劉 杰，林茂祥，肖 忠，李 娟，張萬超，韓如剛，韓 鳳，2*

（1.重慶市藥物種植研究所，重慶南川408435；2.重慶市道地藥材規(guī)范化生產(chǎn)工程技術(shù)研究中心，重慶南川408435）

蒼術(shù)作為重要的植物藥主要以多年生菊科蒼術(shù)屬（Atractylodes）草本植物根莖入藥，在東亞地區(qū)被廣泛應(yīng)用。蒼術(shù)的主要藥用活性成分為揮發(fā)油，其中含量較高有蒼術(shù)酮、茅術(shù)醇、欖香油醇、β-桉葉醇等倍半萜類和蒼術(shù)素、蒼術(shù)素醇等聚乙炔類［1-2］。蒼術(shù)具有消炎止痛、治療風(fēng)濕、消化功能紊亂、急性腸炎、夜盲癥、流感、抗腫瘤等作用［3-7］，在新藥研發(fā)方面具有較大的潛能。蒼術(shù)不僅作為傳統(tǒng)大宗中藥材被收入中國國家藥典［8］，也被收入了日本藥典［9］。

在我國，茅蒼術(shù)［A.lancea（Thunb.）DC.］主產(chǎn)于江蘇、浙江、山東、江西、廣東、安徽、湖北、四川等地［10］。根部病害對茅蒼術(shù)種植業(yè)的威脅巨大，以根腐病和白絹病最為常見［11］。根腐病主要危害植物的根及根莖，使其腐爛，引起植物地上部分葉片變黃、植株萎蔫，直至枯死［12］。目前，根腐病尚無有效的根治措施，是中藥材栽培中最常見的毀滅性病害，已成為限制中藥材生產(chǎn)的一大障礙。此外，包括茅蒼術(shù)在內(nèi)的根莖類藥用植物在栽培中存在嚴(yán)重的自毒和連作障礙問題，生產(chǎn)上常表現(xiàn)為土壤理化性質(zhì)改變、土傳病害加重等［13］。土壤微生物和土壤酶活性均能敏感反映土壤生態(tài)系統(tǒng)的變化，表征土壤的健康水平。藥用植物微生物的豐度和多樣性對其產(chǎn)量和質(zhì)量有著重要影響，研究藥用植物和根際微生物的相互作用關(guān)系對藥用植物的發(fā)展具有重要的實(shí)踐和指導(dǎo)意義［14］。有關(guān)茅蒼術(shù)根際土壤養(yǎng)分含量、酶活性和微生物群落結(jié)構(gòu)對根腐病發(fā)生的影響尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以未種植茅蒼術(shù)土壤、茅蒼術(shù)健康植株和病株根際土壤為研究對象，對不同土壤的理化性質(zhì)、酶活性和細(xì)菌群落組成進(jìn)行對比分析，旨在探討土壤養(yǎng)分、酶活性和細(xì)菌群落的變化特征以及它們與根腐病之間的相互關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 根際土壤樣品的采集

土壤樣品于2019年7月16日采自茅蒼術(shù)種植試驗(yàn)地，位于三泉鎮(zhèn)馬嘴村（29°3′7.7′′N，107°18′26.4′′E），海拔1 130 m。采用多點(diǎn)式取樣法，分別采集從未種過茅蒼術(shù)的土壤（空白對照CZCK，距離茅蒼術(shù)種植地樣點(diǎn)50 m左右）、健康茅蒼術(shù)根際土壤（CZJ）和根腐病根際土壤（CZB）。除去茅蒼術(shù)根莖周圍表面土壤，拔起整株茅蒼術(shù)，去除、抖落茅蒼術(shù)主體土壤，收集須根2 mm范圍的土壤，此即為根際土壤。取后將土樣直接裝自封袋放入冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室后過2 mm篩，去除土壤中的須根和石礫，充分混勻。一部分用于土壤樣品DNA提取，一部分自然風(fēng)干后，用于測定土壤理化性質(zhì)和酶活性。

1.2 土壤理化性質(zhì)測定

參考鮑士旦［15］的方法分別測定土壤pH、有機(jī)質(zhì)、速效氮、速效磷和速效鉀含量。

1.3 土壤酶活性測定［15-16］

土壤中脲酶活性采用靛酚藍(lán)比色法測定；蔗糖酶采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定；酸性磷酸酶采用磷酸苯二鈉比色法測定；過氧化氫酶采用高錳酸鉀滴定法；酸性蛋白酶活性測定采用茚三酮比色法測定。

