楊曉蕾, 李建宏*, 姚 拓, 陳建綱, 李 琦, 張建貴, 王國基

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室， 甘肅 蘭州 730070； 2.蘭州苗樂農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，甘肅 蘭州 730070)

農(nóng)用微生物菌劑(Microbial inoculants in agriculture)是指將有益微生物進行工業(yè)化生產(chǎn)擴繁后制得的一類活菌制劑[1]。其產(chǎn)品按微生物功能可分為根瘤菌劑、固氮菌劑、解磷菌劑、促生菌劑、硅酸鹽菌劑、菌根菌劑、光合菌劑、有機物料腐熟劑和生物修復(fù)菌劑9種類型[2]。其中促生菌劑，又稱根際促生菌劑(Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)可以促進植物生長發(fā)育，抑制土壤病原菌生長，還能直接或間接地改良土壤，恢復(fù)土地肥力[3]，近年來已成為農(nóng)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點[4-5]。由于不同微生物促生特性不同，使用單一菌株制成的微生物菌劑很難發(fā)揮理想的促生效果，利用兩種或兩種以上且互不拮抗的微生物菌種制成復(fù)合促生菌劑，功能多樣，促生效果更強[6]。有關(guān)促生菌劑在飼草上的應(yīng)用研究較多，但對促生菌劑發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件以及發(fā)酵菌劑對飼草生長的影響研究較少。

菌劑接種量是影響PGPR在植物根部定殖的主要影響因素之一，為確保促生菌劑發(fā)酵液質(zhì)量與效果，適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件尤為重要[7]。碳源為微生物生長提供碳素營養(yǎng)物質(zhì)[8]，發(fā)酵用碳源主要有葡萄糖、淀粉、蔗糖、甘油等[9]。氮源在微生物生長過程中常參與合成代謝物質(zhì)，同時構(gòu)成多種含氮有機物，還可以補充碳源[10]。無機鹽物質(zhì)能提高微生物生理活性，為微生物提供多種金屬離子。同時，適宜的培養(yǎng)條件可以提高菌株繁殖速率，常見的培養(yǎng)條件包括初始pH、溫度、接種量、發(fā)酵時間、溶氧量等因素[11]。發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH影響細(xì)胞膜通透性及膜電荷狀態(tài)，適宜的pH范圍會使得菌體生長量提高[12]；接種量影響發(fā)酵過程溶氧量及培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)消耗，接種量過高會造成菌體生長過快[13-14]；裝液量和轉(zhuǎn)速影響微生物生長過程中的溶氧量，轉(zhuǎn)速越高，裝液量越少，發(fā)酵液中溶氧濃度越高[15]。

青稞(Hordeumvulgarevar.Nudum)即裸大麥，是我國青藏高原及西北高寒地區(qū)主要的飼草作物。本研究利用課題組前期分離自高寒草地的優(yōu)良植物根際促生菌株Y1(Bacillusmycoides),Y3(Bacillussubtilis)，M1(Pseudomonassynxantha)為研究對象，構(gòu)建復(fù)合促生菌劑發(fā)酵體系，在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面優(yōu)化試驗，優(yōu)化根際促生菌劑發(fā)酵培養(yǎng)基，確定適宜的培養(yǎng)條件，通過盆栽試驗評價優(yōu)化后菌劑的促生效果，以期為復(fù)合促生菌劑在高寒草地的大規(guī)模施用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試菌株 供試菌株由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院草地微生物多樣性實驗室提供(表1)。菌株由實驗室前期從草地植物根際分離篩選而出，具有較強的促生能力和溫度耐受性。

表1 供試菌株Table 1 Strains for test

1.1.2供試培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基(g·L-1)：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉5 g，pH=7.0，121℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉5 g，pH=7.0，121℃滅菌30 min。

