付陽洋，楊 敏*，湯陸揚(yáng)，楊培昕，彭黔榮，謝有超

（1.貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，貴州貴陽550009；3.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴州貴陽550025）

無籽刺梨［RosesterilisS.D.Shi］，又名金刺梨、光枝刺梨等，系薔薇科薔薇屬多年生落葉叢生灌木。在貴州安順、興仁等地居多，是貴州省特有刺梨品種。因其果實(shí)成熟后，果皮刺脫落，種子敗育，被稱為無籽刺梨。無籽刺梨果實(shí)比普通刺梨果實(shí)稍小，但果肉占比大，可食率比高。此外，其果肉粗纖維不發(fā)達(dá)，風(fēng)味獨(dú)特，糖分含量比刺梨高13.3%，單寧含量比刺梨低71.7%，因此，無籽刺梨果實(shí)口感甜而不澀，更適合于風(fēng)味飲品的開發(fā)［1-3］。研究表明，無籽刺梨果肉還富含類黃酮、三萜、維生素和氨基酸等多種對(duì)人體有益的微量元素［4-5］，具有抗氧化、抗衰老和增強(qiáng)免疫力等功效［6］。

聚乳酸羥基乙酸共聚物（Poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）是由兩種單體乳酸和乙醇酸隨機(jī)聚合而成，其納米粒作為藥物載體，生物相容性好，具有良好的生物降解性，無刺激性，毒副作用小，經(jīng)酯鍵斷裂降解為乳酸和羥基乙酸，通過三羧酸循環(huán)被代謝為二氧化碳和水從體內(nèi)排出［7］。在降解時(shí)，PLGA納米粒表面會(huì)逐漸產(chǎn)生微孔，使藥物暴露在納米粒表面逐漸溶解釋放，達(dá)到長(zhǎng)效緩釋目的［8］。此外，PLGA作為最常用的生物相容性和生物可降解聚合物之一，具有良好的成囊和成膜的性能，被FDA批準(zhǔn)為最常用的納米材料之一，正式作為藥用輔料收錄進(jìn)美國(guó)藥典［9］。

到目前為止，有較多國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道將多糖包載于PLGA納米粒中，如Luo等［10］制備了山藥多糖PLGA納米粒，發(fā)現(xiàn)山藥多糖PLGA納米粒比游離山藥多糖更有效的促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖和觸發(fā)T淋巴細(xì)胞向T h細(xì)胞轉(zhuǎn)化。Wu sim an等［11］將A l h ag e蜂蜜多糖包封于PL GA納米粒中能夠有效的提高Alhage蜂蜜多糖的免疫效果。Gu等［12］將當(dāng)歸多糖封裝于PLGA納米粒中，與PLGA建立了一個(gè)納米粒藥物遞送系統(tǒng)，使當(dāng)歸多糖的免疫增強(qiáng)作用得到了顯著改善。但是，未見有關(guān)無籽刺梨多糖納米制劑的報(bào)道。故在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取使用較為廣泛的PLGA為納米載體，采用雙乳化溶劑蒸發(fā)法制備了無籽刺梨多糖PLGA納米粒，并以多糖包封率為考察指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面對(duì)制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。以期為刺梨多糖制劑的研發(fā)提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 試驗(yàn)儀器

紫外可見分光光度計(jì)（UV-5500PC，上海元析儀器有限公司）；電子天平（BSM220.4，上海精卓電子天平有限公司）；電熱鼓風(fēng)干（101-2AB，天津泰斯特儀器有限公司）；離心機(jī)（Cence@H1650R，湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；一體式超純水系統(tǒng)（PF1XXXXM1，上海威立雅水處理技術(shù)有限公司）；超聲波清洗器（SY-180，上海寧商超聲儀器有限公司）；激光粒度儀（NanoBrook Omni，美國(guó)布魯克海文儀器公司）；高分辨率透射電子顯微鏡（JEM-2100（UHR），日本電子株式會(huì)社儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)藥材與試劑

