郭 亮，賈明選，商玉立

(1.河南科技大學附屬黃河三門峽醫(yī)院心胸外科，河南 三門峽 472000；2.河南省胸科醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河南 鄭州 450000)

肺癌是目前發(fā)病率及病死率增長最快的惡性腫瘤[1]，其主要治療方式是手術(shù)切除與術(shù)后放化療結(jié)合，但對于中晚期患者并不適用，且大部分經(jīng)根治性切除術(shù)治療的患者5年復發(fā)率仍>30%[2]。研究顯示，侵襲及轉(zhuǎn)移是肺癌的特征及惡性標志，也是導致患者死亡的主要原因[3]。因此，深入研究肺癌發(fā)病機制，探尋侵襲對應(yīng)靶點，是提升肺癌療效的新方向。低氧微環(huán)境是肺癌發(fā)展過程中必然經(jīng)歷的環(huán)境之一，肺癌細胞通過激活一系列信號通路調(diào)控對應(yīng)基因表達，在適應(yīng)低氧的同時自身增殖、侵襲能力也得以增強，在該過程中缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)具有中樞紐帶作用[4]。HIF-1α屬異源二聚體DNA結(jié)合蛋白，在缺氧時可激活多種應(yīng)激蛋白表達，參與缺氧應(yīng)激、血管生成、細胞行為等調(diào)控過程，通常被認為是機體自我保護的啟動因子與共同途徑[5]。目前已有研究證實HIF-1α異常高表達于肝癌、口腔癌等惡性腫瘤中，且參與細胞增殖、侵襲等的調(diào)控，但關(guān)于其在肺癌細胞中的表達及作用研究尚少[6，7]。本研究于2020年1～6月通過建立低表達及過表達HIF-1α的肺癌A549細胞株，研究其對該細胞系增殖及侵襲的影響，并探討相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞系 人肺癌A549細胞株，購自武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司，培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。

1.1.2藥物、主要試劑和儀器 攜帶綠色熒光蛋白的慢病毒載體HIF-1α低表達質(zhì)粒(HIF-1α-siRNA)、HIF-1α過表達質(zhì)粒(HIF-1α-pLentiGFP)、對照質(zhì)粒pLentiGFP(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，LipofectamineTM3000試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，Trizol試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)SYBR II試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(美國Pierce公司)，兔抗人HIF-1α、趨化因子受體(Cys-X-Cys receptor 4，CXCR4)、上皮型鈣黏附蛋白(E-cadherin)一抗，山羊抗兔IgG二抗(美國abcam公司)，二甲基噻唑(MTT)溶液、二甲基亞砜(DMSO)溶液(美國APExBIO公司)。StepOne Puls qRT-PCR儀(美國ABI公司)，680酶標儀(美國Bio-Rad公司)，Transwell小室(上海夏夷實業(yè)有限公司)，Synergy-HD顯微鏡(日本Toshiba公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞缺氧處理 取A549細胞傳代培養(yǎng)，細胞鋪滿瓶底80%左右時，轉(zhuǎn)移至5% CO2、1% O2、94% N2缺氧培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)，用于模擬腫瘤內(nèi)部低氧微環(huán)境，設(shè)置為缺氧處理組，取正常培養(yǎng)的A549細胞設(shè)為正常組。

1.2.2qRT-PCR、Western blot檢測HIF-1α表達 取正常組、缺氧處理組細胞。PBS洗滌，Trizol試劑盒提取總RNA，經(jīng)濃度及純度測定后反轉(zhuǎn)錄得cDNA，定量后根據(jù)qRT-PCR SYBR Green試劑盒說明書進行反應(yīng)體系的設(shè)定：SYBR Premix Ex Taq II 11.5 μl，10.0 μmol/L上、下游引物各1.0 μl，DNA模板2.5 μl，加入dd H2O至總體積25.0 μl。反應(yīng)條件：93 ℃預變性6 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸25 s，42個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，2-△△CT為目的基因相對表達強度，實驗所用引物：HIF-1α：上游引物：5’-CGTACGTGCACGCTACGTGCACGC-3’；下游引物：5’-CGTAGCGGTGCCGCATGCCGTGAC-3’；GAPDH：上游引物：5’-TGACGCGCTGCACGCTACGTGCAC-3’；下游引物：5’-GTGCAGCAGCTGCACGCTGCACGC-3’。

取正常組、缺氧處理組細胞。PBS洗滌，RIPA裂解液冰上裂解，BCA試劑盒定量、配平蛋白。取50 μg樣本與等體積SDS-PAGE laoding buffer混合，100 ℃煮5 min。10 000 r/min離心半徑8 cm離心15 min，取上清，恒定電壓下電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜持續(xù)2 h，搖床清洗10 min，5%脫脂牛奶常溫孵育1 h。加入1∶1 000兔抗人HIF-1α一抗，4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗滌，加入1∶8 000山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育2 h，TBST洗滌，暗室中曝光、顯影，凝膠成像系統(tǒng)分析灰度值，以HIF-1α條帶灰度值/GAPDH灰度值表示蛋白相對表達量。