甘油、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、玉米漿、豆粕、魚粉和黃豆餅粉購自北京索萊寶科技有限公司，酵母粉和蛋白胨購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司，硫酸銨、碳酸鈣、硝酸銨、硫酸鎂、磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1菌劑配方及種子液培養(yǎng) 試驗過程中所用菌劑配方均為Y1∶Y3∶M1=1∶1∶1，將活化菌液以2%接種量移種于50 mL種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h，即得到種子培養(yǎng)液。

1.3.2發(fā)酵培養(yǎng)基組成單因素篩選 分別以1%的甘油、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉替代發(fā)酵培養(yǎng)基碳源；1.5%的玉米漿、豆粕、魚粉、黃豆餅粉、酵母粉、蛋白胨替代發(fā)酵培養(yǎng)基氮源；0.5%的硫酸銨、碳酸鈣、硝酸銨、硫酸鎂、磷酸氫二鉀+磷酸二氫鉀(1∶1)替代發(fā)酵培養(yǎng)基無機鹽[14-15]，以O(shè)D600值為評價指標(biāo)，培養(yǎng)條件為溫度31℃，初始pH=6.0，接種量2%，搖床轉(zhuǎn)速180 r·min-1，裝液量30 mL(每150 mL三角瓶)，培養(yǎng)時間48 h。

1.3.3混合菌系高密度發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化響應(yīng)面試驗 根據(jù)單因素優(yōu)化結(jié)果，運用Design-Expert 8.0 軟件，選擇甘油(A)、蛋白胨(B)、酵母粉(C)、碳酸鈣(D)四個因素，各因素取3個水平(—1，0，1)，設(shè)計四因素三水平[L9(34)]正交試驗，各處理3次重復(fù)，因素水平表見表2。

表2 混合菌系高密度發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化Box-Behnken試驗因素與水平Table 2 Optimization of Box-Behnken test factors and levels of mixed strains of high-density fermentation medium

1.3.4最佳培養(yǎng)條件的優(yōu)化 以優(yōu)化后的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別設(shè)置初始pH(4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10.0)；接種量(2%，4%，6%，8%，10%，12%，14%，16%，18%，20%)；搖床轉(zhuǎn)速(140，160，180，200，220，240，260 r·min-1)；裝液量[(20 mL，30 mL，40 mL，50 mL，60 mL)每150 mL三角瓶][16]，培養(yǎng)溫度31℃，培養(yǎng)時間48 h，測定OD600值，每處理3次重復(fù)。確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件后，參考國標(biāo)GB 20287-2006《農(nóng)用微生物菌劑》[1]，每個處理6次重復(fù)，對發(fā)酵條件優(yōu)化后的菌劑進行活菌數(shù)計數(shù)。

1.4 復(fù)合根際促生菌劑的促生效應(yīng)評價

選用顆粒飽滿且大小一致的青稞種子，用1%的次氯酸鈉消毒10 min后，無菌水清洗3次，種植于裝有200 g花土的塑料花盆中(規(guī)格：外徑11.5 cm×內(nèi)徑8.5 cm×高12.0 cm)，每杯種植青稞15株。以無菌水為對照組(CK)，發(fā)酵條件優(yōu)化前后生產(chǎn)的菌液為處理，每個處理4次重復(fù)。7 d出苗后以相同接種量灌根，每盆12 mL。以第一次灌根為起始時間，待植物生長45 d后收獲，測定幼苗的株高、鮮重、葉綠素及根系形態(tài)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel，Design-Expert軟件進行數(shù)據(jù)整理和作圖，SPSS 25.0進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基碳源、氮源、無機鹽的確定

2.1.1碳源 碳源作為微生物生長重要營養(yǎng)物質(zhì)，為微生物提供生長、繁殖、代謝和其他生理活動的基礎(chǔ)能量，常為各種常見細(xì)胞代謝產(chǎn)物中碳骨架的主要來源。碳源優(yōu)化結(jié)果見圖1。綜合分析結(jié)果表明，混合菌系對甘油的利用效果最好，顯著高于其他碳源(P<0.05)，葡萄糖次之，可溶性淀粉最差，因此甘油為發(fā)酵培養(yǎng)基最佳碳源。