PLGA（上海源葉生物技術(shù)有限公司）；無籽刺梨（貴州省盤縣）；泊洛沙姆P188（貴陽四面體化工有限公司）；丙酮（貴陽四面體化工有限公司）；所有化學(xué)品和試劑均為分析級(jí)。

2 方法

2.1 納米粒的制備

采用雙乳化-溶劑蒸發(fā)法［10］制備載藥納米粒和空白納米粒：首先將多糖溶解到去離子水中（20 mg/mL），形成W1。再將PLGA分散到丙酮中得到O，通過超聲作用將W1乳化到O中，超聲功率為130 W，超聲時(shí)間2 s、間隔時(shí)間3 s，形成PE。制備0.7%（W/V）的P188溶液，得到W2。在超聲功率為150 W，超聲時(shí)間2 s、間隔時(shí)間3 s作用下，將PE乳化到W2中，得到水包油包水（W/OW）的多糖納米乳液。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在56℃下，旋蒸除去粗納米乳液中殘留的有機(jī)溶劑。隨后通過以3500 r/min離心10 min，在上清液中收集多糖PLGA納米粒。采用同樣方法制備內(nèi)水相中不含多糖的空白PLGA納米粒。

2.2 包封率和載藥量的測(cè)定

采用低溫高速離心法測(cè)定包封率（Encapsula?tion efficiency，EE）和載藥量（Drug loading，DL）。在4℃下以12000 r/min離心30 min分離納米粒和游離多糖，在上清液中通過硫酸-苯酚法測(cè)定游離多糖的含量［11］。將收集的多糖PLGA納米乳液冷凍干燥，計(jì)算納米粒的總質(zhì)量。多糖EE計(jì)算如公式（1）所示，DL計(jì)算如公式（2）所示。

(1)EE%=[(總藥量-游離藥物量)/總藥量]×100%

(2)DL%=[(總藥量-游離藥物量)/納米?？偭縘×100%

2.3 單因素試驗(yàn)

考察了四個(gè)單因素：內(nèi)水相W1與有機(jī)相O的體積比、初級(jí)乳PE與外水相W2的體積比、泊洛沙姆P188的濃度和PLGA濃度對(duì)多糖PLGA納米粒包封率的影響。

2.4 優(yōu)化設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件程序，根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法，以內(nèi)水相W1與有機(jī)相O的體積比（X1）、初級(jí)乳PE與外水相W2的體積比（X2）、泊洛沙姆P188的濃度（X3）為自變量，以多糖PLGA納米粒的包封率為響應(yīng)值，通過響應(yīng)曲面分析（Response Surface Analysis，RSA），對(duì)納米粒的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平編碼表Table 1 Response surface analysis factors and levels coding table

2.5 多糖PLGA納米粒的表征

利用透射電鏡觀察了納米粒子的形貌。將多糖PLGA納米粒凍干粉用蒸餾水溶解稀釋，置于銅網(wǎng)上，磷鎢酸染色后，透射電鏡觀察其形態(tài)特征［13］；利用激光粒度分析儀測(cè)定多糖PLGA納米粒和空白納米粒的粒徑、粒度分布和Zeta電位。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

通過單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)水相W1與有機(jī)相O的體積比、初級(jí)乳PE與外水相W2的體積比和P188的濃度對(duì)多糖PLGA納米粒的包封率影響較大，而PLGA的濃度對(duì)其包封率影響甚微。四個(gè)因素對(duì)包封率的影響如下所述。

3.1.1 內(nèi)水相W1與有機(jī)相O的體積比對(duì)多糖PLGA納米粒的包封率的影響

固定初級(jí)乳PE與外水相W2的體積比1：9和P188的濃度0.7%。如圖1所示，當(dāng)內(nèi)水相W1與有機(jī)相O的體積比為1：8時(shí)，包封率有最大值，且隨著有機(jī)相O體積增大時(shí)，包封率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。

圖1 內(nèi)水相W1與有機(jī)相O的體積比對(duì)多糖PLGA納米粒的包封率的影響Fig.1 The influence of the volume ratio of internal water phase W1 to organic phase Oon the encapsulation efficiency of polysac?charide PLGA nanoparticles

