朱虹，吳綠，黃文倩，鄒霞，李云鳳，高軍

（1.南昌市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科；2.南昌大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，南昌 330006）

子宮腺肌癥作為一種常見的婦科疾病，其特征是子宮肌層內(nèi)存在間質(zhì)和子宮內(nèi)膜腺體，伴隨著與子宮肌層相鄰的結(jié)締組織的增生和肥大，最常見的癥狀是進(jìn)行性痛經(jīng)、異常子宮出血、慢性盆腔疼痛和月經(jīng)過多[1]，但其發(fā)病機(jī)制和病因目前還不清楚。子宮腺肌癥是一種良性疾病，但其生物學(xué)行為類似于惡性腫瘤，如異常增殖、遷移和侵襲[2]。有研究表明子宮腺肌癥的發(fā)生發(fā)展與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT)密切相關(guān)[3]。EMT是指上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，失去上皮細(xì)胞的表型，以增強(qiáng)其侵襲及抗細(xì)胞凋亡能力的過程[4-5]。E-鈣黏蛋白（E-cadherin）主要分布于上皮細(xì)胞中，與維持上皮細(xì)胞的表型密切相關(guān)，是一種關(guān)鍵的細(xì)胞粘附分子，E-cadherin表達(dá)減少是EMT的一個(gè)重要標(biāo)志[6-7]。E-cadherin的下調(diào)被幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子抑制，包括ZEB1、ZEB2、SNAI1、SNAI2、Twist1、Twist2和E12/E47[8]。其中，ZEB家族(ZEB1/ZEB2)為鋅指轉(zhuǎn)錄因子代表，作為EMT的核心轉(zhuǎn)錄因子，與啟動(dòng)子中E-box相互結(jié)合，抑制E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)EMT的發(fā)生[9]。本研究中，我們通過免疫組化方法檢測(cè)ZEB1、ZEB2在子宮腺肌癥內(nèi)膜及正常子宮內(nèi)膜的表達(dá)差異，為子宮腺肌癥的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018年6月至2020年3月于南昌市第一醫(yī)院婦科就診的35例子宮腺肌癥患者行全子宮切除的子宮內(nèi)膜組織作為實(shí)驗(yàn)組，10例因?qū)m頸上皮內(nèi)瘤變行全子宮切除的內(nèi)膜組織作為對(duì)照組。通過查詢南昌市第一醫(yī)院病歷信息系統(tǒng)，收集子宮腺肌癥患者的臨床特征包括患者的年齡、痛經(jīng)情況、絕經(jīng)狀態(tài)、孕次、產(chǎn)次、月經(jīng)周期、血清CA125水平等內(nèi)容。其中子宮腺肌癥患者的年齡范圍36～55歲，平均年齡為（45.26±4.455歲）。

1.2 主要試劑 本試驗(yàn)采用HE染色和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)；兔源ZEB1多克隆抗體、兔源ZEB2多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；DAB顯色試劑、免疫組化SP試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HE染色 組織經(jīng)石蠟包埋，切片后，烤片，然后脫蠟，水化。將已放入蒸餾水后的切片放入蘇木精(AR1180-1，博生德)水溶液中染色3 min，鹽酸乙醇分化液分化15 s，稍水洗，Scott返藍(lán)液(G1865，Solarbio)返藍(lán)15 s，流水沖洗，伊紅(AR11800-2，BOSTER)染色3 min，流水沖洗，脫水，透明，封片，鏡檢。

1.3.2 免疫組化 組織石蠟切片水化后使用檸檬酸緩沖液高壓加熱修復(fù)抗原。3%雙氧水室溫孵育10 min，以去除內(nèi)源性過氧化物酶封閉液。在玻片上滴加5%BSA，37°C封閉30 min。每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗：ZEB1（1∶200）、ZEB2（1∶500），放入濕盒中，4°C孵育過夜。之后滴加二抗工作液，37°C孵育30 min。DAB顯色5~10 min；蘇木精復(fù)染3 min，鹽酸酒精分化，返藍(lán)；自來水沖洗1 min，脫水、透明、封片、鏡檢。

