劉偉偉，丁 麟，王秀艷，王曉燕

(1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第960醫(yī)院，山東 濟南 250000；2.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250300)

功能性消化不良(Functional Dyspepsia，F(xiàn)D)是一種常見的功能性胃腸疾病，發(fā)病癥狀有餐后飽脹、早飽感和上腹脹痛等。該病區(qū)別于器質(zhì)性病變，起病緩慢，反復發(fā)作[1]。隨著現(xiàn)代人生活方式的改變和工作節(jié)奏的加快，F(xiàn)D的發(fā)病率正在不斷上升。在亞洲，F(xiàn)D發(fā)病率達8%～23%[2]，據(jù)我國調(diào)查資料顯示，F(xiàn)D患者占胃腸疾病專科門診患者的50%左右。FD不僅影響患者生活質(zhì)量和工作效率，還會給家庭和社會帶來負擔。當前治療藥物主要有抑制胃酸藥和促胃動力藥等[3]，西藥雖然能在短時間內(nèi)加速提升胃動力，但純西藥具有較高的刺激性，具有反彈性和局限性，對患者身體危害很大。中醫(yī)在FD的治療上有獨特治療優(yōu)勢。電針療法將傳統(tǒng)醫(yī)學與現(xiàn)代技術(shù)相結(jié)合，用電針器輸出脈沖電流，通過毫針作用于機體經(jīng)絡(luò)穴位治療疾病，具有簡便、可重復和副作用少等優(yōu)點，但其缺點為無法長期作用于穴位[4]。穴位埋線治療彌補了這一缺點，通過以針刺的方法將外科手術(shù)縫線埋在穴位里，對穴位起到長期的治療作用，有效延長了刺激作用。手術(shù)縫線可完全吸收，對身體無任何副作用[5]?，F(xiàn)已有研究表明，電針以及埋線治療在臨床上均取得了良好效果[6-7]，但其作用機制仍不清楚。因此，探究電針聯(lián)合埋線治療對FD大鼠的治療機理至關(guān)重要，為其在臨床上的應用推廣提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康清潔級雄性SD大鼠50只，8周齡，體質(zhì)量為(240±20)g，由珠海百試通生物科技有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2019-0051，動物使用許可證號：SYXK(粵)2019-0023，動物質(zhì)量合格證號：BS601302。所有動物均嚴格按照動物飼養(yǎng)規(guī)則喂養(yǎng)，溫度為25 ℃，濕度為60%，實驗室適應性飼養(yǎng)1周后用于實驗研究。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 試劑 番瀉葉煎劑(購自亳州市億弘堂藥業(yè)有限公司，批號20200519，番瀉葉水煎煮，去渣，濃縮成品率200%)；高脂飼料(購自上海華雅思創(chuàng)生物科技有限公司，批號D12405B，由84%玉米粉+15.5%豬油+0.5%膽固醇配制而成)；營養(yǎng)性半固體糊(將10 g羧甲基纖維素鈉加入250 mL蒸餾水中，充分溶解，加入16 g奶粉、8 g糖、8 g淀粉和2 g活性炭粉，邊攪拌邊加入蒸餾水，制成300 mL黑色半固體營養(yǎng)糊)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、組織裂解液、BCA蛋白測定試劑盒、硝酸纖維素膜和ECL顯色試劑盒(購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號分別為DP60113、P1007、SF0019、P3015和JK-10674)；兔抗大鼠Nod樣受體蛋白3(NLRP3)抗體、兔抗大鼠β-肌動蛋白(β-actin)抗體和羊抗鼠二抗(購自艾博抗上海貿(mào)易有限公司，批號分別為ab263899、ab8277及ab6721)。

