李杰，劉裬，黃鈾新，盧洪飛，羅耀玲

（1.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院；2.贛南醫(yī)學(xué)院，贛州 341000）

肺癌（lung cancer）是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其病死率占惡性腫瘤的第一位，被認為是對人類生命和健康威脅最大的腫瘤[1]。盡管現(xiàn)在肺癌在診斷、分期和治療方法上有了很大進步，前景并沒大幅度改變，在過去的十年里總的5年生存率只有輕微的增加（從15.7%到17.4%）[2]。NLRC3是NLR家族一員，它能夠抑制NF-κB控制的主要炎性通路[3-5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，NLRC3有潛在的抑癌作用[6-8]，有望成為人類癌癥的預(yù)防和治療的新靶點。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)NLRC3在肺癌組織中的表達明顯低于癌旁組織。該課題進一步從細胞和分子水平研究NLRC3與肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，通過小RNA干擾技術(shù)，使NLRC3在BEAS-2b細胞內(nèi)低表達，觀察低表達NLRC3對細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響和初步機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺正常上皮細胞株BEAS-2b細胞購自中科院上海細胞生物研究所細胞庫；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（GIBCO）；青鏈霉素溶液（索萊寶）；Lipofectamine 2000；RIPA裂解液（上海碧云天）；TRIZOL（Invitrogen）；熒光定量PCR試劑盒（bio-rad）；Matrigel（BD）；Transwell小室（costa）；Ecadherin、MMP-2、MMP-9抗體購自Abcam公司，β-actin一抗及相關(guān)二抗購自中杉金橋公司；干擾片段si NLRC3、陰性對照序列（siNC）由生工生物（上海）股份有限公司設(shè)計合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人肺正常上皮細胞BEAS-2b培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清和1%青鏈霉素溶液）；于37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁生長覆蓋達80-90%左右時將細胞進行傳代培養(yǎng)。后續(xù)實驗所用細胞均是取處于對數(shù)生長期的細胞，活細胞數(shù)達95%以上。

1.2.2 BEAS-2b細胞的si RNA轉(zhuǎn)染方法的確定 取對數(shù)生長期的BEAS-2b細胞，胰酶消化、計數(shù)，按1.5×105cells/孔來接種于6孔培養(yǎng)板，每孔加入2mL完全培養(yǎng)基。待融合度達50%左右進行轉(zhuǎn)染，將LipofectamineTM2000與熒光FAM標記的陰性siRNA片段（FAM-siNC）按照不同比例進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染4 h后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，以確定最佳轉(zhuǎn)染方法（參照siRNA轉(zhuǎn)染說明書進行）。

1.2.3 熒光定量PCR驗證干擾效果 轉(zhuǎn)染方法同前。實驗分為3組：未轉(zhuǎn)染組（UT）、siNC組、siNLRC3組，每組做2個平行孔。未轉(zhuǎn)染組用等量PBS代替轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染4 h后更換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后用Trizol提取每孔總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA后進行熒光定量PCR：NLRC3上游引物：5” -GACATGAAGGCGTTTGGTGT-3” ，下游引物：5” -GCCATAGTAATACGCGGCTG-3” ，長度為153bp；內(nèi)參β-actin上游引物：5” -TATCCAGGCTGTGCTATCCC-3” ，下 游 引 物：5” -CCATCTCTTGCTCGAAGTCC-3” ，長度為320bp。qRT-PCR條件為：94℃預(yù)變性10min；94℃變性15s，60℃退火30s并收集熒光，共40個循環(huán)。數(shù)據(jù)采用相對定量法，以2-△△Ct來進行分析，△Ct=Ct目的-Ct內(nèi)參，△△Ct=△Ct實驗組-△Ct對照組。

1.2.4 Transwell檢測低表達NLRC3對BEAS-2b遷移能力的影響 細胞分組、接種及轉(zhuǎn)染方法同前，轉(zhuǎn)染4 h后更換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后收集各組的細胞，計數(shù)，用含0.1%BSA的無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)節(jié)細胞濃度為1×106個/mL。吸取各組細胞懸液200μL加入水化后的Transwell小室中，再通過間隙向下腔加入600μL含5%FBS的培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h；隨后取出Transwell小室，用無菌棉簽擦去小室中的細胞，PBS洗3遍再放回原孔中，下腔加入60μL 5 g/L的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清，加DMSO 600μL，振蕩10min充分溶解結(jié)晶，測A570nm值。

