楊 松，孟 靈，鐘青華，蔣學(xué)余

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410000；2.岳陽市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 岳陽 414000)

神經(jīng)根型頸椎病(CSR)是由脊神經(jīng)根受壓或刺激引起的常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]。它的臨床特征通常是頸部、手臂疼痛和麻木，常伴有頸部運動受限[2]。CSR所致神經(jīng)根性疼痛屬于神經(jīng)病理性疼痛范疇[3]。據(jù)報道，CSR的發(fā)病率正在逐年上升，且發(fā)病趨年輕化，嚴重影響著患者的身體健康與生活質(zhì)量[4]。治療上包括手術(shù)治療和非手術(shù)治療。由于手術(shù)治療的不良并發(fā)癥和術(shù)后復(fù)發(fā)是不可預(yù)測的，故非手術(shù)治療是大多數(shù)患者的首選[5]。針灸療法作為非手術(shù)治療的主要干預(yù)手段，其臨床療效不亞于手術(shù)治療，但其作用機制復(fù)雜[6]。故本實驗通過觀察電針頸夾脊穴對CSR所致神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠脊髓背角GFAP、NF-κB及炎性細胞因子表達的影響，探討電針頸夾脊穴治療CSR所致神經(jīng)病理性疼痛的可能鎮(zhèn)痛機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級成年健康雄性SD大鼠60只[上海斯萊克實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SYXK(滬)2017-0002]，體質(zhì)量(270±20)g。飼養(yǎng)環(huán)境的溫度(25±0.5)℃，濕度(60±2.5)%。實驗動物飼喂相同的飼料，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，將60只大鼠隨機分為空白組、假手術(shù)組、模型組、電針組和LAA組，每組12只。本實驗已通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗福利倫理會審查批準(批準號：SLBH-201910140006)。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 試劑 水合氯醛、多聚甲醛(國藥試劑)；青霉素(杭州吉諾)；NF-κB抗體、GFAP抗體(Abcam)；lexa Fluor 488標記山羊抗小鼠IgG和Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG、Alexa Fluor 555標記驢抗小鼠IgG、Alexa Fluor 555標記驢抗兔IgG(上海碧云天)；Trizol Reagent(INVITROGEN)；PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(Takara)。

1.2.2 儀器 熒光定量PCR儀96lightcycler(Roche)；一次性無菌針灸針(0.35 mm×25 mm)、華佗牌SDZ-Ⅱ型電子治療儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)；超低溫冰箱(Sanyo)；冰凍切片機、激光共聚焦顯微鏡(Leica)；高速低溫離心機(Eppendorf)。

1.3 模型制備與鞘內(nèi)置管

除空白組外，其余大鼠均腹腔注射10%水合氯醛溶液(0.35 mL/100 g)進行麻醉，然后置于俯臥位進行固定，以T2棘突為標記，沿著大鼠后正中線做正中切口，鈍性分離頸后組織至C6～7暴露，咬除左側(cè)C6～7關(guān)節(jié)突與C6橫突部分，顯露出左側(cè)C6～7脊神經(jīng)，用4-0線結(jié)扎C7背根神經(jīng)節(jié)遠端神經(jīng)根，在倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)表面動脈受壓情況，結(jié)扎松緊度以有血流通過為宜。假手術(shù)組只暴露神經(jīng)根而不結(jié)扎，余同模型組。然后進行鞘內(nèi)置管操作。咬除頸椎棘突，打開椎板，撕開硬腦膜。經(jīng)小腦延髓池將PE-10管插入蛛網(wǎng)膜下腔，直至腰膨大，緩慢注入10 mL生理鹽水，防止血凝塊堵塞開口。然后將管外口封閉，將暴露于皮外的PE-10管固定在頸部，關(guān)閉術(shù)口，縫合。連續(xù)3 d腹腔注射青霉素20萬U，防止術(shù)后切口感染。術(shù)后第5天參照文獻[7]所述方法對大鼠進行步態(tài)評分，步態(tài)評分2～3分并出現(xiàn)自噬、舔咬和嘶叫等行為者即為造模成功。

1.4 干預(yù)方式

1.4.1 空白組 正常飼養(yǎng)，不做其他任何干預(yù)。

1.4.2 假手術(shù)組 術(shù)后第7天開始,同電針組進行捆綁干預(yù)，20 min/次，1次/d，連續(xù)干預(yù)14 d。

1.4.3 模型組 術(shù)后第7天開始。同電針組進行捆綁干預(yù)，20 min/次，1次/d，連續(xù)干預(yù)14 d。

1.4.4 電針組 術(shù)后第7天開始電針干預(yù)。將大鼠俯臥位捆綁于鼠板上，參考大鼠穴位圖譜[8]，取雙側(cè)C6～7頸夾脊穴，直刺進針，深度：0.3～0.6 cm，輕度捻轉(zhuǎn)提插后，以單側(cè)C6～7為1組，兩側(cè)均通過針柄連接電子針療儀，疏密波，20 min/次，1次/d，連續(xù)干預(yù)14 d。