1.2.2 儀器 顯微鏡(購自日本尼康公司，型號LV100N POL)；凝膠成像系統(tǒng)(購自上海培清科技有限公司，型號JS-M9P)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組、造模及處理 將大鼠隨機分為空白對照組、模型組、電針組、埋線治療組以及電針聯(lián)合埋線治療組，每組各10只。除對照組外，其余各組均參照文獻[8]，用高脂飼料喂養(yǎng)+番瀉葉煎劑灌胃+束縛+游泳等多因素干預，復制FD肝郁脾虛證模型。在2周內(nèi)用高脂飼料正常飼養(yǎng)，每天用番瀉葉煎劑灌胃給藥，每次3 mL。期間每天早8：00—11：00將大鼠束縛于束縛架上，分別固定大鼠的胸部和腹部，放入飼養(yǎng)箱中，每日3 h；每日14：00大鼠游泳15 min。最后，以大鼠飲食及活動少、被束縛時反應少、呼叫弱、毛發(fā)枯亂無光澤和大便稀溏不成形，表明成功建模，40只大鼠均造模成功。

成功建模后開始采用相應處理。參照《大鼠穴位圖譜的研制》[9]，穴位選擇中脘透下脘、足三里(雙)、肝俞(雙)以及脾俞透胃俞(雙)。電針組大鼠皮膚經(jīng)常規(guī)消毒后用一次性無菌針灸針，垂直刺入穴位20～50 mm，以得氣為度，然后接通電針治療儀，疏密波，頻率5 Hz/100 Hz，強度2 mA，1次/d，30 min/d，兩周為1個療程。埋線治療組大鼠取穴相同，用注射器針頭作套管，在進針的同時將0.5 cm的外科手術(shù)縫線埋入穴位中，為保證線頭不外露，用醫(yī)用膠帶粘好，每7 d進行埋線治療1次，兩周為1個療程。電針聯(lián)合埋線治療組兩種治療方法都施用，以兩周為1個療程?？瞻讓φ战M和模型組不進行治療。

1.3.2 一般行為觀察 干預期間，每天觀察每組大鼠的一般情況，評分標準參照文獻[8],見表1，一般情況評分為每項評分之和，總分為30分。干預結(jié)束后，比較各組大鼠在干預前和干預后的一般情況評分。

表1 各組大鼠一般情況評分標準表

1.3.3 各組大鼠胃排空率和小腸推進率的測定 將大鼠禁食24 h，灌服1次營養(yǎng)性半固體糊，用量為1 mL/100 g體質(zhì)量，30 min后斷頭，處死大鼠。剖腹，結(jié)扎賁門與幽門取下胃，稱質(zhì)量，然后沿胃小彎剪開胃壁，置于生理鹽水中充分清洗，再稱其質(zhì)量。胃排空率(%)=[1-(胃全重-胃凈重)/灌胃量]×100%。取從幽門至回盲部的大鼠小腸，輕輕拉直，測量小腸的總長度以及小腸中黑色糊狀物前沿到幽門的長度，就是黑色半固體糊在大鼠小腸中推進的長度。小腸推進率(%)=小腸中推進的黑色半固體糊長度/小腸的總長度×100%[10]。

1.3.4 組織學結(jié)構(gòu)觀察 將1.3.3中的腸管用生理鹽水清洗后，置于4%多聚甲醛中固定，行常規(guī)石蠟切片。一部分切片采取HE染色。切片脫蠟復水，蘇木精染色5 min后蒸餾水漂洗，1%鹽酸酒精分色，伊紅染色1 min，脫水，透明，封片。另一部分切片采取免疫組化染色。

1.3.5 小腸組織中NLRP3水平 切片常規(guī)脫蠟至水，3% H2O2室溫處理5～10 min以滅活內(nèi)源性酶，PBS漂洗3次；根據(jù)所用一抗性質(zhì)選擇合適的抗原修復方法；滴加封閉液，室溫20 min，免洗；滴加1∶200稀釋后的一抗(NLRP3抗體)4 ℃過夜，PBS洗滌3次×2 min；滴加1∶1 000羊抗鼠二抗稀釋液，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3次×2 min；配制并滴加DAB顯色液，鏡下控制顯色時間，蒸餾水洗滌；蘇木精輕度復染；梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。顯微鏡下觀察到陽性細胞被染為黃、棕色顆粒。