1.4 結(jié)果判定 免疫組化結(jié)果判定指標(biāo)為細(xì)胞漿／細(xì)胞膜內(nèi)棕黃色顆粒狀著色即為陽(yáng)性。判定標(biāo)準(zhǔn)采用半定量評(píng)分法。免疫組化標(biāo)記結(jié)果結(jié)合細(xì)胞染色的百分比及染色強(qiáng)度進(jìn)行判定。染色強(qiáng)度：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞百分比：無陽(yáng)性細(xì)胞為0分，l%～為1分，10%～為2分，50%～為3分，75%～。為4分。2項(xiàng)評(píng)分乘積≤4為陰性，＞4分為陽(yáng)性。免疫組化結(jié)果由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)生通過雙盲法判定。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)均用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間采用卡方檢驗(yàn)，ZEB1、ZEB2與患者的臨床病理特征的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ZEB1、ZEB2蛋白在子宮腺肌癥中的表達(dá)情況ZEB1在子宮腺肌癥內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為74.29%（26/35）、30.00%（3/10）；ZEB2在子宮腺肌癥內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為22.86%（8/35）、20.00%（2/10）見圖1～2。ZEB1在子宮腺肌癥子宮內(nèi)膜中陽(yáng)性表達(dá)顯著高于正常子宮內(nèi)膜（P=0.027）；而ZEB2在子宮腺肌癥子宮內(nèi)膜中的陽(yáng)性表達(dá)與正常子宮內(nèi)膜相比沒有顯著差異（P=0.848）見表1～2。

2.2 ZEB1、ZEB2蛋白陽(yáng)性表達(dá)與子宮腺肌癥臨床特征的相關(guān)因素分析 子宮腺肌癥子宮內(nèi)膜組織中ZEB1、ZEB2的表達(dá)與患者的年齡、痛經(jīng)、月經(jīng)周期、孕次、產(chǎn)次、血清CA125水平均無明顯相關(guān)性（P＞0.05），見表3～4。

圖1 子宮腺肌癥和正常子宮內(nèi)膜組織HE染色（HE200×）

3 討論

圖2 ZE B1、ZE B2在子宮腺肌癥和正常子宮內(nèi)膜組織表達(dá)