圖1 碳源物質(zhì)對復(fù)合菌系生長的影響Fig.1 Effects of carbon source material on strains growth注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同Note：Different letters indicate significant difference at the 0.05 level,the same as below

2.1.2氮源 氮元素是構(gòu)成微生物細(xì)胞的基本元素，微生物能夠利用氮源合成蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸等關(guān)鍵物質(zhì)。氮源優(yōu)化結(jié)果見圖2。綜合分析結(jié)果表明，混合菌系對蛋白胨+酵母粉配合的利用效果最好，豆粕粉不利于混合菌系的生長，因此復(fù)合氮源蛋白胨+酵母粉為發(fā)酵培養(yǎng)基最佳氮源。

圖2 氮源物質(zhì)對復(fù)合菌系生長的影響Fig.2 Effects of nitrogen sources material on strains growth

2.1.3無機鹽 無機鹽在微生物的生命活動中起到調(diào)節(jié)生物酶活、調(diào)節(jié)滲透壓平衡、維持細(xì)胞膜內(nèi)外物質(zhì)交換、調(diào)節(jié)pH等作用。無機鹽優(yōu)化結(jié)果見圖3。綜合分析結(jié)果表明，混合菌系對碳酸鈣的利用效果最好，因此選擇碳酸鈣為發(fā)酵培養(yǎng)基無機鹽。

圖3 無機鹽對復(fù)合菌系生長的影響Fig.3 Effects of inorganic salt on strains growth

2.2 復(fù)合菌劑發(fā)酵培養(yǎng)基響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.2.1響應(yīng)面模型構(gòu)建及方差分析 基于Box-Benhnken中心組合設(shè)計響應(yīng)面試驗，選擇OD600的4個影響因素：甘油(A)、蛋白胨(B)、酵母粉(C)、碳酸鈣(D)進行4因素3水平響應(yīng)面分析試驗，試驗設(shè)計結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken test

表4 響應(yīng)面二次模型方差分析Table 4 Analysis of variance (ANOVA) for response surface second-order polynomial equation

利用Design-Expert 10.0.3軟件對數(shù)據(jù)進行分析，得到二次多項回歸方程：Y=4.367+0.289A—0.001B+0.101C+0.02D—0.323AB—0.062AC—0.005AD—0.014BC—0.133BD+0.106CD—0.346A2—0.42B2—0.43C2—0.359D2。

該模型回歸極顯著(P<0.0001)，失擬值P=0.0589>0.05，不顯著；模型的決定系數(shù)R2=0.9758，調(diào)整決定系數(shù)AdjR2=0.9515，表明該方程擬合度高，可以很好地預(yù)測混菌發(fā)酵體系的最適發(fā)酵條件。根據(jù)F值可知，4個因素對OD600影響大小順序為：甘油(A)>酵母粉(C)>碳酸鈣(D)>蛋白胨(B)。同時，一次項A,C，交互項AB，BD及二次項A2，B2，C2，D2對結(jié)果影響極顯著(P<0.01)，交互項CD對結(jié)果影響顯著(P<0.05)，其他項對結(jié)果影響不顯著。

2.2.2最優(yōu)條件參數(shù)確定及模型驗證 運用Design-Expert 10.0.3軟件運行優(yōu)化分析，由圖4各因素交互作用響應(yīng)面圖分析，最終確定最優(yōu)提取工藝為：甘油12.920 mL·L-1、蛋白胨9.023 g·L-1、酵母粉5.042 g·L-1、碳酸鈣5.093 g·L-1，在此條件下模型預(yù)測的OD600為4.443。結(jié)合實際工藝設(shè)置的可行性，取甘油13 mL·L-1、蛋白胨9 g·L-1、酵母粉5 g·L-1、碳酸鈣5 g·L-1為條件進行三次重復(fù)試驗，平均OD600為4.328，與模型預(yù)測值偏差2.58%，表明基于該響應(yīng)面模型分析優(yōu)化OD600提取工藝的方法有效可行。