1.3.6 小腸組織中NLRP3蛋白表達水平 取1.3.3所保存各組大鼠小腸組織，剪碎，置于玻璃勻漿器中；加入含有苯甲基磺酰氟的裂解液，冰上反復勻漿。30 min后，4 ℃下12 000 rpm離心5 min，收集上清液，參照BCA試劑盒測定蛋白總濃度。配制10%分離膠、4%濃縮膠。取50 μg蛋白上樣，沸水浴處理5 min使蛋白變性，冷卻后可以上樣。初始電壓為80 V，待樣品進入分離膠后，換成120 V。電泳結(jié)束后，將目的條帶凝膠切除，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，冰上進行轉(zhuǎn)膜反應，電壓為60 V，反應時間2 h。結(jié)束后用TBS清洗，用封閉液室溫下?lián)u床搖動封閉1 h，TBS清洗后，加入兔抗NLRP3、兔抗β-actin抗體一抗(稀釋倍數(shù)1∶200)，4 ℃過夜。TBS清洗后加入羊抗鼠二抗(稀釋倍數(shù)1∶2 000)，室溫下孵育2 h，TBS清洗、ECL顯色后置于凝膠成像系統(tǒng)中分析電泳條帶。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠干預前后一般情況觀察及評分比較

造模前各組大鼠精神狀態(tài)良好，無異常反應；造模后，除空白對照組大鼠外，其余大鼠均出現(xiàn)了毛發(fā)臟亂枯黃不順、懶動倦臥、厭食厭水、被束縛時反應小和大便不成型等現(xiàn)象。與空白對照組比較，模型組一般情況評分顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，電針組、埋線治療組和電針聯(lián)合埋線治療組大鼠一般情況均有所改善，一般狀況評分顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；電針組與埋線治療組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與電針組、埋線治療組比較，電針聯(lián)合埋線治療組一般情況評分顯著上升，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠干預前后一般情況評分比較

2.2 各組大鼠胃排空率和小腸推進率比較

與空白對照組比較，模型組大鼠的胃排空率以及小腸推進率都有明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，各干預組大鼠的胃排空率以及小腸推進率都有明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，電針組與埋線治療組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與電針組、埋線治療組比較，電針聯(lián)合埋線治療組胃排空率和小腸推進率顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠胃排空率和小腸推進率比較

2.3 各組大鼠小腸組織HE染色結(jié)果

與空白對照組比較，模型組大鼠小腸組織可見充血水腫及淋巴細胞-漿細胞浸潤；與模型組比較，各干預組大鼠均有不同程度的減輕，效果最明顯的是電針聯(lián)合埋線治療組。見圖1。

圖1 各組大鼠小腸組織HE染色(100×)

2.4 各組大鼠小腸組織NLRP3免疫組化染色結(jié)果

空白對照組僅見少量NLRP3蛋白陽性細胞；模型組可見大量NLRP3蛋白陽性細胞；與模型組相比，各干預組NLRP3蛋白陽性細胞均有所減少，減少最明顯的是電針聯(lián)合埋線治療組。見圖2。

圖2 各組大鼠小腸NLRP3免疫組化染色(100×)

2.5 各組大鼠小腸組織NLRP3蛋白表達水平比較

與空白對照組比較，模型組大鼠的NLRP3蛋白表達量有明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，各干預組大鼠的NLRP3蛋白表達量明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，電針組與埋線治療組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與電針組、埋線治療組比較，電針聯(lián)合埋線治療組NLRP3蛋白表達量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3、表4。

注:A.空白對照組；B.模型組；C.電針組；D.埋線治療組；E.電針聯(lián)合埋線治療組。

表4 各組大鼠小腸組織中NLRP3蛋白表達量

3 討論

FD的發(fā)病通常與胃酸過多或過少、消化道動力異常和內(nèi)臟高敏感性等因素有關(guān)，無器質(zhì)性病變[11-12]。在臨床工作中，F(xiàn)D患者由于缺乏對疾病的認識而承受著沉重的心理負擔，嚴重影響了生活質(zhì)量。目前對于該疾病的治療主要依賴于西藥，雖然能在短時間內(nèi)起到很好的療效，但其副作用也極大，因此有必要尋找更加安全有效的治療方法以減少使用藥物所產(chǎn)生的副作用，近些年有研究發(fā)現(xiàn)，相對于藥物治療，電針聯(lián)合穴位埋線治療不僅無副作用，而且在改善一些特定臨床癥狀中療效更佳[3-5]。