1.4.5 LAA組 術(shù)后第7天開始同電針組進行捆綁，鞘內(nèi)注射星形膠質(zhì)細胞抑制劑L-α-氨基己二酸(LAA)干預(yù)，5 nmoL/次，1次/d，連續(xù)干預(yù)14 d。

1.5 免疫熒光法觀察脊髓背角NF-κB、GFAP表達

干預(yù)完成1 d后，每組取6只大鼠腹腔注射過量10%水合氯醛處死。參照杜俊英等[9]的脊髓提取方法，快速提取出脊髓C6～7節(jié)段，取左側(cè)脊髓背角，轉(zhuǎn)移至4%多聚甲醛4 ℃固定6 h，再轉(zhuǎn)移至20%和30%蔗糖溶液中進行梯度脫水。在液氮中速凍，儲存在-80 ℃冰箱中。冰凍切片機切片。用組化筆在玻片上圈起組織， PBS浸潤，多聚甲醛固定，PBS漂洗，0.5 %Txiton X-100處理，TBST漂洗，封閉，加入NF-κB一抗或GFAP一抗(用0.1 BSA/TBST配)，4 ℃孵育過夜；0.1 %BSA/TBST漂洗；加入相應(yīng)的熒光素標記的第二抗體(用含0.1 %BSA的TBST配)，室溫孵育2 h，0.1 %BSA/TBST漂洗，DAPI細胞核染色，PBS漂洗，封片。所制切片于激光共聚焦顯微鏡400倍下觀察并拍照取樣。采用Image J軟件對攝片進行分析測量熒光強度。

1.6 Real-time PCR法觀察脊髓背角炎性細胞因子IL-1β、IL-6、IL-18及TNF-α mRNA表達

干預(yù)完成1 d后，每組取6只大鼠腹腔注射過量10%水合氯醛處死。快速提取出脊髓C6～7節(jié)段，取左側(cè)脊髓背角用于總RNA的提取，按PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作程序進行cDNA合成，在冰上PCR管中制備PCR反應(yīng)混合液，混勻后置于熒光定量PCR儀上進行PCR擴增，每個樣品做3個重復(fù)對照。通過2-ΔΔCt法進行相對表達量計算。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

本實驗所得數(shù)據(jù)均通過SPSS 25.0軟件進行處理。因各組間數(shù)據(jù)均滿足正態(tài)性且方差齊性，故采用單因素方差分析檢驗比較NF-κB、GFAP以及炎性細胞因子IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α mRNA在空白組、假手術(shù)組、模型組、電針組與LAA組的表達情況，采用LSD檢驗比較各組間NF-κB、GFAP以及炎性細胞因子IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α mRNA表達。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠脊髓背角NF-κB表達比較

假手術(shù)組大鼠脊髓背角有少量NF-κB表達。空白組與假手術(shù)組大鼠脊髓背角NF-κB差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠脊髓背角NF-κB免疫熒光強度明顯增強(P<0.05)。與模型組比較，電針頸夾脊穴和鞘內(nèi)注射LAA均可顯著降低脊髓背角NF-κB的表達(P<0.05)。電針組與LAA組之間脊髓背角NF-κB的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 各組大鼠脊髓背角GFAP 、NF-κB平均熒光強度比較

2.2 各組大鼠脊髓背角GFAP表達比較

GFAP作為星形膠質(zhì)細胞活化的標志，在空白組和假手術(shù)組的大鼠脊髓背角中都有輕微表達。空白組與假手術(shù)組大鼠脊髓背角GFAP差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組脊髓背角GFAP免疫熒光強度顯著增強(P<0.05)。電針組與LAA組脊髓背角GFAP表達均明顯低于模型組(P<0.05)。電針組與LAA組之間脊髓背角GFAP的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖2。

2.3 各組大鼠脊髓背角IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α mRNA表達比較

空白組與假手術(shù)組大鼠脊髓背角IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α mRNA的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。模型組大鼠脊髓背角炎性細胞因子IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α mRNA的表達明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)。與模型組比較，電針頸夾脊穴和鞘內(nèi)注射LAA均能降低大鼠脊髓背角IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α mRNA表達(P<0.05)。電針組與LAA組大鼠脊髓背角IL-1β、IL-6、IL-18 mRNA表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，TNF-α mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖3。

