蔣琳，武媛，黃文泉，郭建徠，邵益森，王偉

（江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院口腔創(chuàng)傷整形科，南昌 330006）

舌鱗癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，近年來患病率呈升高趨勢，但目前臨床上缺乏行之有效的靶向治療手段，同時該病發(fā)生發(fā)展的分子機制未能深入闡述。

miRNA是一種長度在17-25 nt的單鏈非編碼RNA，它們廣泛存在于真核細胞中，能通過降解靶mRNA或抑制其翻譯等手段，來調(diào)節(jié)細胞增殖、分化與凋亡，參與個體發(fā)育、機體代謝以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程[1]。研究顯示miRNA既可作為原癌基因參與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程，又可作為抑癌基因參與惡性腫瘤的形成，其在腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡和機體發(fā)育、代謝等基本生命活動過程中發(fā)揮重要作用[2-3]，并可以作為腫瘤早期診斷和治療的生物標志物。

miR-492在多種腫瘤中均被發(fā)現(xiàn)表達異常，如宮頸癌、肝癌等。同時也有研究發(fā)現(xiàn)miR-492同腫瘤的化療耐藥有關(guān)。目前關(guān)于miR-492與舌鱗癌的相關(guān)研究未見報道。本研究擬探索miR-492在舌鱗癌組織中的表達及其同舌鱗癌患者臨床病理之間的關(guān)系，探討miR-492調(diào)控舌鱗癌增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的機制，以期為舌鱗癌的治療提供新的思路，尋找新的治療靶點。

1 材料和方法

1.1 臨床標本收集52例舌癌組織和24例癌旁組織（2 cm外舌體組織）標本均來自江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院口腔科，患者手術(shù)時間2014年7月-2020年7月?；颊邽槌醢l(fā)舌癌且全身檢查未發(fā)現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移，術(shù)前未行放化療及其他治療，手術(shù)方式均為舌頜頸聯(lián)合根治術(shù)。所有入選病例術(shù)后均得到組織病理確認。手術(shù)切除的標本立即放入液氮，在液氮中長期保存。

1.2 組織總RNA提取 組織樣本的提取采用RecoverAll總核酸提取試劑盒（Ambion，USA）提取腫瘤組織及正常組織總RNA，SmartSpec Plus分光光度計（Bio-Rad，USA）對總RNA進行定量。

1.3 cDNA合成與qRT-PCR取100 ng總RNA按操作說明書進行反轉(zhuǎn)錄cDNA，反應(yīng)程序：16℃30 min，42℃30 min，85℃5 min。按Taqman MicroRNA Assays（Applied Biosystems，USA）說明檢測成熟的miRNA，以miR-492和U6作模板，miR-492和U6熒光探針作引物擴增，反應(yīng)程序為：95℃45 s，95℃15 s，60℃15 s，45個循環(huán)，所有試驗重復3次。

1.4 構(gòu)建過表達和抑制表達舌鱗癌細胞系 該實驗選用舌鱗癌細胞株UM1，UM2細胞株，用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)UM1和UM2，置于37°C恒溫、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞鋪滿80%鏡下視野時用0.25%含EDTA胰酶消化傳代。所有細胞復蘇后常規(guī)傳代兩次，取生長狀態(tài)良好的細胞用于后續(xù)實驗。miR-492 mimics及LNA購買于上海吉瑪公司，按照siPORT TM NeoFX TM轉(zhuǎn)染試劑（Ambion USA）說明書轉(zhuǎn)染物進入舌鱗癌細胞系，miR-492 mimics和control mimics分別加入UM2細胞系，至終濃度45 nmol/L，24 h后，qRT-PCR檢測mi R-492的表達水平；miR-492 LNA和miR-492 LNA negative control組分別加入UM1細胞系，至終濃度45 nmol/L，24 h后，qRTPCR檢測miR-492的表達水平。

1.5 細胞增殖檢測 轉(zhuǎn)染細胞及對照舌鱗癌細胞鋪于96孔板，待細胞密度長至3×104/每孔加MTT溶液（5 mg/mL）20μL。繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，選擇570 nm波長，MTT法實驗重復3次。

