dǎo)，在堿性環(huán)境下，表達(dá)水平會(huì)提高。在不同pH條件下，經(jīng)過(guò)熒光定量PCR的檢測(cè)，結(jié)果顯示：TvPacC基因在酸性條件(pH 5)下表達(dá)量低，而在堿性條件(pH 9)下TvPacC基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)顯著提高(圖2)。

圖1 TvPacC蛋白-氨基酸序列結(jié)構(gòu)域示意圖Fig.1 Schematic diagram of amino acid sequence and domain of TvPacC

木霉產(chǎn)蛋白酶活性的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在堿性條件(pH 9)下，綠色木霉Tv-1511分泌的蛋白酶水解圈不明顯[圖3(a)]，其產(chǎn)堿性蛋白酶的活性極低[圖3(b)]。表明在堿性條件下，綠色木霉Tv-1511出發(fā)菌株中堿性蛋白酶的合成受到抑制。

圖2 不同pH條件下TvPacC基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平Fig.2 Transcriptional expression levels of TvPacC gene in Trichoderma viride Tv-1511 strain under different pH

圖3 不同pH條件下綠色木霉蛋白酶水解圈及活性水平Fig.3 Protease hydrolysis circle and activity in Trichoderma viride Tv-1511 strain under different pH

2.2 綠色木霉TvPacC基因缺失的工程菌(Tv-1511-△TvPacC)的構(gòu)建

如圖4所示，利用融合PCR構(gòu)建了TvPacC基因敲除片段，通過(guò)聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法成功獲得了8株敲除TvPacC基因的綠色木霉Tv-1511工程菌。

隨后，利用熒光定量PCR檢測(cè)工程菌中TvPacC的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，并利用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)程菌中TvPacC的蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，在堿性條件(pH 9)下，TvPacC缺失工程菌株中檢測(cè)不到TvPacC 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[圖5(a)]和蛋白表達(dá)[圖5(b)]。

圖4 TvPacC基因敲除片段的構(gòu)建流程及驗(yàn)證Fig.4 Construction and verification of knockout fragment of TvPacC gene

2.3 敲除TvPacC基因提高了綠色木霉的堿性環(huán)境適應(yīng)能力

面對(duì)外界環(huán)境不斷變化的pH條件，真菌所具有的PacC信號(hào)通路可以幫助真菌積極響應(yīng)外界環(huán)境的變化，以保證真菌的生長(zhǎng)和生產(chǎn)。開(kāi)展綠色木霉工程菌株Tv-1511-△TvPacC的平板耐堿實(shí)驗(yàn)和液體搖瓶耐堿實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：在平板耐堿實(shí)驗(yàn)中，Tv-1511-△TvPacC工程菌更能適應(yīng)高堿性環(huán)境(pH 9)，其菌落直徑相比野生型菌株(Wildtype)顯著增加[圖6(a)]。在液體搖瓶耐堿實(shí)驗(yàn)中，在pH 9的堿性環(huán)境下，Tv-1511-△TvPacC工程菌的生物量比野生型菌株(Wildtype)顯著提高了[圖6(b)]。

圖5 熒光定量PCR和Western blot鑒定 TvPacC基因缺失的木霉工程菌Fig.5 Identification of Trichoderma engineering strains deleting TvPacC gene by fluorescence quantitative PCR and Western blot

2.4 敲除TvPacC基因提高了綠色木霉產(chǎn)堿性蛋白酶的能力

PacC介導(dǎo)的信號(hào)通路能夠?qū)虮磉_(dá)和酶分泌產(chǎn)生影響，有研究發(fā)現(xiàn)PacC基因可調(diào)節(jié)幾丁質(zhì)酶、蛋白酶、葡萄糖滲透酶、細(xì)胞壁蛋白等的表達(dá)。利用工程菌株Tv-1511-△TvPacC，進(jìn)行了堿性環(huán)境下(pH 9)的蛋白酶水解圈實(shí)驗(yàn)和蛋白酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：相比野生型菌株，敲出了TvPacC基因的綠色木霉工程菌株具有更強(qiáng)的分泌堿性蛋白酶的能力，其在pH 9的脫脂奶粉平板上的水解圈更加明顯[圖7(a)]，其發(fā)酵液中堿性蛋白酶的活力顯著提高[圖7(b)]。

圖6 木霉工程菌耐堿能力的分析Fig.6 Analysis of alkaline tolerance of Trichoderma engineered strains

