李肖莉，宋 程，賈 彬，劉 麗，歐金梅，韓邦興1，**

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥230038；2.皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，安徽六安237012；3.安徽省中藥資源保護(hù)與持續(xù)利用工程實(shí)驗(yàn)室，安徽六安237012）

傘形科植物白花前胡（Peucedanumpraerupto?rumDunn）的干燥根是中國(guó)藥典規(guī)定的中藥前胡的唯一來源。前胡味苦、辛，性微寒，具有降氣化痰、散風(fēng)清熱的功效，多用于治療痰熱喘滿、咯痰黃稠、風(fēng)熱咳嗽痰多等癥［1］。白花前胡資源豐富，主要分布于浙江、江西、福建、安徽、貴州等地，生長(zhǎng)于山坡林緣，路旁或半陰性的山坡草叢中。目前研究認(rèn)為前胡主要含香豆素類化合物［2-4］，特征性成分為角型二氫呋喃香豆素類化合物，白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡素E是前胡中主要的3種香豆素類成分。現(xiàn)代藥理研究表明，白花前胡乙素具有抗腫瘤作用，白花前胡素E能擴(kuò)張血管，降低血壓［5-6］。近年來，隨著市場(chǎng)需求的增大，野生資源日漸枯竭，已難以滿足市場(chǎng)的需要。在傳統(tǒng)種植過程中，第一年播種出苗后進(jìn)入營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，根部肉質(zhì)肥厚，當(dāng)年秋、冬季節(jié)采挖，可做藥材。早期抽薹嚴(yán)重影響中藥材次生代謝產(chǎn)物的積累，對(duì)白花前胡藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量都有很大程度的影響［7］。目前，關(guān)于傘形科植物抽薹后不能藥用的調(diào)控機(jī)制尚不明確，一種可能原因是處于生殖生長(zhǎng)時(shí)期的白花前胡體內(nèi)大量的營(yíng)養(yǎng)成分用于抽薹，根部得不到充足的營(yíng)養(yǎng)而無法進(jìn)行正常代謝活動(dòng)，導(dǎo)致次生木質(zhì)部面積的增加，香豆素類含量降低［8］。另一種可能原因是白花前胡開始抽薹后，生長(zhǎng)中心是地上部分，植物光合作用產(chǎn)生的大部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)由根部轉(zhuǎn)移至地上部分，供給白花前胡葉和花器官的發(fā)育，這可能是早期抽薹現(xiàn)象的主要原因［9］。但由于受遺傳因素、生態(tài)因素等影響，致使同一時(shí)期白花前胡不同個(gè)體間營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)不相統(tǒng)一，白花前胡早臺(tái)是否發(fā)生已成為前胡藥材品質(zhì)形成的關(guān)鍵。本研究采用高效液相色譜法測(cè)定不同采收時(shí)期前胡甲素和乙素含量，探討不同采收期特別是抽薹開花對(duì)白花前胡甲素及乙素成分含量的影響，為明確白花前胡采收時(shí)期的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器

HPLC高效液相色譜儀（日本島津公司）；JE3002G型電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；JE303G型電子分析天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；101-4B電熱鼓風(fēng)干燥箱（余姚市星辰儀表廠）；1000C型粉碎機(jī)（永康市紅太陽機(jī)電有限公司）；F-030S型超聲波清洗器（福洋電器有限公司）。

1.2 試劑

白花前胡甲素（praeruptorin A，批號(hào)B20035~20 mg），白花前胡乙素（praeruptorin B，批號(hào)B20037~10 mg），所有對(duì)照品均購自上海源葉生物科技有限公司，甲醇為色譜純（上海麥克林生化科技有限公司），甲醇分析純（上海麥克林生化科技有限公司），三氯甲烷分析純（純度≥99.0，西隴科學(xué)股份有限公司）。

1.3 材料

試驗(yàn)所用白花前胡均采自于安徽省六安市金安區(qū)東河口栽培基地，土壤類型為水稻土，基原植物經(jīng)皖西學(xué)院韓邦興教授鑒定為傘形科植物白花前胡。分別于2019年3月~11月進(jìn)行樣品收集，約每隔15~30 d，取不同生長(zhǎng)年限、不同坡向生長(zhǎng)的樣品。采收其鮮根后洗凈泥土，除去須根，趁鮮切片。經(jīng)自然陰干后粉碎成粗粉，過3號(hào)篩后置于干燥器，密封保存。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 色譜條件