1.4 土壤根際細(xì)菌和真菌的高通量測序

土壤DNA使用MPFast@DNA試劑盒（MPBio?medicals，CA，USA）提取，按照試劑盒使用說明書進(jìn)行操作，提取不同土壤樣品的總DNA。采用北京普析TU-1810紫外分光光度計(jì)測定DNA質(zhì)量與濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性和相對濃度。以土壤總DNA為模板，細(xì)菌測定中，PCR擴(kuò)增所用引物采用細(xì)菌通用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGA CTACHVGGGTWTCT AAT-3′）對16SrRNA基因序列的V3-V4高變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增；真菌測定中，PCR擴(kuò)增所用引物為真菌ITS1引物ITS1F（5’-CTTG?GTCATT T AGAGGAAGTAA-3’）和ITS2R（5’-GCTG?C?GTTCTTCAT?CGA TGC-3’）對 真 菌ITS1 V3-V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用凝膠回收試劑盒對目標(biāo)片段進(jìn)行回收，將回收產(chǎn)物送至北京百邁克生物科技有限公司，利用Illumina Hiseq 2500平臺進(jìn)行高通量測序和分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

采用Qiime軟件對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行去雜和優(yōu)化，利用Upares軟件對相似度在97%水平以上的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析，并基于細(xì)菌的Silva數(shù)據(jù)庫和真菌的Unite數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計(jì)各樣本在不同分類學(xué)水平上的群落組成。利用Mothur軟件進(jìn)行土壤微生物α-多樣性指數(shù)分析，包括ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)、覆蓋率等；采用Excel 2010和SPSS18.0分別進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、作圖和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤養(yǎng)分

茅蒼術(shù)根際土壤養(yǎng)分變化結(jié)果見表1。三種土壤樣品在pH、有機(jī)質(zhì)、速效氮、速效磷和速效鉀等養(yǎng)分指標(biāo)均存在顯著差異（P＜0.05）。與CZCK相比較，種植茅蒼術(shù)后pH值逐漸降低，土壤逐漸酸化；CZB中有機(jī)質(zhì)和速效磷含量顯著增加，而CZJ中有機(jī)質(zhì)和速效磷含量減少；CZJ、CZB中速效磷的含量顯著升高（P＜0.05）；CZJ速效鉀含量顯著減少（P＜0.05），CZB速效鉀含量顯著增加（P＜0.05）。

2.2 土壤酶活性

三種土壤中所測酶活性均存在顯著差異（表2）。與CZCK相比，種植茅蒼術(shù)后土壤脲酶活性顯著降低了（P＜0.05）。而其余土壤酶活性則由于茅蒼術(shù)是否感染根腐病而顯著不同，與CZCK相比，CZJ過氧化氫酶、酸性磷酸酶和酸性蛋白酶活性顯著升高（P＜0.05），而蔗糖酶活性顯著降低（P＜0.05）；CZJ過氧化氫酶、酸性磷酸酶和酸性蛋白酶活性顯著下降（P＜0.05），則蔗糖酶顯著升高（P＜0.05）。

表2 土壤酶活性Table 2 Enzyme activity of soil

2.3 土壤微生物多樣性特征

采用Chaol指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)（表3）表征微生物的豐富度和群落多樣性。結(jié)果表明：茅蒼術(shù)健康植株根際土壤細(xì)菌OTU為1 529，豐富度最高；根腐病植株根際土壤細(xì)菌OTU為1 194，豐富度最低，兩者之間的細(xì)菌OTU相差21.9%，細(xì)菌豐富度差異較大。根際土壤真菌OTU為CZCK（482）＞CZJ（383）＞CZB（218），表明種植茅蒼術(shù)后，根際土壤真菌豐富度降低，而病株根際真菌進(jìn)一步降低。Chaol指數(shù)和ACE指數(shù)反映樣本中微生物豐富度，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映樣本中微生物的多樣性。Shannon值越大和Simpson指數(shù)值越小，均說明群落多樣性越高，反之亦然。本研究結(jié)果表明，茅蒼術(shù)健康植株根際土壤的細(xì)菌多樣性和豐富度均最高，而茅蒼術(shù)根腐病植株根際土壤細(xì)菌多樣性和豐富度均最低，而未種植茅蒼術(shù)土壤細(xì)菌多樣性則居于二者之間。真菌的多樣性和豐富度均呈現(xiàn)種植茅蒼術(shù)后降低，病株根際土壤進(jìn)一步降低的趨勢。Cov?erage指數(shù)是指各樣本文庫的覆蓋率，其數(shù)值越高，則樣本中序列被測出的概率越高。樣品的Coverage指數(shù)在細(xì)菌中大于0.996，在真菌中大于0.9 995，反映本次測序結(jié)果代表了樣本中微生物的真實(shí)情況。