表2 各組大鼠脊髓背角IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α mRNA表達比較

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為CSR是因頸椎關(guān)節(jié)、頸椎間盤或韌帶等急慢性損傷所致的退行性疾病，發(fā)病機理主要與神經(jīng)根受機械壓迫和炎性刺激有關(guān)[10]。神經(jīng)根的炎性損傷是導(dǎo)致該病的主要病理基礎(chǔ)，所致根性疼痛屬神經(jīng)病理性疼痛。CSR屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，主要病機是風(fēng)寒濕三邪留滯經(jīng)絡(luò)，氣血瘀滯不通?！端貑枴づe痛論》云:“經(jīng)脈流行不止、環(huán)周不休，寒氣入經(jīng)而稽遲……客于脈中則氣不通，故卒然而痛”，表明人體氣血之氣循經(jīng)絡(luò)周流全身，循環(huán)不止，寒邪侵襲經(jīng)絡(luò)致脈氣不通，脈中氣血瘀滯不行，可發(fā)疼痛?！夺t(yī)宗必讀·心腹諸痛》云:“治痛……有以通則不痛，痛則不通者”，有氣血通暢、疼痛自解之意。針刺療法可疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)和氣血和扶正祛邪以達“通則不痛”之效[11]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究也表明針刺治療CSR病理性疼痛有一定的鎮(zhèn)痛作用，但其鎮(zhèn)痛機制復(fù)雜[12-13]。研究表明，針刺可調(diào)控炎性細胞因子和炎性信號通路的表達[14]。本實驗通過觀察電針頸夾脊穴對CSR所致神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠脊髓背角GFAP、NF-κB及炎性細胞因子表達的影響，結(jié)果提示電針可抑制星形膠質(zhì)細胞激活，下調(diào)NF-κB、IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α表達，減輕神經(jīng)根壓迫所致炎性反應(yīng)對神經(jīng)根的損傷。

本研究所選頸夾脊穴位于膀胱經(jīng)與督脈之間，督脈為“陽脈之海”，可調(diào)節(jié)十二經(jīng)脈之氣血，膀胱經(jīng)為衛(wèi)氣之始發(fā)，衛(wèi)陽之最盛，可宣發(fā)衛(wèi)氣以抗邪。夾脊穴內(nèi)夾督脈，外循膀胱，溝通督脈和太陽經(jīng)氣，針之可通調(diào)氣血、平衡陰陽。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)而言，夾脊穴深處有脊神經(jīng)分布，脊神經(jīng)前后根分別負責(zé)人體運動性與感覺性，通過刺激夾脊穴可影響脊神經(jīng)前后根的傳導(dǎo)，進而調(diào)節(jié)肢體的運動和感覺功能[15]。夾脊穴可應(yīng)用于治療疼痛相關(guān)疾病。既往研究表明刺激夾脊穴可通過調(diào)控疼痛相關(guān)蛋白基因的表達以達鎮(zhèn)痛作用[16]。本研究所選用電針療法是經(jīng)絡(luò)學(xué)說和神經(jīng)電生理結(jié)合的產(chǎn)物，在針刺頸夾脊得氣后加入電刺激可增強鎮(zhèn)痛療效。夾脊穴搭配電針可使肌肉出現(xiàn)節(jié)律性的放松與收縮，并能興奮并調(diào)節(jié)脊神經(jīng)和交感神經(jīng)功能，改善局部血液循環(huán)，抑制疼痛信號傳遞，進而恢復(fù)機體正常生理狀態(tài)[17]。

研究表明，脊髓背角膠質(zhì)細胞與周圍神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)病理性疼痛聯(lián)系密切[18]。膠質(zhì)細胞受神經(jīng)損傷、感染等刺激后，被激活并分泌大量炎性介質(zhì)，觸發(fā)中樞神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的神經(jīng)細胞免疫應(yīng)答，引起中樞敏化，導(dǎo)致疼痛閾值降低，并促進神經(jīng)病理性疼痛的形成[19]。通過本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)造模處理后，模型大鼠脊髓背角星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP的含量較假手術(shù)組明顯升高，表明造模成功后，星形膠質(zhì)細胞表達較無損狀態(tài)高，其表達強度與周圍神經(jīng)損傷密切相關(guān)。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)電針頸夾脊與鞘內(nèi)注射LAA均可降低脊髓背角GFAP的含量，但降低程度電針頸夾脊較鞘內(nèi)注射LAA為低，表明電針頸夾脊可以降低星形膠質(zhì)細胞的表達，從而改善脊神經(jīng)受損情況。