本試驗(yàn)采用的色譜柱為Inertsil-C18（5μm，250 nm×4.6 mm），以甲醇（A）-水（B）為流動(dòng)相，等度洗脫的程序如下：流動(dòng)相甲醇：水=75：25，流速1.0 mL/min，最大吸收檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為321 nm，進(jìn)樣體積10μL。理論塔板數(shù)按照白花前胡甲素計(jì)算應(yīng)不低于4 000。前胡甲素和乙素對(duì)照品及白花前胡不同年限、不同部位的HPLC圖譜結(jié)果見圖1。

圖1 白花前胡甲素與乙素標(biāo)準(zhǔn)品及前胡樣品HPLC圖譜Fig.1 The HPLCchromatograms of praeruptorin standards and P.praeruptorum Dunn samples

1.4.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取前胡甲素及前胡乙素適量，置100 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，搖勻，配置成甲素濃度0.343 ug/mL及乙素濃度0.340 ug/mL以100%甲醇為空白對(duì)照在321 nm處測(cè)定吸光值。

1.4.3 樣品溶液制備

稱取粉碎的白花前胡樣品約0.5 g，置具塞錐形瓶中，加入三氯甲烷25 mL，密塞，稱重，超聲處理（功率250 W，頻率33 kHz）10分鐘，放冷，再稱重，用三氯甲烷定容，搖勻，濾過；量取續(xù)濾液10 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至25 mL量瓶中。

1.4.4 線性關(guān)系的考察

量取白花前胡甲素和白花前胡乙素母液各1 mL分別放入5、10、25、100、250 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，即得梯度濃度混合對(duì)照品。吸取上述混合對(duì)照品溶液10μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以絕對(duì)含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸。

1.4.5 精密度試驗(yàn)按照供試品溶液的制備方法，在1.4.1項(xiàng)色譜條件下，進(jìn)樣10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。

1.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照供試品溶液的方法制備一份供試品溶液，在2.1色譜條件下，分別在4、8、12、16、20、24 h時(shí)進(jìn)樣，記錄峰面積。

1.4.7 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一批母前胡樣品6份，按照供試品溶液制備方法分別制備6份供試品溶液，在1.4.1項(xiàng)色譜條件下，進(jìn)樣10μL，分別記錄峰面積。

1.4.8 加樣回收試驗(yàn)

取母前胡樣品6份約0.5 g，分別加入白花前胡甲素和白花前胡乙素對(duì)照品適量，按照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，在1.4.1項(xiàng)色譜條件下，記錄峰面積。

1.4.9 樣品含量測(cè)定

稱取樣品粉末，按照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，在1.4.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定樣品中白花前胡甲素和白花前胡乙素含量，重復(fù)3次，結(jié)果取算術(shù)平均值。含量計(jì)算公式：m=c（樣品）/c（甲素或乙素）。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用方差分析、多重比較等統(tǒng)計(jì)方法對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，應(yīng)用SPSS 21.0等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理。

表2 白花前胡甲素和乙素回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Table 2 Regressive equations，correlation coefficients，linear ranges of praeruptorin A and B

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

如表3所示，重復(fù)性測(cè)定結(jié)果表明白花前胡甲素和白花前胡乙素峰面積的Relative standard devia?tion（RSD）分別是0.014%和0.032%，表明該儀器重復(fù)性良好?；貧w方程為：白花前胡甲素Y=1 701775.02x+1 574.10（r=0.999），線 性 范 圍0.002~5.15。白花前胡乙素Y=2 099 983.22x+6707.64（r=0.999），線性范圍0.002~5.09。白花前胡甲素和白花前胡乙素精密度的RSD，分別為0.009%和0.012%，結(jié)果見表4。供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，白花前胡甲素和白花前胡乙素的RSD，分別為0.014%和0.032%，結(jié)果見表5。加樣回收率為99.32%和98.58%，RSD分別為0.025%和0.012%，結(jié)果見表6。

表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 The repeatability experiment

表4 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 The precision experiment

表5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 The stability experiment

表6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 The sampling recovery experiment

2.2 色譜條件優(yōu)化

圖1 為利用已優(yōu)化的色譜條件進(jìn)行白花前胡對(duì)照品和樣品分析的結(jié)果?？梢钥闯觯谆ㄇ昂姿睾鸵宜貙?duì)照品色譜峰尖銳，對(duì)稱性較好。樣品中大多數(shù)色譜峰能夠基線分離，其中兩種對(duì)照品與其它雜質(zhì)的分離度較好，可用于后續(xù)定量的實(shí)驗(yàn)。