表3 細(xì)菌和真菌群落Alpha多樣性指數(shù)Table 3 Alpha diversity indexesof bacterial and fungicommu?nity

由不同土壤樣品包含共有的微生物群落OTU數(shù)目生成的Venn圖直觀地展示樣品相同、各自特有OTU數(shù)目以及樣品間OTU的重疊情況（圖2）。CZB、CZCK和CZJ三組共產(chǎn)生4 141個(gè)細(xì)菌OTUs，其中，CZJ組樣品的OTUs最多，為1 529個(gè)；其次為CZCK組樣品，為1 418個(gè)；CZJ組的最少，為1 194個(gè)，說明種植茅蒼術(shù)后，土壤細(xì)菌種類增加，但感染根腐病后則細(xì)菌種類減少。三組土壤共有的OTUs數(shù)為1 046個(gè)，茅蒼術(shù)健康植株根際土壤有43個(gè)特有的OTUs，未種植茅蒼術(shù)土壤特有31個(gè)OTUs，而根腐病株根際土壤僅有23個(gè)特有的OTUs。CZB和CZCK共有13個(gè)OTUs，CZCK和CZJ共有328個(gè)OTUs，CZB和CZJ共有112個(gè)OTUs，兩種土壤環(huán)境中共同含有的OTU數(shù)量越多說明兩者的微生物群落組成相似度越高，以上數(shù)據(jù)說明CZCK和CZJ的細(xì)菌群落相似度較高。CZB和CZCK的細(xì)菌群落相似度較低，即與對照相比，根腐病蒼術(shù)根際土壤細(xì)菌群落組成變化較大。

圖1 不同土壤細(xì)菌和真菌群落OTUs Venn圖（a.細(xì)菌；b.真菌）Fig.1 OTUs Venn diagramof soil bacteria and fungicommunities in different soil

CZB、CZCK和CZJ三組共產(chǎn)生652個(gè)真菌OTUs。其中，CZCK組樣品的OTUs最多，為482個(gè)；其次為CZJ組樣品，為383個(gè)；CZB組的最少，為218個(gè)，說明種植茅蒼術(shù)后，真菌種類均有所下降，但感染根腐病后則真菌種類減少更多。三組土壤共有的OTUs為118個(gè)，茅蒼術(shù)健康植株土壤有137個(gè)特有的OTUs，未種植茅蒼術(shù)土壤特有179個(gè)OTUs，而根腐病病株土壤僅有23個(gè)特有的OTUs，表明染病植株導(dǎo)致其根際土壤真菌OTUs數(shù)目減少。CZB和CZCK共有67個(gè)OTUs，CZCK和CZJ共有118個(gè)OTUs，CZB和CZJ共有10個(gè)OTUs，說明CZB和CZJ的真菌群落相似度較高，CZCK與CZB及CZJ的真菌群落相似度較低，即與CZCK相比，種植茅蒼術(shù)后根際土壤真菌群落組成變化較大，而病株與健株之間的真菌群落變化相對較小。

2.4 基于門類水平的根際土壤優(yōu)勢微生物的多樣性分析

門水平下的細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)見表4。三類土壤的細(xì)菌有1.84%～4.98%的細(xì)菌（others）在GenBank中沒有被明確的分類。按照相對豐度從高到低排名前10的優(yōu)勢門類中，門的組成沒有變化，但各門的豐富度存在較大變化幅度。相對豐度超過2%的門類一共有10個(gè)，分別為變形菌門（Proteo?bacteria，33.93%～51.98%）、擬桿菌門（Bacteroide?tes，6.68%～20.82%）、酸 桿 菌 門（Acidobacteria，9.42%～25.27%）、放線菌門（Actinobacteria，3.13%～7.98%）、綠彎菌門（Chloroflexi，2.96%～8.33%）、疣微菌門（Verrucomicrobia，2.87%～6.17%）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes，2.78%～6.35%），厚壁菌門（Firmicutes，0.44%～3.03%）、己科河菌門（Rokubac?teria，0.58%～2.35%）和髕骨細(xì)菌門（Patescibacteria，0.55%～3.59%）。與CZCK相比，CZJ細(xì)菌在酸桿菌門、綠彎菌門和髕骨細(xì)菌門有較大幅度增加，但在擬桿菌門則有較大幅度的減少。CZB在變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門增加較多。但在其余7個(gè)門類豐富度均有較大幅度的降低。