1.2.3細胞轉(zhuǎn)染 取缺氧處理對數(shù)期A549細胞，PBS洗滌，調(diào)整細胞密度至1×105個/毫升，重新接種至6孔板，待細胞再次融合至70%左右，根據(jù)LipofectamineTM3000試劑盒說明書設(shè)計實驗步驟，將HIF-1α-siRNA、HIF-1α-pLentiGFP、對照質(zhì)粒pLentiGFP轉(zhuǎn)染至A549細胞，分別設(shè)為低表達組、高表達組、對照組，取不作處理的細胞設(shè)為空白組。每組設(shè)置5個復孔。熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。發(fā)出明亮的綠色熒光者為陽性細胞，轉(zhuǎn)染效率(%)=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。轉(zhuǎn)染48 h后取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.4qRT-PCR、Western blot檢測HIF-1α表達 取空白組、對照組、低表達組、高表達組細胞。操作同1.2.2，檢測HIF-1α mRNA、蛋白相對表達量。

1.2.5MTT實驗檢測增殖能力 取空白組、對照組、低表達組、高表達組細胞。PBS洗滌，調(diào)整細胞密度至1×105個/ml，重新接種至6孔板，分別于孵育24、48、72 h時，加入新制備MTT溶液(0.5%，20 μl/孔)，靜置4 h，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌后，加入DMSO溶液(150 μl/孔)，震蕩15 min使結(jié)晶充分溶解，靜置2 h，取上清，酶標儀測定490 nm波長處吸光度A值。重復3次取平均值。

1.2.6Transwell小室實驗檢測侵襲能力 取空白組、對照組、低表達組、高表達組細胞。PBS稀釋Matrigel膠至1 mg/ml，預先鋪設(shè)于Transwell小室(50 μl/孔)，各組細胞按照5.0×105個/ml接種于上室，下室加入500 μl RPMI培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，常規(guī)培養(yǎng)至Matrigel被完全降解，取出杯底濾膜，PBS洗滌，0.25%戊二醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，無菌棉簽擦去上層細胞，洗滌、晾干后顯微鏡下觀察，隨機選取5個視野，計算穿膜細胞數(shù)/視野。重復3次取平均值。

1.2.7Western blot檢測CXCR4、E-cadherin蛋白表達 取空白組、對照組、低表達組、高表達組細胞。同1.2.2洗滌、裂解、定量、變性、電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育。加入1∶1000兔抗人CXCR4、E-cadherin一抗，加入1∶8000山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育2 h，TBST洗滌，暗室中曝光、顯影，凝膠成像系統(tǒng)分析灰度值，以CXCR4、E-cadherin條帶灰度值/GAPDH灰度值表示蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用方差分析檢驗多樣本計量資料，若Levene檢驗方差齊，采用單因素方差分析進行總均值比較，然后LSD-t行兩兩比較，若Levene檢驗方差不齊，采用welch檢驗進行總體均值比較，采用Dunnett T3檢驗進行兩兩比較。P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 正常組、缺氧處理組HIF-1α表達缺氧處理組HIF-1α mRNA、蛋白相對表達量高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 各組HIF-1α mRNA、蛋白表達(n=5)

圖1 Western blot檢測各組HIF-1α蛋白表達

2.2 轉(zhuǎn)染效率觀察熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，對照組、低表達組、高表達組轉(zhuǎn)染效率均>75%，可用于后續(xù)實驗。見圖2。

2.3 轉(zhuǎn)染后各組HIF-1α表達情況空白組、對照組HIF-1α mRNA、蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與空白組、對照組比較，低表達組HIF-1α mRNA、蛋白相對表達量降低，高表達組升高(P<0.05)；見表2、圖3。

2.4 各組增殖能力比較空白組、對照組24、48、72 h MTT實驗A值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與空白組、對照組比較，低表達組24、48、72 h MTT實驗A值降低，高表達組升高(P<0.05)。見表3。

圖2 熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率(×200)

表2 轉(zhuǎn)染后各組HIF-1α mRNA、蛋白表達比較(n=5)

圖3 Western blot檢測各組HIF-1α蛋白表達

表3 各組不同時間點MTT實驗A值比較(n=5)

2.5 各組侵襲能力比較空白組、對照組、低表達組、高表達組穿膜細胞數(shù)/視野分別(72.40±9.26)、(73.00±10.12)、(31.20±4.91)、(185.60±20.10)個，組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=142.731，P<0.001)；與空白組、對照組比較，低表達組穿膜細胞數(shù)/視野減少(t=8.790；t=8.310，P<0.001)，高表達組增加(t=11.438；t=11.188，P<0.001)；空白組、對照組穿膜細胞數(shù)/視野比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖4。