2.3 采收時(shí)期對(duì)前胡甲素和乙素含量的影響

如表7和圖2所示，對(duì)比前胡甲素和乙素含量，前胡甲素含量總體較高，前胡乙素含量總體較低。在14次采樣過程中，二年生的前胡含量高于一年生前胡，前胡甲素含量變化幅度較大，前胡乙素含量的變化幅度較小。前胡甲素含量在2019年3月30日（二年生）采樣時(shí)最高，含量約為1.067 2%；前胡乙素在2019年3月30日（二年生）采樣時(shí)含量最高，約為0.120 3%。

表7 不同采收期前胡甲素及前胡乙素含量Table 7 contents of imperatorin A and imperatorin Bin differ?ent harvest time

圖2 不同采收期前胡甲素及前胡乙素含量變化Fig.2 The contents of praeruptorin A and Bat different har?vest time

2.4 栽培環(huán)境對(duì)前胡甲素和乙素含量的影響

如表8和圖3所示，白花前胡甲素在不同坡向上的含量存在差異，南坡的白花前胡甲素含量約高于北坡、西坡及東坡的80%；而白花前胡乙素含量在不同坡向上差異較小。

圖3 不同坡向前胡甲素和乙素含量Fig.3 The content of praeruptorin A and Bin different slope directions

表8 前胡甲素和乙素含量在不同坡向的差異檢驗(yàn)Table 8 Difference test of praeruptorin A and Bcontents in dif?ferent slope directions

2.5 抽薹對(duì)前胡甲素和乙素含量的影響

由表9和圖4看出，在白花前胡甲素、乙素含量在抽薹前后的差異檢驗(yàn)中，白花前胡甲素和乙素含量在抽薹前后差異不顯著。

表9 前胡甲素和乙素含量在抽薹前后的差異檢驗(yàn)Table 9 Difference test of praeruptorin A and Bcontents during bolting

圖4 抽薹前后前胡甲素和乙素含量Fig.4 The content of praeruptorin A and Bbefore and after bolting

2.6 不同組織對(duì)前胡甲素和乙素含量的影響

如表10和圖5所示，前胡甲素、乙素含量在不同部位上的差異檢驗(yàn)中，根組織的前胡甲素含量約高于莖部和葉片的一倍。其中，前胡甲素在葉片的含量高于莖部的1.5倍，即前胡甲素含量在不同部位的順序從大到小為：根＞葉＞莖。根組織中的前胡乙素含量約高于莖部和葉片的1.5倍，葉片的乙素含量高于葉部3倍，即前胡乙素含量在不同部位的順序從大到小為：根＞葉＞莖。

表1 白花前胡樣品采收時(shí)間Table1 Sampling of P.praeruptorum Dunn time for collection

圖5 不同生長(zhǎng)部位前胡甲素和乙素含量Fig.5 Content of praeruptorin A and Bin different growth parts

表10 前胡甲素和乙素含量在不同部位上的差異檢驗(yàn)Table10 Difference test of praeruptorin A and Bcontents in different tissues

3 討論

3.1 不同采收期前胡甲素和乙素含量變化

不同的環(huán)境、氣候?qū)η昂幉闹邢愣顾仡惓煞值暮坑绊戄^大，包括土壤、溫度、濕度等因素［11］。白花前胡為兩年甚至多年生宿根植物，一般第一年進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，第二年抽薹開花進(jìn)行生殖生長(zhǎng)［12］。因此，在恰當(dāng)?shù)臅r(shí)期采收其根莖是保證前胡質(zhì)量和功效的前提。一般來說，前胡適于冬季至次春莖葉枯萎或未抽花莖時(shí)釆挖，此時(shí)的前胡甲素和乙素等香豆素成分含量最高。本實(shí)驗(yàn)中，二年生前胡第1次采收時(shí)，前胡甲素及乙素含量達(dá)到最大值；第1次采樣時(shí)含量最高，其他采樣點(diǎn)含量略低于二年生第1次，綜合考慮若采收二年生前胡藥材應(yīng)選取3月份時(shí)間點(diǎn)，采樣時(shí)間與文獻(xiàn)報(bào)道一致。前胡在第二年三月份采收時(shí)，前胡甲素和乙素含量最高，達(dá)到《藥典》規(guī)定的甲素及乙素含有量不少于0.9%和0.24%的標(biāo)準(zhǔn)，其余采樣點(diǎn)的樣品甲素及乙素含量均不達(dá)標(biāo)。