表4 土壤中細(xì)菌和真菌的門水平分布Table 4 Phylum distribution of bacteria and fungiin different soil

在三種類型的土壤中，真菌相對豐度以子囊菌門（Ascomycota，38.89%～82.76%）、擔(dān)子菌門（Basid?iomycota，2.37%～13.68%）和被孢霉門（Mortierello?mycota，2.89%～49.04%）為主，均大于1%，而球囊菌門（Glomeromycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、毛霉門（Mucoromycota）、油壺菌門（Olpidiomycota）、GS01和捕蟲霉門（Zoopagomycota）相對豐度低。與CZCK和CZJ相比，CZB在子囊菌門和擔(dān)子菌門相對豐度增加顯著，而被孢霉門、球囊菌門和壺菌門有較大降幅。

2.5 基于屬水平的根際土壤優(yōu)勢微生物的多樣性分析

在屬水平上（表5），未鑒定出的細(xì)菌相對豐度為58.78%～74.90%。相對豐度排名前十的細(xì)菌而言，3個(gè)土壤樣品中細(xì)菌的組成沒有實(shí)質(zhì)性改變，但豐度存在較大幅度變化。具體來說，感病茅蒼術(shù)根際土壤在金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、新鞘氨醇桿 菌 屬（Novosphingobium）和Burkholderia-Cabal?leronia-Paraburkholderia3個(gè)屬較未種植茅蒼術(shù)和茅蒼術(shù)健株土壤有顯著的增加，而Bryobacter、uncul?tured_bacterium_f_Gemmatimonadaceae、RB41和un?cultured_bacterium_f_Microscillaceae則大幅度降低。此外，相較于CZCK，在種植茅蒼術(shù)后，Pseudomonas相對豐度增加，而病株土壤則出現(xiàn)明顯減少的趨勢。

表5 土壤中細(xì)菌和真菌的屬水平分布Table 5 Genusdistribution of bacteria and fungiin different soil

在屬水平上，三種類型的土壤中未鑒定出的真菌變化很大，CZCK、CZJ和CZB分別為60.31%、23.20%和7.75%。已鑒定的屬中，豐度排名在不同土壤之間也存在較大變化，CZB被孢霉屬（Mortierel?la）豐度降低，而踝節(jié)菌屬（Talaromyces）、鐮刀菌屬（Fusarium）、Tausonia、Tetracladium和木霉屬（Trich?oderma）增幅較大，青霉屬（Penicillium）相較于CZJ豐度也降低。阿太菌屬（Athelia）則為病株根際土壤所特有，且豐度排名第5，高達(dá)8.63%。值得注意的是，與CZCK相比，致病性較強(qiáng)的鐮刀菌屬真菌的豐度在種植茅蒼術(shù)后大幅度增加，健康植株根際土壤增幅達(dá)兩倍，根腐病病根植株根際土壤增幅達(dá)三倍之多。

3 討論

土壤理化性質(zhì)與酶活性和植物根際土壤微生物的變化密切相關(guān)。土壤酶能夠參與土壤各種生物化學(xué)反應(yīng)，與土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化能力密切相關(guān)［16］。一般而言，脲酶主要是促進(jìn)土壤中氮素的轉(zhuǎn)化；蔗糖酶可以降解蔗糖為果糖和葡萄糖，從而對土壤中碳素營養(yǎng)起著重要的作用；過氧化氫酶可以分解過氧化氫，從而減輕過氧化氫對植物的毒害；磷酸酶主要是促進(jìn)土壤中磷素的轉(zhuǎn)化；蛋白酶參與土壤中存在的氨基酸、蛋白質(zhì)等有機(jī)氮的轉(zhuǎn)化。本研究中，茅蒼術(shù)病株根際土壤有機(jī)質(zhì)、速效氮、速效磷和速效鉀含量，脲酶和磷酸酶活性顯著高于健株，這些結(jié)果表明病株根際土壤肥力相較于健株根際土壤肥力顯著增加。在西洋參根腐病根際土壤中，有機(jī)質(zhì)、速效氮、速效磷顯著增加［17］，而在黃連根腐病病株根際土壤速效磷、速效氮、蔗糖酶顯著高于健株根際土壤，過氧化氫酶顯著低于健株根際土壤［18］。另一方面，病株根際土壤pH和過氧化氫酶則顯著低于健株，意味著病株根際土壤面臨酸性和高氧化環(huán)境雙重脅迫。土壤pH調(diào)節(jié)土壤養(yǎng)分和改變土壤微生物多樣性的主要驅(qū)動(dòng)因子［19］。此外，病株土壤酸性磷酸酶和脲酶、蔗糖活性顯著下降，在三七根腐病研究中亦有報(bào)道［20］。總之，這些結(jié)果表明，土壤種植茅蒼術(shù)與否，健株和病株之間的營養(yǎng)物質(zhì)，可利用氮、磷、鉀等元素，以及土壤酶活性都與根腐病的發(fā)生密切相關(guān)。

