周斌，楊玉，劉志強(qiáng)，謝理玲，楊利，徐晗

（江西省兒童醫(yī)院，南昌醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院1.內(nèi)分泌遺傳代謝科；2.檢驗(yàn)科；3.兒內(nèi)科，南昌 330006；4.南昌大學(xué)江西醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)部，南昌 330000）

兒童1型糖尿病 (Type 1Diabetes Mellitus，T1DM)是兒童期最常見的慢性疾病之一，其發(fā)病率有逐年增加趨勢，已成為全球最重要的公共衛(wèi)生問題之一。2021年國際糖尿病聯(lián)合會IDF發(fā)布了第十版《糖尿病地圖》顯示全球約有261萬年輕T1DM患者（<20歲），其數(shù)量為2015年的4倍[1]。T1DM是一種慢性免疫介導(dǎo)性疾病，是由于產(chǎn)生胰島素的胰島β細(xì)胞遭到破壞引起胰島素缺乏而導(dǎo)致，但其具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[2]。尤其是對于新發(fā)T1DM合并DKA患者的免疫狀態(tài)的臨床研究尚不多。因此，本研究通過觀察新診斷的T1DM合并DKA患者體液免疫、炎癥細(xì)胞因子及淋巴細(xì)胞亞群水平，探討其免疫功能狀態(tài)變化，為其進(jìn)一步的診療提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2021年01月至2022年1月江西省兒童醫(yī)院收治的40例新發(fā)T1DM合并DKA患兒為觀察組，其中男16例，女24例，平均年齡8.9歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）指南及中國共識中的T1DM診斷標(biāo)準(zhǔn)[3-4]，并且排除器質(zhì)性疾病，如心臟、肝臟、腎臟及結(jié)締組織疾病者等情況。DKA的診斷標(biāo)準(zhǔn)采用2020年中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會內(nèi)分泌遺傳代謝學(xué)組發(fā)布的最新的兒童DKA診療標(biāo)準(zhǔn)[4]：符合糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)者，血酮體或尿酮體陽性，同時血?dú)夥治鯬H值＜7.3或者HCO3-＜15 mmol/L者納入觀察組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(SKJP220202151)，并得到所有受試者家屬知情同意。同時選擇同期來我院兒?？企w檢的健康兒童20例作為對照組，其中男8例，女12例，平均年齡8.8歲。兩組兒童的性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 實(shí)驗(yàn)室檢查 觀察組與對照組兒童均抽取清晨空腹外周靜脈血5ml.(1)通過免疫比濁法使用全自動生化分析儀檢測兩組兒童的外周血中的免疫球蛋白（IgM、IgE、IgA、IgG）的濃度。儀器及試劑使用FACS CantoⅡ流式細(xì)胞儀（美國BD公司），TD5AWS離心機(jī)，美國賽默飛酶標(biāo)儀，洗板機(jī)（安圖實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），恒溫孵育箱，PE anti-human TCRγδ（，Alexa Fluor488偶聯(lián)anti-human IL-17A McAb，PerCP anti-human CD3、CD8、CD4、CD16、CD56、CD19 McAb，Human IL-1B、IL2R、IL6、IL8、IL10、IL17、TNFα、IFN-γELISA Kit。留取靜脈血1ml放入普通管采集、離心并分離后得到血清，放-80℃冰箱保存后，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清IL-1B、IL2R、IL6、IL8、IL10、IL17、TNFα、IFN-γ的OD值，并根據(jù)試劑盒步驟制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到公式后，將OD值轉(zhuǎn)化為的濃度值后匯總進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。使用淋巴細(xì)胞分離液從肝素抗凝的2 mL外周血標(biāo)本中提取單個核細(xì)胞(PBMCs)懸浮液后[5]，再使用胎牛血清培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)整為2×106/mL，取其中細(xì)胞懸液加入豆蔻酰佛波醇乙酯、離子霉素及莫能菌素吹打混勻細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 h。收集培養(yǎng)后細(xì)胞于流式上樣管中離心洗滌后再懸浮后待檢測。設(shè)立陰性對照并同時設(shè)立陽性對照組后，分別加入Per-CP anti-human CD19、CD3、CD8、CD4、CD16、CD56等淋巴細(xì)胞表面抗體并染色后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測；最后得到原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入FACSDiva軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)整理核對后采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用X2檢驗(yàn)。計(jì)量資料采用(±s)表示，Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)符合正態(tài)性分布，組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 觀察組體液免疫水平 觀察組IgA水平高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；觀察組IgE、IgG、IgM水平與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。見表1。

表1 觀察組與對照組免疫球蛋白水平的比較（±s）

表1 觀察組與對照組免疫球蛋白水平的比較（±s）

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2.2 觀察組細(xì)胞因子水平 觀察組IL-1B、IL8、IFNγ水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，觀察組IL2R、IL6、IL10、IL17、TNFα水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 觀察組與對照組細(xì)胞因子水平的比較（±s）