1.6 細胞遷移檢測 待轉(zhuǎn)染細胞及對照舌鱗癌細胞生長至對數(shù)生長期時，消化離心后用無血清的培養(yǎng)基重懸細胞，將含有1×105個細胞懸液加入不含基質(zhì)膠的小室，小室下層置5%血清培養(yǎng)基，孵育24小時后，棉簽輕輕擦去小室內(nèi)未遷移的細胞，4%多聚甲醛固定10 min，DAPI染色10 min，單蒸水洗滌后風干，于倒置顯微鏡下觀察，拍照，每組細胞重復三次實驗。

1.7 細胞侵襲檢測 基質(zhì)膠孵育Transwell小室24小時后，實驗步驟同細胞轉(zhuǎn)移檢測實驗。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以（±s）表示，采用單因素方差分析比較多項指標。計量資料組間比較采用t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 mi R-492在癌旁正常組織及舌鱗癌組織中的表達情況qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，miR-492在舌鱗癌組織中表達高于正常組織，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖1。

圖1 癌旁正常組織及舌鱗癌組織中miR-492的表達情況（N:正常舌體組織，TSCC：舌鱗癌組織）

2.2 mi R-492的表達與舌鱗癌患者的臨床病理特征的關(guān)系miR-492的表達與T分期、臨床分期、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度均有相關(guān)性，差異具有統(tǒng)計學意義。見圖2。

2.3 miR-492在不同舌鱗癌細胞株中的表達 結(jié)果顯示：miR-492在舌鱗癌細胞（UM1，UM2）中表達高于正常細胞（HaCat），miR-492在UM1中表達較高，在UM2中表達較低。

圖2 miR-492的表達與舌鱗癌患者的臨床病理特征的關(guān)系（A）舌鱗狀細胞癌患者組織標本中T3+4的miR-492表達顯著高于T1+2；（B）舌鱗狀細胞癌患者組織標本中臨床分期CIII+IV的miR-492表達顯著高于臨床分期CI+II；（C）頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性舌鱗狀細胞癌患者的miR-492表達顯著高于頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性患者；（D）舌鱗狀細胞癌患者組織標本中病理分級為中低分化的miR-492表達顯著高于高分化病理分級。＊＊P＜0.05。

圖3 miR-492在不同舌鱗癌細胞株中的表達情況

2.4 沉默miR-492對舌鱗癌細胞體外增殖侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響 為探討舌鱗癌細胞沉默miR-492后對增殖，侵襲遷移能力的影響，我們采用mi R-492 LNA抑制UM1細胞mi R-492的表達，結(jié)果顯示：UM1經(jīng)miR-492 LNA處理后細胞的OD值較對照組明顯降低，說明細胞增殖能力減弱（P<0.05）（圖4A）；遷移實驗結(jié)果顯示：miR-492 LNA組穿膜細胞數(shù)目較對照組顯著下降，說明其遷移能力明顯受到抑制（P<0.05）（圖4B）；侵襲實驗結(jié)果顯示：miR-492 LNA組穿膜細胞數(shù)目較對照組顯著下降，說明其侵襲能力亦明顯受抑制（P<0.05）（圖4C）。

2.5 過表達mi R-492對舌鱗癌細胞體外增殖侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響 為進一步探討舌鱗癌細胞過表達miR-492后對增殖，侵襲遷移能力的影響，我們采用miR-492 mimics使UM2細胞中mi R-492的表達上調(diào)，結(jié)果顯示：UM2經(jīng)miR-492 mimics處理后細胞的OD值較對照組明顯升高，說明細胞增殖能力增強（P<0.05）（圖5A）；遷移實驗結(jié)果顯示：mi R-492 mimics組穿膜細胞數(shù)目較對照組顯著升高，說明其遷移能力明顯增強（P<0.05）（圖5B）；侵襲實驗結(jié)果顯示：miR-492 mimics組穿膜細胞數(shù)目較對照組顯著升高，說明其侵襲能力亦明顯增強（P<0.05）（圖5C）。