3.2 栽培因素（光照強(qiáng)度）前胡甲素和乙素含量變化

光照是影響植物生長(zhǎng)和生物量積累的重要因素之一。許多研究均表明，農(nóng)作物的生長(zhǎng)情況和產(chǎn)品品質(zhì)會(huì)隨著光照強(qiáng)度的變化而變化［13］。本實(shí)驗(yàn)的采集地位于安徽六安山區(qū)，處于北半球北緯31度。因此，位于南坡的前胡植株受到日照的時(shí)間最長(zhǎng)，其次是西坡和東坡。試驗(yàn)結(jié)果也表明，南坡的前胡甲素含量顯著高于北坡、西坡、東坡；南坡和西坡的前胡乙素含量也是較高的。此外，光照不僅對(duì)陰生植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)塑造具有重要的調(diào)控作用，對(duì)其內(nèi)在的生理生化效應(yīng)和次生代謝產(chǎn)物合成也有明顯的誘導(dǎo)效應(yīng)［14］。前胡作為半陰生草本植物，其香豆素活性成分的積累同樣受到光照的影響。長(zhǎng)日照能夠提高白花前胡香豆素及黃酮醇合成途徑關(guān)鍵酶基因PAL、4CL、F6’H、BMT、CYP450的表達(dá)水平，這可能是光強(qiáng)影響前胡有效成分積累的主要原因之一［15-17］。因此，在實(shí)際生產(chǎn)過程中，應(yīng)充分考慮光照對(duì)前胡藥用成分代謝的作用機(jī)制，以期定向篩選出適宜的光照培養(yǎng)條件。

3.3 抽薹與未抽薹前胡甲素和乙素含量變化

抽薹開花對(duì)傘形科藥材的根部木質(zhì)化及其藥用成分的積累都有顯著影響［16-18］。白花前胡的生長(zhǎng)周期為兩年，第1年進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，第2年進(jìn)行生殖生長(zhǎng)。進(jìn)入生殖生長(zhǎng)后，根部開始木質(zhì)化。因此，作為藥材生產(chǎn)的白花前胡只能當(dāng)年采收［19］。在第8次采樣點(diǎn)（7月19日）之后獲得的抽薹樣本逐漸增多，抽薹后前胡由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)迅速進(jìn)入生殖生長(zhǎng)，9月份以后植株不再長(zhǎng)高，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期根系發(fā)達(dá)，主根肉質(zhì)肥大。由于生態(tài)環(huán)境、生理?xiàng)l件等情況不同而使其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期和生殖生長(zhǎng)期的長(zhǎng)短不相統(tǒng)一。一般將營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段的前胡稱為“母前胡”，將生殖生長(zhǎng)階段的前胡稱為“公前胡”，母前胡質(zhì)地柔軟、氣味香濃品質(zhì)較好，公前胡質(zhì)地堅(jiān)硬、氣味較淡一般不做藥用，故有“雄前胡，須揀去勿用”的說法。前胡在野生狀態(tài)下可生長(zhǎng)多年以后才抽薹開花，而在栽培情況下，其個(gè)體發(fā)育時(shí)間大大縮短，一般在第2年抽薹開花，少部分甚至第1年就開始抽薹開花［20］。因此必須充分了解白花前胡生物學(xué)特性，闡明其抽薹開花的內(nèi)在規(guī)律，尋求既科學(xué)又經(jīng)濟(jì)的方法，使二年生變?yōu)槎嗄晟娱L(zhǎng)其開花時(shí)間，以保證根部藥材的采收質(zhì)量。

3.4 不同組織部位前胡甲素和乙素含量變化及轉(zhuǎn)化規(guī)律

本試驗(yàn)中前胡甲素、乙素含量在不同組織部位的差異明顯，根部前胡甲素含量顯著高于莖和葉片，其中前胡甲素在葉片的含量顯著高于莖部。前胡甲素含量在不同部位的順序從大到小為：根＞葉＞莖。根組織中的前胡乙素含量顯著高于莖部和葉片，葉片的乙素含量顯著高于莖部，前胡乙素含量在不同部位的順序從大到小為：根＞葉＞莖。由于香豆素類成分主要積累于前胡根中，其入藥部位也是根。有參考文獻(xiàn)研究表明，白花前胡甲素和白花前胡乙素在前胡早薹前后的比例發(fā)生顯著變化，早薹前后兩者的比例關(guān)系呈現(xiàn)一降一升的現(xiàn)象［21-22］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抽薹開花后根部的前胡甲素和乙素含量逐漸減少，關(guān)于前胡甲乙素是否存在根組織向地上部分的轉(zhuǎn)運(yùn)及其調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步地研究。