表2 觀察組與對照組細(xì)胞因子水平的比較（±s）

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2.3 觀察組淋巴細(xì)胞亞群水平 觀察組B淋巴細(xì)胞數(shù)、B淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)、CD4+CD8+雙陽性T淋巴細(xì)胞數(shù)、CD4+CD8+雙陽性T淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)、NK細(xì)胞數(shù)、NK細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中觀察組B淋巴細(xì)胞數(shù)、B淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)、CD4+CD8+雙陽性T淋巴細(xì)胞數(shù)、CD4+CD8+雙陽性T淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為增高表現(xiàn)，NK細(xì)胞數(shù)、NK細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為降低表現(xiàn)；觀察組的總T淋巴細(xì)胞數(shù)、總T淋巴細(xì)胞數(shù)百分?jǐn)?shù)、T4淋巴細(xì)胞數(shù)、T4淋巴細(xì)胞數(shù)百分?jǐn)?shù)、T8淋巴細(xì)胞數(shù)、T8淋巴細(xì)胞數(shù)百分?jǐn)?shù)及T4/T8與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

表3 觀察組與對照組淋巴細(xì)胞亞群水平的比較（±s）

表3 觀察組與對照組淋巴細(xì)胞亞群水平的比較（±s）

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3 討論

傳統(tǒng)上，1型糖尿?。═1DM）被認(rèn)為是T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病。是由于分泌胰島素的胰腺β細(xì)胞損傷所致。有研究表明其損傷機(jī)制可能與其自反應(yīng)T細(xì)胞的直接相互作用有關(guān)。因此，大多數(shù)關(guān)于1型糖尿?。═1DM）免疫學(xué)的研究都集中在T細(xì)胞的功能上。這并不奇怪，因?yàn)樵诩膊『笃?，自反?yīng)T細(xì)胞介導(dǎo)了產(chǎn)生胰腺β細(xì)胞的胰島素破壞[2]。但是，許多研究表明，如抗CD20（利妥昔單抗）療法通過廣泛消耗B細(xì)胞治療T1DM的成功，可以延緩非肥胖糖尿病（NOD）小鼠和新發(fā)患者的疾病進(jìn)展[6-7]。因此表明B細(xì)胞免疫耐受性的破壞也是T1DM的主要因素。

本研究結(jié)果顯示：兒童新發(fā)T1DM并DKA患者體內(nèi)B淋巴細(xì)胞水平及IgA水平顯著增高，提示此類患者體內(nèi)存在體液免疫的過度激活及功能紊亂。B細(xì)胞參與人類T1DM發(fā)展的具體機(jī)制尚未完全明了。有人認(rèn)為，與NOD一樣，B細(xì)胞通過抗原呈現(xiàn)促進(jìn)發(fā)病機(jī)制。HLA II類基因的DR3/4-DQ2/8等位基因?qū)1D疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)最大，表明抗原呈現(xiàn)給CD4 T細(xì)胞至關(guān)重要[8]。HLA I類等位基因在風(fēng)險(xiǎn)等位基因中排名第二。有趣的是，在新診斷的T1DM患者的胰腺淋巴細(xì)胞中，B細(xì)胞的頻率僅次于CD8 T細(xì)胞[9]。人們很容易猜測，這些B細(xì)胞是CD8 T細(xì)胞的主要抗原呈遞細(xì)胞（Antigen-presenting cells，APC），這在NOD小鼠中已經(jīng)證明了這一點(diǎn)。這些B細(xì)胞必須逃脫正常的沉默機(jī)制，并對抗原有反應(yīng)。這在與對照組相比，T1DM和SLE患者在λ+B細(xì)胞中的重組序列（RS）重組都減少了，表明這些自身免疫患者減少了受體編輯[10]。這些研究表明，自身免疫患者在開始RS重新排列時可能具有更高的自反應(yīng)閾值，可能允許更多的自反應(yīng)B細(xì)胞進(jìn)入外周。在這方面，最近研究表明，Ptpn22 T1D風(fēng)險(xiǎn)等位基因以B細(xì)胞的內(nèi)在方式發(fā)揮作用，允許自反應(yīng)B細(xì)胞進(jìn)入外周[11]。因此，間接證據(jù)表明，在人類T1DM胰島中，抗原反應(yīng)B細(xì)胞有可能逃脫耐受并進(jìn)入外周，通過向CD4和CD8 T細(xì)胞呈現(xiàn)抗原來促進(jìn)疾病的胰腺定位。