土壤微生物對自然和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中植物的營養(yǎng)和健康狀況具有重要影響。在植物根腐病的研究中，比較健康植株和病株根際土壤微生物的多樣性和豐度組成往往是根腐病防控研究的首要步驟［17］。本研究中，茅蒼術(shù)感染根腐病后細(xì)菌和真菌的多樣性和豐度都迅速降低。在植物根腐病研究中，細(xì)菌和真菌多樣性的變化在不同的研究中結(jié)論不盡相同，如西洋參研究發(fā)現(xiàn)根腐病導(dǎo)致細(xì)菌多樣性增加而真菌多樣性減少［17］，但亦有相反的報(bào)道［21］，黃連根腐病的研究中則發(fā)現(xiàn)細(xì)菌多樣性顯著降低［18］，而真菌多樣性變化不顯著［22］。不一致的研究結(jié)果可能和土壤的類型、土壤理化性質(zhì)、氣候條件和耕作制度等因素有關(guān)。

本研究采用高通量測序技術(shù)對茅蒼術(shù)根際土壤群落進(jìn)行了多樣性分析。結(jié)果表明，茅蒼術(shù)健康植株和感病植株根際土壤細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化。土壤特異微生物如病原微生物和拮抗微生物的變化導(dǎo)致微生物群落不平衡，可能是誘發(fā)茅蒼術(shù)根腐病的主要原因。本研究中，鐮

刀菌屬（Fusarium）真菌豐度增幅較大，而阿太菌屬（Athelia）真菌則為病株根際土壤所特有，且豐度較大。另一方面，假單胞菌屬（Pseudomonas）細(xì)菌、被孢霉屬（Mortierella）和青霉屬（Penicilin）真菌豐度卻大幅度減少。鐮刀菌屬（Fusarium）病原菌能引發(fā)多數(shù)作物根腐病的發(fā)生，給作物生產(chǎn)帶來嚴(yán)重?fù)p失。在人參［23］和三七［24］根腐病土壤中均發(fā)現(xiàn)其豐度顯著增加，鐮刀菌通過抑制植物產(chǎn)生水楊酸的產(chǎn)量從而降低其抗病性，在北蒼術(shù)［25］接種鐮刀菌后，出現(xiàn)根腐病典型癥狀。阿太菌屬（Athelia）同樣會誘導(dǎo)植物根腐病的發(fā)生，研究發(fā)現(xiàn)阿太菌屬病原菌誘導(dǎo)了烏頭［26］、大豆［27］和豌豆［28］根腐病的發(fā)生。被孢霉屬（Mortierella）廣泛存在于溫帶和熱帶農(nóng)林系統(tǒng)根際土壤中，其可以通過產(chǎn)生抗生素和競爭養(yǎng)分，抑制多種土傳病原微生物的生長，對維持微生態(tài)平衡具有重要作用［29］。青霉屬（Penicilin）常常能夠激活多種植物防御信號，從而促進(jìn)植物生長［30-31］。在人參根腐病的研究中也發(fā)現(xiàn)，假單胞菌（Pseudomonas）和被孢霉可以作為優(yōu)良的根腐病拮抗菌進(jìn)行使用［32］。

4 結(jié)論

本研究中，茅蒼術(shù)感染根腐病后，根際土壤中的有機(jī)質(zhì)、速效氮、速效磷和速效鉀含量，脲酶和磷酸酶活性顯著高于健康植株；通過Illumina高通量測序分析明確了根腐病侵染對茅蒼術(shù)根際土壤真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的變化，被孢霉屬、青霉屬和假單胞菌屬豐度等病原微生物拮抗菌的減少，為致病菌如鐮刀菌屬和阿太菌屬的生長提供了空間，導(dǎo)致微生態(tài)平衡被打破，可能是誘發(fā)茅蒼術(shù)根腐病的主要原因。