3.1.2 初級(jí)乳PE與外水相W2的體積比對(duì)多糖PLGA納米粒的包封率的影響

固定內(nèi)水相W1與有機(jī)相O的體積比1：10和P188的濃度0.7%。如圖2所示，當(dāng)初級(jí)乳PE與外水相W2的體積比為1：8時(shí)，包封率有最大值，隨后包封率逐漸下降。

圖2 初級(jí)乳PE與外水相W2的體積比對(duì)多糖PLGA納米粒的包封率的影響Fig.2 The influence of the volume ratio of the primary milk PEto the outer water phase W2 on the encapsulation efficien?cy of polysaccharide PLGA nanoparticles

3.1.3 P188的濃度對(duì)多糖PLGA納米粒包封率的影響

固定內(nèi)水相W1與有機(jī)相O的體積比1：10和初級(jí)乳PE與外水相W2的體積比1：9。如圖3所示，隨著P188濃度的增大，包封率逐漸下降，且在P188濃度為0.3%時(shí)包封率最大。

圖3 P188的濃度對(duì)多糖PLGA納米粒的包封率的影響Fig.3 The effect of P188 concentration on the encapsulation efficiency of polysaccharide PLGA nanoparticles

3.1.4 PLGA的濃度對(duì)多糖PLGA納米粒包封率的影響

固定內(nèi)水相W1與有機(jī)相O的體積比1：10、初級(jí)乳PE與外水相W2的體積比1：9和P188濃度0.7%。如圖4所示，PLGA濃度的改變對(duì)包封率的影響甚微。

圖4 PLGA的濃度對(duì)多糖PLGA納米粒的包封率的影響Fig.4 The effect of PLGA concentration on the encapsulation efficiency of polysaccharide PLGA nanoparticles

3.2 優(yōu)化設(shè)計(jì)

3.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行了17組實(shí)驗(yàn)，其中5組中心點(diǎn)重復(fù)，結(jié)果見表2。利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合及對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA分析，試驗(yàn)結(jié)果表明，RSSPLGA NPs的包封率與因素X1、X2和X3的二次多項(xiàng)回歸方程為：

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果Table 2 Experimental design and its results

該模型和模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果如表3所示?？芍?，模型F=10.51，P＜0.01，極顯著，失擬項(xiàng)為P=0.3293（P＞0.05），不顯著，決定系數(shù)R2=0.9311，模型校正系數(shù)R2Adj=0.8425，說明本試驗(yàn)所選用的二次方程模型具有較高的顯著性，可用于預(yù)測(cè)多糖PLGA納米粒的制備工藝。由表3可知，各因素中一次項(xiàng)X3對(duì)多糖包封率線性效應(yīng)顯著（P＜0.05），二次項(xiàng)中X12、X22是顯著（P＜0.05）。此外，由F值知，各因素對(duì)無籽刺梨多糖包封率影響為X3＞X1＞X2。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 ANOVA of regression models

3.2.2 響應(yīng)面的優(yōu)化與預(yù)測(cè)

利用Design-Expert 8.0.6軟件繪制2個(gè)因素的交互作用對(duì)多糖PLGA納米粒包封率影響的響應(yīng)面及等高線，結(jié)果如圖5所示。可知，因素X3對(duì)多糖PLGA納米粒包封率的影響最為顯著，其3D曲線最陡峭，其次為因素X1，最后是因素X2。再次，P188濃度與包封率呈反比關(guān)系，P188濃度減少，包封率增加，符合單因素試驗(yàn)結(jié)果。而內(nèi)水相W1與有機(jī)相O的體積比和初級(jí)乳PE與外水相W2的體積比對(duì)包封率的影響為先增加后下降的趨勢(shì)，因此，該兩因素需選擇在合理范圍內(nèi)。最后，由響應(yīng)面法優(yōu)化出多糖PLGA納米粒最佳制備工藝條件，即X1=1：8.36，X2=1：7.07，X3=0.12%（W/V），在此參數(shù)下預(yù)測(cè)多糖PLGA納米粒包封率為97.32%。