圖4 甘油、酵母粉、碳酸鈣、蛋白胨交互作用對復(fù)合菌劑OD600值的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface diagram of the interaction of glycerol,yeast extract,CaCO3,and peptone on the OD600value of microbial agents

2.3 最佳培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.3.1初始pH的確定 如圖5-a所示，隨著初始pH值的改變，菌株生長速率不斷變化。pH<5.0或>9.5時，混合菌系生長緩慢；pH在6.5～7.5時，混合菌系OD600值較高，在pH=7.0時達到最大，為3.238。綜上，混合菌系最適初始pH為7.0。

2.3.2接種量的確定 由圖5-b可知，混合菌系在接種量為2%～10%時，隨著接種量的增加，混合菌系菌體的OD600值升高；當(dāng)接種量為10%時，OD600值最高，為3.037；接種量大于10%后，隨著接種量的增加，菌體OD600值下降。綜上，混合菌系最佳接種量為10%。

2.3.3搖床轉(zhuǎn)速的確定 由圖5-c可知，混合菌系發(fā)酵液OD600值隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加而增大，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為220 r·min-1時，菌體的OD600值最大，為3.711。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速大于220 r·min-1時，發(fā)酵液的OD600值趨于平緩。結(jié)合實際生產(chǎn)情況，確定最佳搖床轉(zhuǎn)速為220 r·min-1。

2.3.4裝液量的確定 由圖5-d可知，在混合菌系發(fā)酵過程中，采用30 mL的裝液量時，菌體OD600值最大，為3.620；隨著裝液量的增大，菌體OD600值呈下降趨勢。綜上，混合菌系的最佳裝液量為30 mL。

圖5 復(fù)合菌劑最佳培養(yǎng)條件優(yōu)化Fig.5 Optimum cultivation conditions of microbial agents

2.3.5最優(yōu)配方活菌數(shù)計數(shù) 以優(yōu)化后的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件為處理，初始培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件為對照，進行活菌數(shù)計數(shù)，優(yōu)化后混合菌系的活菌數(shù)平均為4.6×1013cfu·mL-1，優(yōu)化前平均為3.1×1011cfu·mL-1，混合菌系活菌數(shù)是配方優(yōu)化前活菌數(shù)的148.39倍。

2.4 盆栽促生效應(yīng)驗證

盆栽試驗結(jié)果表明，與原始發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件相比，經(jīng)優(yōu)化后的混菌發(fā)酵菌液處理植株后，青稞的株高、鮮重、葉綠素、總根長、根表面積和根體積均顯著高于對照組及原始配方(P<0.05)，較原始配方分別提高了13.05%,22.83%,47.74%,73.21%,93.09%和161.54%。

表5 發(fā)酵條件優(yōu)化前后菌劑對青稞生長的影響Table 5 Effect of microbial agents on the growth of barley before and after optimization of fermentation conditions