本研究結(jié)果顯示：兒童新發(fā)T1DM并DKA患者體內(nèi)IL-1B、IL8、IFN-γ水平顯著性增高，提示此類患者體內(nèi)存在炎癥相關(guān)因子水平的激活。在對一項(xiàng)134名新發(fā)的T1DM患兒的2年隨訪研究中發(fā)現(xiàn)，與T1DM未緩解的患者相比，緩解者中的IL-8(P=0.042)濃度顯著升高。但也有研究表明，外周血的IL-8水平顯著升高與T1DM代謝控制不佳有關(guān)[12]。NOD小鼠作為T1DM的動物模型，通過轉(zhuǎn)基因雜交技術(shù)，得到IL-17和/或IFN-γ雙缺陷的NOD小鼠，發(fā)現(xiàn)IL-17/IFN-γ受體雙缺陷NOD小鼠的長期糖尿病發(fā)病率明顯下降，但胰島自身炎癥沒有改變，這些結(jié)果表明IL-17/Th17參與了胰島炎的發(fā)展，并且IL-17和IFN-γ信號傳導(dǎo)可能協(xié)同促進(jìn)NOD小鼠糖尿病的發(fā)展[13]。已有多個研究顯示T1DM患者IL-1水平顯著增高，并有IL1受體拮抗劑的治療，如糖尿病行動 (AIDA)和TrialNet Canakinumab(TN-14)試驗(yàn)中的抗白介素-1治療或者卡那單抗的治療，盡管治療改善T1DM患者炎癥因子水平，但是并不能改善C肽釋放試驗(yàn)的C肽水平[14]。因此，T1DM存在細(xì)胞炎癥因子水平紊亂，但其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

NK細(xì)胞（natural killer cell，NK）是一種不表達(dá)T細(xì)胞（CD3)和B細(xì)胞（CD19）的大顆粒淋巴細(xì)胞，廣泛分布于外周各組織器官及血液循環(huán)系統(tǒng)，無須抗原的預(yù)先刺激與活化即可直接激活并通過分泌細(xì)胞因子及趨化因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，因此在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)、抗感染及抗腫瘤等多方面有著不可或缺的作用[15]。雖然有研究在動物模型和糖尿病患者發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞與T1DM的發(fā)病相關(guān)，但并無或益或損的定論。且在臨床T1DM患者中，外周血NK細(xì)胞活性和數(shù)量的變化研究也無最終的結(jié)論。臨床NK細(xì)胞研究未能深達(dá)胰腺的病理與其相互驗(yàn)證，動物實(shí)驗(yàn)研究亦未能完全模擬人體的病理狀態(tài)[16]。本研究顯示，T1DM合并DKA組的NK細(xì)胞數(shù)量及百分比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的減少。通過已有的數(shù)據(jù)及文獻(xiàn)線索推導(dǎo)，T1DM患者外周血NK細(xì)胞的降低可能與NK細(xì)胞聚集在胰腺或淋巴結(jié)中的數(shù)量增加有關(guān)[17]。其次，動物中的NK細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)研究中亦發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞可能下調(diào)IFN-γ分泌并同時下調(diào)自身反應(yīng)性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，從而達(dá)到保護(hù)T1DM患者，減輕其自身免疫反應(yīng)[18，19]。這個機(jī)制恰好也可以解釋本研究NK細(xì)胞降低與IFN-γ增高這兩個結(jié)果的聯(lián)系。

T淋巴細(xì)胞的分化，根據(jù)CD4和CD8的表達(dá)，可以將其分為雙陰性（double-negative，DN）、雙陽性（double-positive，DP）和單陽性（single positive，SP）三個主要階段[20]。DN細(xì)胞通過“β-選擇”轉(zhuǎn)化為DP細(xì)胞，DP再通過陽性選擇（positive selection）分別與MHC I類分子結(jié)合則轉(zhuǎn)化為CD4-CD8+的單陽性T細(xì)胞，與MHCⅡ類分子結(jié)合則轉(zhuǎn)化為CD4+CD8-的單陽性T細(xì)胞。其意義在于使DP細(xì)胞分化為具有MHC限制性的SP細(xì)胞達(dá)到免疫作用保護(hù)機(jī)體。最后不能結(jié)合的SP細(xì)胞通過陰性選擇（negative selection）發(fā)育為成熟T細(xì)胞進(jìn)入外周免疫器官，清除自身反應(yīng)性T細(xì)胞，從而避免發(fā)生如T1DM類的自身免疫性疾病[21-22]。本研究為新發(fā)T1DM合并DKA患者，其存在T淋巴細(xì)胞分化的不暢，但T4淋巴細(xì)胞、T8淋巴細(xì)胞無顯著性改變，其CD4+CD8+雙陽性T淋巴細(xì)胞數(shù)增高可能與T1DM處于早期階段有關(guān)，其后續(xù)變化仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，兒童新發(fā)T1DM合并DKA患者存在體液免疫功能異常，B細(xì)胞數(shù)量及IgA的增高，并且兒童新發(fā)T1DM并DKA患者體內(nèi)多種炎癥因子水平增高，存在CD4+CD8+雙陽性T淋巴細(xì)胞數(shù)增高及NK細(xì)胞的降低，提示兒童新發(fā)T1DM并DKA患者存在B淋巴細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞的雙重功能異常，淋巴細(xì)胞亞群功能紊亂可能為導(dǎo)致兒童T1DM的關(guān)鍵病因之一。