圖5 各因素交互作用對(duì)多糖PLGA納米粒包封率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface plot and contour plot of the influence of the interaction of various factors on the encapsulation rate of polysac?charide PLGA nanoparticles

3.2.3 工藝驗(yàn)證

結(jié)合實(shí)際操作，將優(yōu)化后的工藝參數(shù)調(diào)整為內(nèi)水相W1：有機(jī)相O的比例為1：8，初級(jí)乳PE和外水相W2的比例為1：7，泊洛沙姆P188的濃度為：0.10%（W/V），重復(fù)3次的包封率分別為95.10%、96.02%、94.12%，平均包封率為95.08%，相對(duì)誤差為2.31%，實(shí)際值與預(yù)測(cè)值基本吻合，表明了模型對(duì)多糖PLGA納米粒制備工藝條件優(yōu)化的可行性與準(zhǔn)確性。

3.3 多糖PLGA納米粒的表征

多糖PLGA納米粒和空白PLGA納米粒的透射電鏡圖如圖6所示。由圖知，多糖PLGA納米粒和空白PLGA納米粒均為近似球形，具有較光滑的表面，且為尺寸均勻的顆粒。此時(shí)，兩種納米粒子粒徑相近約為110 nm。

圖6 多糖PLGA納米粒（A）和空白PLGA納米粒（B）的透射電鏡圖Fig.6 TEM images of polysaccharide PLGA nanoparticles（A）and blank PLGA nanoparticles（B）

多糖PLGA納米粒和空白PLGA納米粒粒徑大小與分布如圖7所示，其平均粒徑、多分散系數(shù)和Zeta電位如表4所示。由表知，載藥后的納米粒子粒徑略微增大，多分散系數(shù)降低，且Zeta電位絕對(duì)值有所提高，表明整個(gè)體系更加趨于均勻與穩(wěn)定。此外，由透射電鏡與激光粒度儀所得納米粒粒徑有一定差別，透射電鏡測(cè)得粒徑約為110 nm，激光粒度儀測(cè)得粒徑約為220 nm。這是由于兩種測(cè)試方式的區(qū)別造成的，透射電鏡是對(duì)納米粒進(jìn)行脫水處理，而激光粒度儀分析的納米粒為水合的［10］。

圖7 多糖PLGA納米粒（A）和空白PLGA納米粒（B）的粒徑分布圖Fig.7 The particle size distribution of polysaccharide PLGA nanoparticles（A）and blank PLGA nanoparticles（B）

表4 多糖PLGA納米粒和空白PLGA納米粒的粒徑、多分散系數(shù)和Zeta電位值Table 4 Particle size，polydispersity coefficient and Zeta po?tential of polysaccharide PLGA nanoparticles and blank PLGA nanoparticles

4 結(jié)論

植物多糖是天然的高分子聚合物，具有多種生物活性，如抗氧化、抗腫瘤、防治糖尿病和降血脂等［14-17］，而多糖納米制劑的開發(fā)不僅能提高其穩(wěn)定性和生物利用度，還具有靶向性好、生物相容性高的優(yōu)勢(shì)［18］。因此，選取無籽刺梨多糖為原料，通過雙乳化溶劑蒸發(fā)法制備了多糖PLGA納米粒。在單因素的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對(duì)工藝條件優(yōu)化，得到其制備工藝參數(shù)為內(nèi)水相W1和有機(jī)相O的比例為1：8，初級(jí)乳PE和外水相W2的比例為1：7，泊洛沙姆P188的濃度為0.1%（W/V）。在該工藝條件下，多糖PLGA納米粒呈粒徑均勻的球形，表面較光滑，包封率高。以空白納米粒作為對(duì)比，發(fā)現(xiàn)多糖PLGA納米粒較空白PLGA納米粒粒徑有所增大，多分散系數(shù)減小、Zeta電位絕對(duì)值增大，表明多糖PLGA納米粒體系更加趨于穩(wěn)定。通過對(duì)無籽刺梨多糖PLGA納米粒的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化與表征，以期為無籽刺梨多糖納米制劑的研發(fā)與規(guī)?；苽涮峁?shí)驗(yàn)參考。