在本研究中，采用多種因素復制FD大鼠模型，高脂飼養(yǎng)造成胃排空延緩，束縛導致內(nèi)臟高敏感，游泳導致肝郁脾虛，番瀉葉模擬外邪所傷等[13]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的一般行為狀態(tài)明顯弱于空白對照組，皮毛暗沉，行為活動減少，對外部刺激的反應較慢，呆滯，嗜睡，大便不規(guī)則，胃排空率和小腸的推進率明顯降低,表明FD大鼠模型已成功復制。

中醫(yī)認為FD多因情志內(nèi)傷、勞倦傷脾和中氣不足等所致，中醫(yī)辨證多見肝郁脾虛型[14]。肝主疏泄，脾胃共居中焦，共司水谷運化。肝氣郁結(jié)則疏泄不利，脾氣亦因之運化失職，累及中焦，胃氣亦弱，最終導致血氣運行不暢、胃腸功能紊亂[15]。臨床研究表明，電針對FD有很好的治療效果，其對FD患者的腹脹、腹痛、厭食、焦慮和抑郁情緒的改善可能與其恢復胃腸動力和激素水平、調(diào)節(jié)植物神經(jīng)功能有關(guān)[16-18]。臨床上采用中醫(yī)穴位埋線方法改善已被確診為肝郁脾虛型FD患者的胃脘痛、腹脹和噯氣等癥狀，以促進患者康復[19]。已有研究發(fā)現(xiàn)，電針聯(lián)合穴位埋線可以有效治療結(jié)腸慢傳輸型便秘[20-21]，但對二者合用治療FD目前還未見報道。循經(jīng)取穴均根據(jù)“經(jīng)脈所通，主治所及”的原則，中脘、下脘、足三里、肝俞、脾俞和胃俞都是治療消化疾病的常用穴位。《難經(jīng)》說腑會中脘，中脘作為胃之募穴，配足三里常用來治療腹脹痛；下脘則偏重于緩解小腸、脾不運化所導致的各種疾??；肝俞、脾俞和胃俞都冠有臟腑名，因此對該臟腑的疾病是有療效的。在本研究中，采取電針聯(lián)合埋線治療通過上述各穴位作用于FD大鼠，發(fā)現(xiàn)大鼠一般行為基本恢復正常，一般行為評分、胃排空率以及小腸推進率均有明顯升高且效果最為明顯，比單用電針治療或單用穴位埋線治療效果更好。其原因可能是電針聯(lián)合埋線治療對穴位不但有電針的短時、強烈作用，也有穴位埋線治療的長時、溫和的作用效果，該結(jié)果表明，電針聯(lián)合埋線治療能夠有效改善FD大鼠行為學變化及胃腸道功能。

NLRP3炎性體是機體內(nèi)識別免疫系統(tǒng)病原體的重要蛋白，在炎癥反應中起著關(guān)鍵作用[22]，有報道顯示，其在腸粘連、結(jié)腸炎或其他炎癥性腸病以及其他慢性炎癥患者中有重要作用，可作為治療效果的反應因子[23]，但其在FD中目前還尚未報道。本研究中，在模型組大鼠中NLRP3蛋白水平有明顯提高，經(jīng)過治療后又顯著下降，猜測NLRP3在FD中存在重要作用。而且，該結(jié)果表明電針聯(lián)合埋線治療可能通過改善FD大鼠腸道炎癥狀態(tài)，達到治療FD的目的。

綜上所述，電針聯(lián)合埋線治療對FD大鼠療效顯著，能明顯減輕發(fā)病癥狀，可能與其降低NLRP3水平有關(guān)。本研究結(jié)果不僅為尋找新的FD有效治療方法提供參考，還對電針聯(lián)合埋線治療在FD中的治療機制研究具有重要意義，但本研究未設(shè)抑制劑或激活劑加以驗證，后續(xù)還需進一步實驗。