表1 ZE B1在各組子宮內(nèi)膜中的表達(dá)情況

表2 ZE B2在各組子宮內(nèi)膜中的表達(dá)情況

表3 ZE B1在子宮腺肌癥子宮內(nèi)膜中表達(dá)的相關(guān)因素分析

表4 ZE B2在子宮腺肌癥子宮內(nèi)膜中表達(dá)的相關(guān)因素分析

子宮腺肌癥是一種常見的婦科疾病，其發(fā)病機(jī)制和病理生理學(xué)尚不清楚。有研究表明上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)可能在子宮腺肌癥的發(fā)展中起作用，導(dǎo)致子宮腺肌癥上皮細(xì)胞的侵襲傾向增加[7]。EMT的一個(gè)關(guān)鍵初始步驟是E-cadherin的下調(diào)，E-盒結(jié)合鋅指蛋白即ZEB蛋白，包括ZEB1和ZEB2，是EMT過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，參與EMT的調(diào)節(jié)過程，可以抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，從而促使EMT發(fā)生，最終使細(xì)胞獲得侵襲轉(zhuǎn)移能力[10-11]。ZEB1和ZEB2的結(jié)構(gòu)相近，但是分子功能卻不同，ZEB蛋白的表達(dá)在不同腫瘤中是不一樣的。ZEB蛋白在多種腫瘤中表達(dá)，俞楊[12]等研究發(fā)現(xiàn)表明ZEB1和ZEB2在乳腺癌中均高表達(dá)；Do?anlar[13]研究發(fā)現(xiàn)，ZEB1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中過度表達(dá)；Huo X[14]研究發(fā)現(xiàn)，ZEB2在食管癌中高表達(dá)；Moussa[15]等在膀胱癌中ZEB1和ZEB2均有表達(dá)。此外，張春云[16]等有研究表明，ZEB1和ZEB2在子宮內(nèi)膜異位癥患者中高表達(dá)。在本研究中，我們通過免疫組化方法檢測(cè)ZEB1、ZEB2在子宮腺肌癥子宮內(nèi)膜及正常子宮內(nèi)膜中的表達(dá)，結(jié)果顯示ZEB1在子宮腺肌癥子宮內(nèi)膜中陽(yáng)性表達(dá)高于正常子宮內(nèi)膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而ZEB2在子宮腺肌癥子宮內(nèi)膜中的陽(yáng)性表達(dá)高于正常子宮內(nèi)膜，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)EMT的生物學(xué)過程，主要有Wnt信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路、ILK信號(hào)通路等眾多信號(hào)通路。Oh[17]等報(bào)道β-catenin在子宮腺肌癥中表達(dá)水平升高，激活Wnt/β-Catenin信號(hào)通路，誘導(dǎo)ZEB1、Snail表達(dá)增加，抑制E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)子宮腺肌癥的進(jìn)展。這提示我們，ZEB1在子宮腺肌癥中高表達(dá)可能與EMT在子宮腺肌癥中的發(fā)生有關(guān)。子宮腺肌癥的發(fā)病率約為5%~70%，發(fā)病年齡呈年輕化趨勢(shì)[18]，目前臨床上診斷子宮腺肌癥的的方法很多，但并沒有良好的術(shù)前診斷方法，子宮腺肌癥的金標(biāo)準(zhǔn)為病理學(xué)檢查，為有創(chuàng)性檢查；核磁共振(MRI)術(shù)前診斷準(zhǔn)確率高，但價(jià)格昂貴，早期缺乏無創(chuàng)靈敏、準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)的診斷方法。CA125是一種腫瘤標(biāo)志物，常用于篩查卵巢癌，有研究表明CA125的水平與子宮內(nèi)膜的發(fā)育密切相關(guān)，血清CA125水平在子宮腺肌癥患者中顯著增高，是診斷子宮腺肌癥最常見的血清標(biāo)志物[19-20]。血清CA125在子宮腺肌癥中陽(yáng)性表達(dá)率高，對(duì)子宮腺肌癥診斷具有重要的價(jià)值，本研究納入的患者中CA125升高的患者占77.14%(27/35)，ZEB1在子宮腺肌癥中陽(yáng)性表達(dá)率為74.29%（26/35），由于血清CA125在多種婦科疾病中均有表達(dá)，特異性較差。在臨床上聯(lián)合檢測(cè)CA125和ZEB1水平，以兩者均陽(yáng)性為標(biāo)準(zhǔn)，是否可以提高子宮腺肌癥的準(zhǔn)確性，需后續(xù)的進(jìn)一步研究。本研究還分析了ZEB1、ZEB2在子宮腺肌癥患者中的表達(dá)水平與血清CA125水平的相關(guān)性，結(jié)果顯示ZEB1、ZEB2在子宮腺肌病患者中的表達(dá)水平與血清CA125水平無關(guān)。子宮腺肌癥最常見的癥狀是進(jìn)行性痛經(jīng)、異常子宮出血、月經(jīng)過多和慢性盆腔疼痛[1]，其中，痛經(jīng)是子宮腺肌癥患者主要的特征性癥狀，有文獻(xiàn)報(bào)道子宮腺肌癥痛經(jīng)發(fā)生率達(dá)64.8%~77.8%[21]，本研究中子宮腺肌癥患者痛經(jīng)的比率為57.14%（20/35），這可能與本研究樣本量少有關(guān)。此外我們還分析了ZEB1、ZEB2在子宮腺肌病患者中的表達(dá)水平與其臨床特征的相關(guān)性，結(jié)果顯示ZEB1、ZEB2在子宮腺肌病患者中的表達(dá)水平與患者的年齡、痛經(jīng)、月經(jīng)周期、孕次、產(chǎn)次和絕經(jīng)狀態(tài)無顯著相關(guān)性，這與王慧芳[22]等人的研究是一致的。

綜上所述，在本研究中，ZEB1在子宮腺肌癥子宮內(nèi)膜中陽(yáng)性表達(dá)顯著高于正常子宮內(nèi)膜，可能與EMT在子宮腺肌癥中的發(fā)生有關(guān)，為研究子宮腺肌癥的分子機(jī)制提供參考。