3 討論

真菌在不斷變化的環(huán)境中生存時(shí)，外界pH是一個(gè)重要的生長(zhǎng)調(diào)控因素。在檢測(cè)到外界pH發(fā)生變化時(shí)，都能通過(guò)一些細(xì)胞反應(yīng)來(lái)平衡體內(nèi)的環(huán)境，來(lái)適應(yīng)在酸性或者堿性環(huán)境下的生存。在真菌中，Pal途徑就是前人研究發(fā)現(xiàn)的一條響應(yīng)外界環(huán)境pH變化的重要信號(hào)途徑，而PacC是這條途徑中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，真菌通過(guò)激活PacC來(lái)響應(yīng)環(huán)境pH水平[14-18]。當(dāng)真菌檢測(cè)到外界環(huán)境pH值變化時(shí)，這種環(huán)境信息就會(huì)被細(xì)胞表面的蛋白傳感器PalH感受到[19]，PalH會(huì)影響一種與其相互作用的蛋白PalF，使PalF在堿性pH[20]的作用下泛素化，然后進(jìn)一步影響Pal途徑中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子PacC，并最終引起住轉(zhuǎn)錄調(diào)控[16,21-24]及一些酶的分泌。

圖7 堿性條件(pH 9)下木霉工程菌產(chǎn)堿性 蛋白酶能力分析Fig.7 Analysis of alkaline protease activity in Trichoderma engineered strains under alkaline condition (pH 9)

Pal途徑最先在黑曲霉(Aspergillusnidulans)中被鑒定，并被廣泛研究[25]。目前對(duì)pH信號(hào)通路研究較為清晰的是構(gòu)巢曲霉，其信號(hào)通路7個(gè)Pal基因，分別為pacC、palA、palB、palC、palF、palH和palI[26]。Pealva[5]等在絲狀真菌中，也鑒定出了這條通路的7個(gè)成員PacC、PalA、PalB、PalC、PalF、PalH和PalI。另外，在構(gòu)巢曲霉中還發(fā)現(xiàn)PacC分為PacC72，PacC53和 PacC27，其中PacC72位于細(xì)胞質(zhì)中參與感知外界環(huán)境pH的變化，PacC27位于細(xì)胞核中，在中性或者堿性環(huán)境，參與調(diào)控酸堿性相關(guān)的基因的表達(dá)[27]。

Moreno-Mateoset等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在哈茨木霉中幾丁質(zhì)酶、蛋白酶、葡萄糖滲透酶和細(xì)胞壁蛋白等幾種物質(zhì)的產(chǎn)生，受PacC基因的調(diào)控。在構(gòu)巢曲菌(A.nidulans)中，幾個(gè)編碼纖維素分解酶的基因受Pal-PacC介導(dǎo)的pH信號(hào)調(diào)節(jié)[29]，PacC可調(diào)控細(xì)胞外酶編碼基因xlnA和xlnB的表達(dá)[30]。野曲霉(Spergillusnidulans)在中性條件下具有酸性和堿性磷酸酶活性，而PacC突變體在保持堿性磷酸酶活性的同時(shí)卻失去了酸性磷酸酶活性[31]。這表明PacC能促進(jìn)酸性磷酸酶的產(chǎn)生，抑制堿性磷酸酶的產(chǎn)生[32]。鑒定到一種綠色木霉(Trichodermaviride)pH響應(yīng)因子編碼基因TvPacC及相應(yīng)的蛋白，并構(gòu)建了綠色木霉TvPacC基因敲除菌株 Tv-1511-△TvPacC，與野生型綠色木霉菌株相比，該工程菌具有更好的堿性環(huán)境耐受能力，以及更強(qiáng)的產(chǎn)堿性蛋白酶能力。

4 結(jié)論

(1)以綠色木霉Tv-1511基因組DNA為模板，擴(kuò)增TvPacC基因的上游片段和下游片段，利用敲除片段同源重組法構(gòu)建了木霉工程菌株Tv-1511-△TvPacC。利用木霉工程菌株進(jìn)行了TvPacC基因在綠色木霉堿性環(huán)境的適應(yīng)能力和產(chǎn)堿性蛋白酶能力等方面的應(yīng)用研究。與原始菌株相比，敲除TvPacC基因后，綠色木霉的堿性環(huán)境適應(yīng)能力和產(chǎn)堿性蛋白酶的能力都得到了顯著提高，表明TvPacC基因在綠色木霉應(yīng)對(duì)環(huán)境pH變化和生物合成等方面起著重要作用。

(2)木霉是重要的微生物蛋白酶來(lái)源，木霉蛋白酶所具有的良好生化特性也使其在工業(yè)領(lǐng)域得到青睞，其堿性蛋白酶在食品加工、洗滌等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。pH是改變代謝途徑、影響工業(yè)酶生產(chǎn)和酶合成效率的主要因素。對(duì)TvPacC基因的鑒定和功能解析，為木霉響應(yīng)堿性環(huán)境的機(jī)制解析及推進(jìn)木霉菌株在產(chǎn)堿性蛋白酶中應(yīng)用提供了理論支持和實(shí)踐基礎(chǔ)。