本研究還發(fā)現(xiàn)造模后大鼠脊髓背角NF-κB的含量明顯升高。NF-κB作為一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，可參與調(diào)節(jié)控制炎癥基因各組相關(guān)基因的表達[20]。在非活性狀態(tài)下，NF-κB受IκB的約束，通常位于細胞質(zhì)中，當NF-κB被各種刺激激活后，可導(dǎo)致IκB磷酸化，NF-κB失去約束并轉(zhuǎn)位至細胞核內(nèi)，從而參與到調(diào)節(jié)控制各種炎性細胞因子的表達，增加炎性細胞因子的產(chǎn)生和釋放，且炎性細胞因子可再次激活NF-κB，進一步形成炎癥級聯(lián)反應(yīng)，推進機體疼痛的發(fā)生[21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)注射LAA可降低脊髓背角NF-κB的表達，表明抑制星形膠質(zhì)細胞的表達可使脊髓背角NF-κB的表達同時降低，兩者之間可能具有一定聯(lián)系。與此同時電針頸夾脊穴亦可降低脊髓背角NF-κB的表達，但其降低NF-κB表達程度較鞘內(nèi)注射LAA低。

既往研究表明，脊髓內(nèi)炎性細胞因子的表達與神經(jīng)病理性疼痛密切相關(guān)，且周圍組織中促炎細胞因子的變化在緩解疼痛方面也起著至關(guān)重要的作用[22-23]。由活化的巨噬細胞產(chǎn)生的IL-1β對外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有疼痛誘導(dǎo)作用，在炎癥反應(yīng)中NF-κB被激活時其活性會上調(diào)[24-25]。IL-1β可誘導(dǎo)多種炎性細胞因子的表達，如IL-6、IL-18和TNF-α等，其表達程度可影響和放大脊髓對有害刺激的感知，最終導(dǎo)致痛覺過敏[26-27]。IL-6和IL-18作為具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的炎性細胞因子，參與了周圍神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)性疼痛的發(fā)生，在各種神經(jīng)病理性疼痛模型中均提示IL-6和IL-18在脊髓或背根神經(jīng)節(jié)中的表達升高，且通過鞘內(nèi)注射IL-6、IL-18可引起類似于神經(jīng)損傷后的疼痛過程，鞘內(nèi)注射抗IL-6中和抗體可減輕這些疼痛相關(guān)行為，且IL-18還可通過調(diào)節(jié)其他炎性細胞因子如TNF-α、IL-6和IL-1β的活性，參與到神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展過程中[28-29]。通過研究發(fā)現(xiàn)，機體內(nèi)神經(jīng)元細胞和膠質(zhì)細胞可通過分泌TNF-α參與神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)節(jié), TNF-α亦被認為可能成為治療神經(jīng)病理性疼痛的一個良好靶標[30]。根據(jù)當前研究現(xiàn)狀，神經(jīng)膠質(zhì)細胞、NF-κB與炎性細胞因子與神經(jīng)病理性疼痛密切相關(guān)，可參與介導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展過程，這也為靶向治療神經(jīng)病理性疼痛提供了可靠的理論依據(jù)。本研究也發(fā)現(xiàn)經(jīng)造模處理后，大鼠脊髓背角IL-6、IL-18、IL-1β及TNF-α表達均上升，證實了炎性因子的表達與神經(jīng)病理性疼痛的密切相關(guān)性。實驗結(jié)果還發(fā)現(xiàn)經(jīng)過鞘內(nèi)注射LAA干預(yù)后，大鼠脊髓背角IL-6、IL-18、IL-1β及TNF-α表達降低，表明降低星形膠質(zhì)細胞表達后，可引起炎性因子的表達，星形膠質(zhì)細胞可能是神經(jīng)膠質(zhì)細胞、NF-κB與炎性細胞因子三者反應(yīng)的起始作用點。與此同時電針頸夾脊也可使大鼠脊髓背角IL-6、IL-18、IL-1β及TNF-α表達降低，在降低大鼠脊髓背角IL-6、IL-18及IL-1β表達上較LAA低，但在降低TNF-α表達上同鞘內(nèi)注射LAA差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

綜上所述，電針頸夾脊穴可能通過抑制星形膠質(zhì)細胞活化，下調(diào)NF-κB、IL-1β、IL-6、IL-18及TNF-α的表達，減輕神經(jīng)根壓迫所致炎性反應(yīng)，從而改善CSR所致神經(jīng)病理性疼痛癥狀。