1.2.5 Matrigel檢測低表達NLRC3對BEAS-2b侵襲能力的影響按遷移實驗方法分組及轉(zhuǎn)染細胞。將基質(zhì)膠Matrigel進行1:8稀釋，取80μL Matrigel包被Transwell小室，置于培養(yǎng)箱內(nèi)2 h使Matrigel聚集成凝膠。將轉(zhuǎn)染24 h的BEAS-2b細胞，消化、離心收集細胞，用0.1%BSA無血清培養(yǎng)基重懸，計數(shù)，調(diào)整細胞密度為1×106個/mL，每組細胞懸液分別取200μL接種到小室，另將600μL含10%FBS的1640培養(yǎng)液加到下室；繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h。待培養(yǎng)結(jié)束后取出Transwell小室，無菌棉簽拭去小室內(nèi)未發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的細胞并用PBS洗滌3遍，甲醇固定20 min，0.1%結(jié)晶紫溶液染色15 min，PBS緩沖液輕輕洗3次。顯微鏡下隨機取5個視野計數(shù)侵襲轉(zhuǎn)移細胞數(shù)量，重復(fù)3次取均數(shù)。

1.2.6 Western blot檢測低表達NLRC3對E-cadherin、MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響 按遷移實驗方法分組及轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染48h后棄上清，并用PBS洗滌2遍，6孔板中每孔加入500μL蛋白裂解液，置冰上作用30min，期間用移液器反復(fù)吹打，以便細胞充分裂解。然后將裂解液全部轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，以4℃12000 rpm離心5 min，上清液即為含總蛋白的溶液。蛋白定量（以便統(tǒng)一上樣量）后，煮沸，上樣（總蛋白約30μg）；然后經(jīng)電泳、切膠、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜等過程。最后用ECL發(fā)光并在bio-rad凝膠成像儀上成像，并對條帶進行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 運用SPSS18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以（±s）表示；多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，方差不齊采用Tamhanes” T2(M)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡篩選轉(zhuǎn)染效率FAM-siNC轉(zhuǎn)染4h后于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果。結(jié)果比例為100 pmol∶5μL組的細胞在熒光鏡下激發(fā)出綠色熒光的細胞約占觀察視野下細胞總數(shù)的90%以上，且細胞生長狀態(tài)良好，后續(xù)實驗均以此轉(zhuǎn)染比例進行細胞轉(zhuǎn)染。結(jié)果見圖1。

圖1 熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果Figure 1 Transfection effect under fluorescent microscope

2.2 熒光定量PCR檢測干擾效果 熒光定量PCR結(jié)果顯示：與未轉(zhuǎn)染組（UT）比較，siNC組NLRC3基因表達水平略微降低，無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；siNLRC3組NLRC3基因表達水平顯著降低（P＜0.01）。siNLRC3干擾片段干擾效率為77%（相對于陰性片段轉(zhuǎn)染組siNC）。見表1。

表1 s i NLRC3片段干擾效率（x±s，n=3）Ta b l e 1 s i NLRC3 f r a g me n t i n t e r f e r e n c e e f f i c i e n c y

2.3 NLRC3低表達后對BEAS-2b細胞遷移能力的變化Transwell遷移實驗結(jié)果表明，siNLRC3低表達組穿過膜的細胞數(shù)比未轉(zhuǎn)染組UT和陰性干擾組siNC明顯增多（P<0.05）。結(jié)果見表2和圖4。

表2 NLRC3低表達后對BEAS-2B細胞遷移能力的影響（x±s，n=3）Table2 The Effectsof silencing NLRC3 on migration of BEAS-2b

2.4 NLRC3低表達后對BEAS-2b細胞侵襲能力的影響Matrigel基質(zhì)膠檢測BEAS-2b細胞侵襲能力變化，鏡下觀察拍照（10×）見圖5A。計數(shù)穿膜細胞數(shù)：UT組（266.33±15.63）、si NC組（296.0±27.22）、siNLRC3組（436.33±31.01）。統(tǒng)計分析顯示：與UT組和siNC組相比，siNLRC3組穿過基質(zhì)膠的細胞數(shù)量明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），如圖5B所示。

2.5 Western blot檢測低表達NLRC3對E-cadherin、MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響 Western blot結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組（UT）和陰性轉(zhuǎn)染組（si NC）相比，NLRC3低表達組（si NLRC3）中E-cadherin蛋白表達水平下調(diào)（P<0.01），MMP-2、MMP-9蛋白表達水平上調(diào)（P<0.05）。結(jié)果如圖6所示。

3 討論

圖2 NLRC3對BEAS-2B細胞遷移能力的影響Figure 2 The effect of NLRC3 on the migration ability of BEAS-2b cells.＊P＜0.05 compared with UT group.