圖4 沉默miR-492對舌鱗癌細胞體外增殖侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響（A）舌鱗狀細胞株UM1經(jīng)miR-492 LNA處理后，與對照組相比，細胞的OD值下降，增殖能力減弱；（B）UM1細胞的遷移能力（C）和侵襲能力（D）明顯受到抑制。＊＊P＜0.05。

圖5 過表達miR-492對舌鱗癌細胞體外增殖侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響（A）舌鱗狀細胞株UM2經(jīng)miR-492 mimi cs處理后，與對照組相比，細胞的OD值升高，增殖能力增強；（B）UM1細胞的遷移能力（C）和侵襲能力（D）明顯增強。＊＊P＜0.05。

3 討論

miRNA是一類長度為17-25nt的單鏈非編碼RNA，通過與靶基因mRNA互補位點的結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達[4]。除了被人們所熟知的細胞質(zhì)miRNA之外，miRNA也存在于細胞的膜結(jié)合區(qū)如分泌性小泡[5-6]和線粒體[7-8]中。人類細胞中約1/3的蛋白編碼基因受到miRNA的調(diào)控。因此miRNA與它們的標靶分子組成了一個復雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，控制機體的重要生命活動。越來越多的研究表明，miRNA具有原癌基因或者抑癌基因的作用，在細胞的生長、增殖和凋亡過程中發(fā)揮著重要作用，其表達水平的異常與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

miR-492已經(jīng)在多種惡性腫瘤中被發(fā)現(xiàn)同腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)。有國外學者研究表明肝細胞癌中miR-492的表達在肝癌組織中表達升高，在正常組織中表達降低，而且通過mi R-492-PTEN-AKT途徑調(diào)控肝癌的進展[9]。段永恒等采用Affymetrix miRNA 4.0芯片篩查宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者發(fā)現(xiàn)，相對于未轉(zhuǎn)移患者，轉(zhuǎn)移患者中miR-658和miR-492上調(diào)最為顯著[10]。亦有學者報道，在一些腫瘤中miR-492的表達降低。在腎透明細胞癌中，miR-492的表達較正常組織低[11]。有研究發(fā)現(xiàn)在前列腺癌復發(fā)患者中miR-492的表達較原發(fā)前列腺癌患者的表達降低[12]。劉長征等學者指出，在肝內(nèi)及肝外膽管癌中，miR-492同其他5個miRNA的表達均降低[13]。與此同時，有學者的研究發(fā)現(xiàn)肝癌、肝臟良性腫瘤患者以及正常人血清中的miR-492的表達差異無統(tǒng)計學意義[13]。

盡管對于miR-492在不同腫瘤中的表達的研究結(jié)果各異，在機制方面仍然需進一步的研究。目前已經(jīng)有多篇文獻報道了miRNA與腫瘤化療耐藥的相關(guān)性。有學者探討了miR-492在結(jié)腸癌細胞LS174T奧沙利鉑耐藥中的作用，結(jié)果顯示：與LS174T細胞相比較，耐藥細胞中mi R-492表達減少，其可能通過調(diào)節(jié)CD147的表達調(diào)控結(jié)腸癌細胞的奧沙利鉑耐藥[14-15]。

舌鱗癌是頭頸鱗狀細胞癌中最常見的種類，因其具有較強的侵襲性且死亡率較高，因而從分子層面出發(fā)的治療手段相關(guān)的研究具有重要的臨床意義[16]。目前miR-492與舌鱗癌的相關(guān)行研究未見報道。本課題組的前期研究顯示miR-492在舌鱗癌組織中高表達，在正常舌體組織中低表達。

miRNA在腫瘤中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)較為復雜，本課題組的研究顯示miR-492的過表達可以促進舌鱗癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，而miR-492表達的抑制可以導致舌鱗癌細胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力的降低，提示miR-492參與到舌鱗癌細胞的生物學行為的調(diào)控。但是其中具體的機制尚且不明。

綜上所述，本研究顯示，miR-492具有促進舌鱗癌細胞發(fā)生發(fā)展的作用，下調(diào)表達能抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，反之，上調(diào)其表達能促進腫瘤細胞的相關(guān)生物學行為。miR-492是參與舌鱗癌生物學行為的靶點。