2.6 各組CXCR4、E-cadherin蛋白相對表達量比較CXCR4、E-cadherin蛋白相對表達量組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與空白組、對照組比較，低表達組CXCR4蛋白相對表達量降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白相對表達量升高(P<0.05)，高表達組CXCR4蛋白相對表達量升高(P<0.05)，E-cadherin蛋白相對表達量降低(P<0.05)；空白組、對照組CXCR4、E-cadherin蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4、圖5。

圖4 Transwell小室實驗穿膜細胞數(shù) a.空白組；b.對照組；c.低表達組；d.高表達組(×400)

表4 各組CXCR4、E-cadherin蛋白相對表達量比較(n=5)

圖5 Western blot檢測各組CXCR4、E-cadherin蛋白表達

3 討論

肺癌的發(fā)生是多時間點且多變化性的進展過程，研究顯示其是由多個個性化基因或基因組驅(qū)動的腫瘤疾病，抑癌基因通路失活、促癌基因通路激活貫穿于肺癌整個進展過程[8]。隨著新型腫瘤生物標志物及靶向藥物在臨床中的應(yīng)用，肺癌治療效果得以提升，但進一步探尋新的治療靶點，并開發(fā)對應(yīng)藥物改善其預后仍是當務(wù)之急。多數(shù)實體腫瘤如肺癌中均存在明顯的低氧區(qū)域，而腫瘤細胞在低氧微環(huán)境中仍可持續(xù)增殖并發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移，HIF-1α發(fā)揮關(guān)鍵性作用[9，10]。本研究發(fā)現(xiàn)，肺癌細胞經(jīng)低氧處理后，HIF-1α表達明顯升高，暗示其有作為分子靶點用于肺癌治療的潛能。

增生失控是惡性腫瘤主要的生長特征之一，而腫瘤組織增生過快將導致局部組織嚴重缺氧及代謝紊亂。HIF-1α是細胞在缺氧環(huán)境下進行適應(yīng)性調(diào)節(jié)的關(guān)鍵性因子，在調(diào)節(jié)腫瘤細胞代謝、血管新生、增殖、侵襲、放化療耐受中具有重要作用。目前乳腺癌、腎癌、食管鱗狀細胞癌等多種惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)HIF-1α高表達，且其水平可顯著影響預后效果[11～13]。朱月琴等[14]認為，HIF-1α與胃癌進程關(guān)系密切，且與TNM分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)。Wang等[15]發(fā)現(xiàn)，非小細胞肺癌中HIF-1α被激活后，可誘導細胞生長及血管生成，促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。本研究結(jié)果中，與空白組、對照組比較，低表達組24、48、72 h MTT實驗A值降低，穿膜細胞數(shù)/視野減少，高表達組均表現(xiàn)為相反趨勢，提示HIF-1α低表達可抑制肺癌細胞增殖及侵襲，高表達則起到促進增殖及侵襲的作用。

CXCR4屬7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，是普遍存在于腫瘤細胞中的趨化因子受體，其作為HIF-1α下游效應(yīng)基因之一，在腫瘤低氧環(huán)境中可被激活，且與腫瘤細胞增殖、侵襲能力具有相關(guān)性[16]。Tan等[17]開展的體內(nèi)異種移植實驗表明，CXCR4通過介導間充質(zhì)干細胞分化為癌相關(guān)成纖維細胞，促進結(jié)直腸癌細胞生長及轉(zhuǎn)移，在腫瘤微環(huán)境轉(zhuǎn)化中起著至關(guān)重要的作用。Guo等[18]研究顯示，采用藥物干預下調(diào)CXCR4表達，可顯著抑制人肝癌細胞的遷移和侵襲能力。惡性腫瘤細胞突破基底膜發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的過程復雜，上皮細胞失去極性，與周圍細胞及基質(zhì)的黏附率降低，細胞黏附力降低，侵襲及運動能力增強。E-cadherin是重要的細胞間黏附分子，與腫瘤黏附能力關(guān)系密切。本研究結(jié)果顯示，與空白組、對照組比較，低表達組CXCR4蛋白相對表達量降低，E-cadherin蛋白相對表達量升高，高表達組則表現(xiàn)為相反趨勢，提示HIF-1α低表達對肺癌細胞增殖、侵襲能力的影響可能通過調(diào)節(jié)CXCR4、E-cadherin蛋白表達實現(xiàn)。

綜上所述，HIF-1α低表達可降低肺癌A549細胞增殖及侵襲能力，推測其作用機制與下調(diào)CXCR4，上調(diào)E-cadherin蛋白表達有關(guān)。