圖3 NLRC3表達降低后對BEAS-2B細胞侵襲能力的影響Figure 3 Effect of reduced expression of NLRC3 on the invasive ability of BEAS-2B cells.P＜0.05 compared with UT group(n=3).

圖4 NLRC3表達降低后對E-caherin、mmp-2、mmp-9蛋白表達水平的影響Figure 4 Effect of NLRC3 expression on the expression levels of E-caherin，mmp-2，and mmp-9 proteins.＊P＜0.05、#P＜0.01 compared with UT group（n=3）.

NLRC3(又稱CLR16.2，NOD3)是2005年才鑒定出來的、屬于NLR家族中的一員[9]。2012年Schneider等首次發(fā)現(xiàn)NLRC3的特殊抗炎癥作用，隨后的研究進一步證實它具有負調(diào)控固有免疫應(yīng)答的作用[3]。直至2015年才首次發(fā)現(xiàn)NLRC3在腫瘤發(fā)生中的重要作用[6]。Liu R等研究發(fā)現(xiàn)NLRC3在臨床結(jié)腸癌組織中的表達量顯著低于健康組織[10]。Karki等[6]課題組研究發(fā)現(xiàn)NLRC3-/-小鼠易患結(jié)腸炎和結(jié)直腸癌，研究發(fā)現(xiàn)NLRC3可通過抑制PI3K-mTOR信號通路的激活而抑制結(jié)腸癌的發(fā)生。禚映辰等[11]研究發(fā)現(xiàn)NLRC3在肺腺癌和肺鱗癌中的表達與正常組織相比顯著降低，NLRC3的表達促進了免疫細胞的浸潤。課題組前期在臨床標本分析中發(fā)現(xiàn)NLRC3在肺癌中表達顯著低于癌旁組織。為進一步證明NLRC3作用及功能，實驗選用上皮肺正常細胞株BEAS-2b為細胞模型，通過轉(zhuǎn)染干擾片段siNLRC3以干擾NLRC3的表達，檢測NLRC3低表達后對細胞侵襲和遷移的影響。實驗首先設(shè)計合成NLRC3的小干擾片段siNLRC3，并通過熒光定量PCR檢測干擾效果，結(jié)果表明siNLRC3片段干擾效率為77%，說明干擾有效。

腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是腫瘤惡性進展的重要因素[12]。NLRC3基因與侵襲轉(zhuǎn)移是否有關(guān)聯(lián)呢？利用Transwell實驗進行驗證，在Transwell遷移實驗中，因細胞穿過Transwell小室的細胞相對較多且分布不均勻，故傳統(tǒng)顯微鏡拍照計數(shù)法誤差相對較大；本實驗改進方法使檢測結(jié)果誤差較小，即利用穿過小室的細胞（均是活細胞）使MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲臢，DMSO溶解甲瓚，并在570nm處有最大光吸收。根據(jù)測得的吸光度值間接反映穿過小室的細胞數(shù)量。Transwell遷移實驗結(jié)果表明siNLRC3低表達后穿過小室進入下室的細胞明顯增多，說明細胞的遷移能力增加。Matrigel基質(zhì)膠檢測結(jié)果表明細胞的侵襲能力增強。該結(jié)果與程樂達等[13]研究結(jié)果一致。

腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是腫瘤細胞與宿主細胞之間相互作用的連續(xù)過程，該過程是復(fù)雜多步驟的[14]。首先是腫瘤細胞降低粘附力，才能從腫瘤母體脫落；目前認為鈣粘蛋白（E-cadherin）與腫瘤細胞粘附力降低關(guān)系最密切的，其表達降低或缺失常與侵襲轉(zhuǎn)移有重要聯(lián)系。本實驗結(jié)果表明降低NLRC3表達后，E-cadherin蛋白表達降低（P<0.05），提示細胞粘附能力下降，利于細胞的侵襲遷移。其次是細胞外基質(zhì)和基底膜的降解，這是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的一關(guān)鍵環(huán)節(jié)，基質(zhì)金屬蛋白酶是目前已知能降解細胞外基質(zhì)的唯一酶類[15]。MMP-2（又名明膠酶A）和MMP-9（又名明膠酶B），可降解IV型膠原和明膠基質(zhì)；這兩種酶與腫瘤擴散和侵襲強度相關(guān)[16-17]。蛋白檢測結(jié)果表明NLRC3低表達后MMP-2、MMP-9蛋白表達水平上調(diào)，可降解細胞外基質(zhì)，利于細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

綜上，NLRC3基因低表達后可引起E-cadherin蛋白表達降低，而MMP-2、MMP-9蛋白表達升高，促進BEAS-2b細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。