3 討論與結(jié)論

針對不同來源的促生菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化，是促生菌劑推廣應(yīng)用的前提和基礎(chǔ)。有研究表明，促生菌劑初始接種量是影響促生菌在植物根際定殖的重要因素[17]。菌劑的菌體量受培養(yǎng)基成分[18]如碳源、氮源和無機鹽的影響，適宜的培養(yǎng)條件(包括初始pH、溫度、接種量、發(fā)酵時間、溶氧量等因素)可以有效提高菌株繁殖速率[19-20]。本研究以前期從高寒草地植物根際分離的3株P(guān)GPR菌株為基礎(chǔ)，構(gòu)建復(fù)合菌系，通過單因素試驗及響應(yīng)面法Box-Behnken試驗設(shè)計，優(yōu)化復(fù)合菌系發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，確定復(fù)合根際促生菌劑發(fā)酵培養(yǎng)基為：甘油13.0 mL·L-1、蛋白胨9.0 g·L-1、酵母粉5.0 g·L-1、碳酸鈣5.0 g·L-1。通過單因素試驗優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)條件為：pH=7.0、裝液量30 mL(每150 mL三角瓶)、接種量10%、搖床轉(zhuǎn)速220 r·min-1。此條件下培養(yǎng)48 h后菌劑活菌數(shù)達4.6×1013cfu·mL-1，較優(yōu)化前活菌數(shù)提高148.39倍。李偉[21]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)抗菌肽的枯草芽孢桿菌在復(fù)合氮源成分為尿素、玉米漿和(NH4)2SO4的發(fā)酵培養(yǎng)基中抗菌肽產(chǎn)量達620.2 mg·L-1。劉芳[22]確定枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)BZJN1最適培養(yǎng)基為玉米粉2.5%、魚粉2.5%、蛋白胨1.5%、玉米漿0.5%、碳酸鈣0.1%、硫酸鎂0.03%、磷酸二氫鉀0.001%，培養(yǎng)條件為初始pH=7.0、溫度30℃、接種量4%、轉(zhuǎn)速220 r·min-1。朱海云[23]通過單因素和正交試驗確定了蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)MA23的最適發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，優(yōu)化后的菌體量分別提高了41.0%和28.2%。許睿娉[24]優(yōu)化得到枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)HG-15的培養(yǎng)基配方為葡萄糖4.5 g、酵母粉46.5 g,(NH4)2SO40.4 g,NaCl 10.0 g,MgSO40.8 g,MnSO40.2 g,KH2PO40.3 g,水1 000 mL，發(fā)酵條件為接種量10%、裝液量50 mL(每250 mL三角瓶)、溫度28℃、搖床轉(zhuǎn)速200 r·min-1，發(fā)酵液菌體數(shù)量達4.167×109cfu·mL-1。上述研究與本試驗所得最適發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件略有不同，可能是由于微生物菌株的來源及分類學(xué)地位的不同，導(dǎo)致菌株最適發(fā)酵條件也不同。針對菌株來源及應(yīng)用范圍的不同，優(yōu)化微生物菌劑的發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，對提高菌體生長量具有一定研究價值。同時，本研究所得發(fā)酵條件下發(fā)酵液活菌數(shù)達13個數(shù)量級，菌體量較高，表明利用相互無拮抗的菌株構(gòu)建復(fù)合菌系，制備的促生菌劑具有較高的活菌數(shù)，結(jié)果與周靜[25]的研究結(jié)論一致。本研究中供試菌株為芽孢桿菌屬和假單胞菌屬，二者均為好氧型微生物，繁殖能力較強，后續(xù)研究建議關(guān)注發(fā)酵過程中溶氧相關(guān)指標(biāo)變化。利用發(fā)酵培養(yǎng)基進行菌劑生產(chǎn)時，需考慮原料價格，應(yīng)選用質(zhì)量穩(wěn)定且價格較為便宜的原材料。本研究中所用培養(yǎng)基均為實驗室分析級，其成本較工業(yè)用料較高，后期將結(jié)合生產(chǎn)實際進一步研究。

盆栽試驗表明，發(fā)酵條件優(yōu)化前后的復(fù)合促生菌劑對青稞均有促生作用，與優(yōu)化前發(fā)酵液相比，優(yōu)化后的菌劑使青稞的株高、鮮重、葉綠素含量、總根長、根表面積及根體積分別提高了13.05%,22.83%,47.74%,73.21%,93.09%和161.54%，效果顯著，這與周靜[25]對優(yōu)化后發(fā)酵液對辣椒的促生試驗結(jié)果相似。表明復(fù)合菌系在發(fā)酵條件優(yōu)化后，其促生效果有所提升，其原因有待進一步研究。